氢氧化钠对苏云金芽孢杆菌芽孢及其萌发的影响
苏云金芽孢杆菌生物杀虫剂发酵生产的影响因素及其工艺选择
苏云金芽孢杆菌生物杀虫剂发酵生产的影响因素及其工艺选择常明;孙启宏;周顺桂;倪晋仁【期刊名称】《生态环境学报》【年(卷),期】2010(026)006【摘要】化学杀虫剂的长期使用给生态环境造成了严重破坏,也使害虫种群的抗药性日益提高,生物杀虫剂以其"绿色环保"的特点引起人们的广泛关注.其中,苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)制剂是目前世界上产最最大、应用最广的生物杀虫剂.它对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、螨类等许多有害昆虫有毒杀作用,而对人类、动物和农作物无害.长期以来,人们一直致力于苏云金芽孢杆菌发酵过程的研究.以期获得高毒效的生物杀虫剂产品.本文首先对苏云金芽孢杆菌发酵生产的各种影响因素进行了综合分析.将影响因素分为培养条件和培养基组分两类.得出最佳培养条件为温度:(30±1)℃,pH:7.0±0.1,搅拌速度:400～600 r·min-1,通气量:1:0.6～1.2(发酵培养基体积与每分钟通入空气的体积之比).接种时间:对数期初;最佳培养基配比为碳氮比:8～10:1,无机盐含量:KH2PO4或K2HPO4为0.075%～0.2%;MgS04·7H2O为0.075%～0.3%;CaCO3为0.075%～0.15%;MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O各为0.002%.其次,对当前研究与工业化生产中的各种发酵工艺进行了评述,总结了现有发酵工艺的优缺点.在现有研究基础上,降低培养基原料成本、改进发酵工艺和采用基因学手段构建高效工程菌株将成为未来研究热点.【总页数】7页(P1471-1477)【作者】常明;孙启宏;周顺桂;倪晋仁【作者单位】中国环境科学研究院,北京100012;北京大学环境工程系//教育部水沙科学重点实验室,北京100871;中国环境科学研究院,北京100012;广东省农业环境综合治理重点实验室//广东省生态环境与土壤研究所,广州510650;广东省农业环境综合治理重点实验室//广东省生态环境与土壤研究所,广州510650;北京大学环境工程系//教育部水沙科学重点实验室,北京100871【正文语种】中文【中图分类】X172【相关文献】1.利用黄水发酵生产生物发酵液的工艺研究 [J], 柴玉强;张宿义;霍丹群;侯长军;郑伟;敖宗华;秦辉2.生物发酵丙酸钙生产150m3发酵罐放大工艺摸索 [J], 徐艳力;3.利用味精废水生产苏云金芽孢杆菌生物农药Ⅱ:苏云金芽孢杆菌的菌种筛选及发酵优化 [J], 周晓兰;郑毅;邓春梅;余敏忠;林建华4.双菌株发酵生产苏云金杆菌生物杀虫剂的研究 [J], 李风萍;鲁玉峰5.餐饮废弃物生产微生物蛋白饲料发酵工艺的研究——发酵辅料的最适添加比例研究 [J], 孙时军;朱顺娣;李俊婷;赵陈锋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
芽孢杆菌属
第一、芽孢杆菌属的分类一、芽孢杆菌属微生物特性芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，需氧或兼性厌氧，产生芽孢，大多数无荚膜，以周生鞭毛运动。
细胞呈直杆状，常以成对或链状排列，具圆端或方端。
由于芽孢杆菌属的微生物能够形成芽孢的特性使得他们能够抵抗各种极端环境如高温、极酸、极盐，而且对各种杀菌剂具有抵抗力，因此，他们在各种自然环境中都能被分离到。
芽孢杆菌属微生物具有共同的特性，都能够形成带有芽孢的生物膜，且代谢产物相似，都能产生环肽、抗生素、酸（多聚谷氨酸、聚天冬氨酸）和聚多糖等。
二、芽孢杆菌的分类方法分类学是研究生物分类的原理、方法和实践的科学，包括分类、命名、描述和鉴定等内容。
目前细菌分类主要是采取多项分类技术。
多项分类的概念是Colwell于1968年提出的，原理是利用微生物多种不同的信息，包括表型、基因型和系统发育的信息，综合起来研究微生物分类和系统进化的过程。
概括的讲，多项分类是传统的表型分类、数值分类和分子分类等方法的综合应用，因而可以更客观地反映生物间的系统进化关系。
目前，多项分类法被认为是研究各级分类最有效的手段，可用于所有水平上分类单位的描述和定义。
2、1经典分类（表型特征）表型是由于基因和环境因素相互作用引起的，在细胞、器官和整体水平上能检测和观察到的特征。
一般，原核生物的表型特征能区分不同菌种但不能区分菌株。
表型特征包括形态学特征、生理生化特征、抗生素的敏感性、噬菌体分型、血清学分析。
表型特征虽然不能说明物种之间的亲缘关系，但它却是人们认识微生物实际重要性和研究生物进化的基础，仍然是分类研究的基础。
芽孢杆菌，菌体杆状，直或近直，0.3~2.2×2.1~7.0um,多数运动，鞭毛典型侧生，形成抗热内生孢子，严格好氧或兼性厌氧。
由于实验条件的限制，传统芽孢杆菌的分类主要是根据形态学特征即好氧或厌氧和有无芽孢形成。
Gibson和Gorden依据芽孢的形状（卵形或球形）以及它们在菌体或芽孢囊中的位置，提出芽孢形态群体概念，将芽孢杆菌分为三个类群。
苏云金杆菌的研究
2、样本和数据采集
考虑到苏云金杆菌的应用范围广泛，我们从农业领域相关的研究论文、专利 和书籍中搜集了关于苏云金杆菌的样本和数据。数据采集包括苏云金杆菌的菌种、 施用方法、防治对象、防治效果等方面的信息。
3、数据分析
对搜集到的样本和数据进行筛选、整理和分析。采用定量和定性相结合的方 法，对苏云金杆菌的耐药性、应用效果等方面进行深入研究。并运用表格、图表 等形式展示相关数据和结果。
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苏云金杆菌的研究
01 引言
03 研究方法
目录
02 研究现状 04 研究成果
引言
苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌， 广泛应用于农业中作为生物防治手段，对多种害虫具有高效的防治效果。本次演 示将探讨苏云金杆菌的研究现状和应用，首先概述苏云金杆菌的分类和特征，然 后介绍苏云金杆菌在农业中的应用及研究现状，并探讨相关研究方法。最后，将 总结苏云金杆菌的研究成果和发现，指出研究的不足之处，并展望未来的研究方 向。
研究成果
1、苏云金杆菌对农业的影响
苏云金杆菌作为一种生物防治手段，在农业中具有广泛的应用。其对农业的 主要影响表现在以下几个方面：
（1）高效防治害虫：苏云金杆菌对多种农业害虫具有高效的防治效果，特 别是对鳞翅目、膜翅目和鞘翅目等害虫有很好的防治效果。
（2）减少化学农药的使用：施用苏云金杆菌可有效减少化学农药的使用量， 降低环境污染。
3、苏云金杆菌在农业中的应用 及研究现状
苏云金杆菌作为一种生物防治手段，在农业中广泛应用于防治各种鳞翅目、 膜翅目和鞘翅目等害虫。目前，针对苏云金杆菌在农业中的应用研究主要集中于 以下几个方面：
（1）优化施用方法：研究苏云金杆菌的最佳施用时间和方法，以提高其对 害虫的防治效果和减少对非靶标生物的影响。
苏云金芽孢杆菌毒素的生产
分离、发酵、 分离、发酵、纯化技术
B.t.分离技术主要有以下几种： 分离技术主要有以下几种： 分离技术主要有以下几种 土壤分离技术 ：温度筛选、 利用醋酸钠进行 选择筛选 、弹土分离法、 抗生素选择性筛选 从植物中分离B.t. 从植物中分离
温度筛选
B.t.的芽孢因为中皮层主要成分为肽聚糖和形 成过程中产生大量DPA-Ca螯合物而具有耐热 性，在80℃下热处理20min也不会死亡，在 75℃的亚致死温度下处理15min可以提高其成 活率。利用这一特性，可以进行温度筛选。温 度筛选范围广，不易漏筛，但是工作量大且B.t. 要达到一定浓度。
ICPs纯品的制备 纯品的制备
ICPs纯品的制备： 目前纯品的制备方法主 纯品的制备： 纯品的制备
要有等密度梯度离心法、液体双向分离法、等 电点沉淀法、离子交换分离法、碱裂解法、高 速离心法、生物物理法等。
等密度梯度离心法
等密度梯度离心法是利用密度的差异将伴孢晶体与杂 质分离，从而获得纯品。 其常用的密度试剂有蔗糖 、人工聚合蔗糖、碱金属盐 (CsC1、NaBr)、碘化密度梯度介质等 溴化钠密度梯度离心纯化实验步骤： 溴化钠密度梯度离心纯化实验步骤：配制密度不同的溴化
固态发酵
固态发酵是B.t.生物农药生产的一种新方式。相较于液 体发酵，具有培养基对环境污染少、易处理，能源消 耗量低，技术设备简易，产物浓度高，后处理方便等 优点。作为一项新型技术，固态发酵还存在着很大的 发展空间。 无论是液体发酵还是固态发酵，都需注意培养基中营 养物质、pH、温度、含氧量的控制。对于B.t.的发酵 生产，还需注意噬菌体的长期污染会降低产量。
生产上的应用
B.t.菌生物农药制剂防治农业害虫 菌生物农药制剂防治农业害虫 将B.t.的ICPs基因转入其他物种获得抗虫植物 的 基因转入其他物种获得抗虫植物
温度预处理对苏云芽孢杆菌萌发的影响
20(2)127-130 中国生物防治 Chinese Journal of Biological Control 2004年5月温度预处理对苏云金杆菌芽孢萌发的影响陈国华1,2,冯书亮13,曹伟平1,王容燕1,王勤英2,李国勋2(1.河北省农林科学院植保所,保定 071000;2.河北农业大学植保学院,保定 071001)摘要:研究了不同温度预处理对苏云金杆菌芽孢萌发的影响。
结果表明:HD21、HB22菌株的孢子悬液经65～85℃活化处理15min,芽孢的萌发率在95%以上,100℃活化处理15min,萌发率则低于20%;孢子悬液在30～60℃区间内处理不同时间,结果以活化处理30min萌发率最高,而在70～80℃条件下,活化处理15min,萌发率最高;孢子悬液经高温→低温和低温→高温交替处理,萌发率变化较大。
关 键 词:温度;苏云金芽孢杆菌;芽孢;萌发率中图分类号:S476.11 文献标识码:A 文章编号:100529261(2004)022*******E ffect of T emperature on G ermination of Bacill us t huringiensis SporesCHEN Guo2hua,FEN G Shu2liang,CAO Wei2ping,WAN G Rong2yan,WAN G Qin2ying,L I Guo2xun(Inst.of Plant Protection,Hebei Academy of Agr.and Forestry Sci.,Baoding071000,China) Abstract:Studied on the effect of temperature on the germination of B acill us thuri ngiensis spores revealed that when the suspension of HD21,HB22strains were treated by65-85℃for15min, germination rate of spores can reach more than95%,while treated by100℃for15min,the ger2 mination rate was below than20%.Treatement by under60℃for30min,and beyond70℃for 15min have rise to highest germination rate.When the suspension of HD21,HB22strains were treated by high temperature and low temperature alternatively,the rate of germination varied quite significantly.K ey w ords:B acill us thuri ngiensis;temperature;spore;the rate of germination 苏云金杆菌(B acill us thuri ngiensis,Bt)是目前应用最广泛的微生物杀虫剂。
苏云金芽孢杆菌杀虫剂作用机理及应用
苏云金芽孢杆菌杀虫剂作用机理及应用一、苏云金芽孢杆菌杀虫作用机理1、苏云金杆菌致病机理苏云金杆菌对昆虫的致病作用是通过它所产生的毒素和芽孢而引起的。
一般是伴孢晶体的毒素使昆虫发生毒血症而死亡，由于晶体毒素对昆虫中肠上皮有破坏作用，使肠壁受损，中肠的碱性、高渗内含物进入昆虫血腔，使血液pH升高导致染病幼虫麻痹而死亡。
而芽孢是在肠道中萌发为菌体通过由晶体毒素破坏的中肠肠壁进入血腔，菌体在血腔中进行繁殖从而引起昆虫败血症的发生，造成染病昆虫的死亡。
而β-外毒素是RNA聚合酶的竞争抑制剂，可干扰昆虫有关激素的合成，从而导致幼虫发育畸形或不能正常化蛹。
苏云金芽孢杆菌虽然有较强的杀虫能力，但它必须经吞食过程进入体内才能杀死昆虫。
因此，在实际应用中，将其与吸引昆虫的物质一起喷洒，可以增加昆虫吞食的可能性。
二、苏云金芽孢杆菌在害虫防治上的应用苏云金芽孢杆菌类的各变种对鳞翅目、膜翅目、直翅目、双翅目、鞘翅目等350余种昆虫有不同程度的防治效果，但主要应用于防治下列害虫。
1、经济作物类棉铃虫，红铃虫，造桥虫，烟青虫。
2、蔬菜类菜青虫，小菜蛾，菜螟。
3、粮食作物类二化螟，三化螟，稻苞虫，稻纵卷叶螟，玉米螟等。
4、果树类松毛虫，桃小食心虫，尺蠖，大袋蛾，卷叶蛾等。
三、苏云金芽孢杆菌的使用方法苏云金芽孢杆菌杀虫剂效果对虫龄越小防治效果越好，使用时必须掌握好时机和用量。
苏云金芽孢杆菌农药药效较慢，一般害虫进食30min后停止为害作物，24h开始死亡，48h达到死亡高峰，72h死亡率达95%以上。
1、单用喷粉，喷雾均可。
2、混用为提高药剂的防治效果，特别是在害虫大发生和多种害虫混合发生时，可与非碱性的杀虫双、杀虫单、甲胺磷、三唑磷等常用化学杀虫剂混用，作用互补，效果更佳。
但必须现配现用，最好不和其他杀菌剂混用，以免影响防治效果。
3、与其他生物农药混用可与白僵菌，小菜蛾GV等混用。
四、苏云金芽泡杆菌使用注意事项：1、温度使用苏云金芽孢杆菌制剂的适宜温度在25℃以上，温度过低完全失去杀虫作用：在25～30℃时使用，其防治效果比10～15℃时高出1～2倍，温度低于20℃时最好不使用。
抗生素类作为防腐剂对苏云金杆菌芽孢及伴胞晶体的影响
抗生素类作为防腐剂对苏云金杆菌芽孢及伴胞晶体的影响曹伟平;冯书亮;杨更亮;范秀华;王容燕【期刊名称】《微生物学通报》【年(卷),期】2002(029)006【摘要】报道了14种抗生素作为防腐剂对苏云金杆菌CH菌株芽孢萌发的抑制作用和对伴胞晶体的影响.结果表明,红霉素、盐酸环丙沙星对CH菌株芽孢萌发有较强的抑制作用,在0.5μg/mL低剂量下可抑制芽孢的萌发;氧氟沙星和麦迪霉素抑制作用稍差,在5μg/mL的剂量下抑制作用随时间延长而减弱,96h后基本丧失抑制作用.其它几种抗生素对苏云金杆菌芽孢萌发的抑制终浓度均在30μg/mL以上;SDS-PAGE分析和生物测定表明,红霉素、盐酸环丙沙、氧氟沙星和麦迪霉素对伴胞晶体均无明显损伤作用,其中氧氟沙星45oC条件下放置4d,发酵液毒力保持率为96.2%.【总页数】6页(P46-51)【作者】曹伟平;冯书亮;杨更亮;范秀华;王容燕【作者单位】河北省农林科学院植物保护研究所,保定,071000;河北省农林科学院植物保护研究所,保定,071000;河北大学化学与环境科学学院,保定,071002;河北省农林科学院植物保护研究所,保定,071000;河北省农林科学院植物保护研究所,保定,071000【正文语种】中文【中图分类】Q93【相关文献】1.利用HPLC测定二硫苏糖醇(DTT)对苏云金芽孢杆菌伴胞晶体降解的影响 [J], 朱育菁;刘波;C.SENGONCA2.谷氨酸对苏云金杆菌的芽孢和伴孢晶体的影响 [J], 郭尽力;任万衷;林剑;徐世艾3.苏云金杆菌187菌株伴孢晶体和芽孢的电镜观察 [J], 汪耀南;王绍武4.苏云金杆菌伴胞晶体蛋白基因工程菌制剂及转基因抗虫植物遗传工程的研究应用进展 [J], 王伟新;吴中华5.化学杀虫剂对苏云金杆菌芽孢及伴胞晶体的影响 [J], 曹伟平;冯书亮;范秀华;王容燕;杨更亮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
产细菌素苏云金芽孢杆菌的鉴定及其所产抗菌物质性质
※生物工程食品科学2010, Vol. 31, No. 11147产细菌素苏云金芽孢杆菌的鉴定及其所产 抗菌物质性质李 云，杨胜远 * ，林晓东，钟瑜红，苏 婷，刘湘嘉(韩山师范学院生物系食品与发酵工程研究所，广东 潮州 摘 521041)要：从腌制蔬菜表面分离到一株产细菌素的菌株 K2，其中和后的无细胞发酵液主要抑制革兰氏阳性细菌，特别是对芽孢杆菌有强烈的抑制作用。
发酵上清液经硫酸铵盐析和透析后，仍然有很强的抗菌活性，并对多种蛋白 酶敏感，表明抗菌活性物质为蛋白类物质。
通过形态培养特征、生理生化特征、16S rDNA 序列比对及系统发育 分析，鉴定菌株 K2 是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。
菌株 K2 产生的抗菌物质在 pH6～9 条件下 80℃处理 30min 仍保持稳定的抗菌活性，其对敏感菌的作用主要是杀菌，而且对芽孢萌发有很好的抑制作用。
该抗菌物质 在菌体生长对数中期产生，在稳定期中期抗菌活性达到最大。
关键词：苏 云 金 芽 孢 杆 菌；细菌素；鉴定；抗 菌 物 质Identification of Bacteriocin-producing Bacillus thuringiensis and Properties of Its Antibacterial SubstancesLI Yun，YANG Sheng-yuan*，LIN Xiao-dong，ZHONG Yu-hong，SU Ting，LIU Xiang-jia (Food and Fermentation Engineering Institute, Department of Biology, Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China)Abstract： Strain K2 having the ability to produce bacteriocin was isolated from the surface of picked vegetables. The neutralized cell-free fermentation supernatant exhibited an inhibition effect against Gram-positive bacteria, especially strong inhibition effect against Bacillus strains. The inhibition activity of the fermentation supernatant still kept high after ammonium sulphate precipitation and dialysis, and the activity of the dialysis retentate was sensitive to a variety of proteases. These results indicated the protein nature of antibacterial substances contained in the dialysis retentate. Base on morphological, physiological and biochemical characteristics, 16S rDNA sequence and phylogenic analysis, the strain K2 was classified as Bacillus thuringiensis. The antibacterial substance from strain K2 remained strong antibacterial activity after heating treatment at 80 ℃ and pH 6 － 9 for 30 min, suggesting its excellent thermostable property and pH resistance. The antibacterial activity was generated from midlogarithmic growth phase and reached the maximum activity at mid-stationary phase. Key words：Bacillus thuringiensis；bacteriocin；identification；antibacterial substance 中图分类号：Q939.9 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)11-0147-06细菌素是某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机 制产生的一类具有生物活性的蛋白质或多肽，主要抑制 其他相近种类的细菌，一般产生菌自身对其细菌素具有 免疫性[ 1 ] 。
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氢氧化钠对苏云金芽孢杆菌芽孢及其萌发的影响陈欢君;周泉;王晓春;张云开;王桂文【摘要】[目的]了解碱对细菌芽孢及萌发的影响及机制,进一步认识芽孢的抗性,为寻找更好的杀灭芽孢的方法提供理论参考.[方法]应用单细胞拉曼光谱采集经NaOH处理后的单个苏云金芽孢杆菌(Bt)芽孢的拉曼光谱,并应用微分干涉差显微镜成像术分析其萌发动态.[结果]1.0 mol/L NaOH处理30 min、45 min和60 min后,Bt芽孢的存活率分别为25.0%、3.6%和1.8%左右;芽孢吡啶二羧酸(DPA)和蛋白质的特征峰有微弱的降低,蛋白质二级结构α螺旋特征峰(1 280/1 652 cm-1)的位置和信号强度与对照没有明显的差异.在10 mmol/L丙氨酸下,单个芽胞开始大量释放CaDPA的时间(Tlag)、快速释放CaDPA所需的时间(ΔTrelease)和芽胞皮层水解所需的时间(ΔTlys)分别是对照的3.5~5倍、12~13倍和1.5~2倍;在月桂胺触发下,Tlag值和ΔTrelease值分别是对照的4倍和11倍左右.外源CaDPA无法触发处理30 min后的芽孢的萌发,而对照则萌发极快.[结论]NaOH处理没有破坏Bt芽孢的内膜,也没有引起成孢内CaDPA泄漏,但令与芽孢萌发相关的蛋白质受损,受损最严重的是皮层水解酶,对芽胞萌发产生严重的影响.%[Objective]To determine the effect and mechanism of alkali on Bacillus thuringiensis (Bt) spores and its germination and to further understand the resistance of spores can provide a theoretical reference for seeking better ways to kill bacterial spores.[Methods]Single-cell Raman spectroscopy was used to analysis the spores treated by alkali at room temperature,and differential interference contrast (DIC) microscopy imaging was used to monitor the kinetics of spore germination.[Results]The viability of Bt spores was 25.0%,3.6% and 1.8%,respectively,when treated with 1.0 mol/LNaOH for 30,45 and 60 min. There was slightly decreased intensity at Raman bands from dipicolinic acid (DPA) and proteins,while there was no evident difference on the positions and intensities of α-helical structures (1 280,1 652 cm-1) between treated and untreated spors.When treated spores germinated in L-alanine,the time,Tlag,at which spores began release of the great majority of their 1∶1 chelate of Ca2+ and DPA (CaDPA),the time periods,ΔTrelease,at which a spore germinating completed the release of the great majority of its CaDPA,and the time periods,ΔTlys,at whic h a spore completed the hydrolysis of peptidoglycan cortex,was about 3.5~5,12~13 and 1.5~2 times of the untreated spores,respectively.The Tlag and ΔTrelease values were about 4 and 11 times of untreated spores when germinated with dodecylamine. However,treated spores did not germinate in exogenousCaDPA.[Conclusion]These results indicate that alkali does not disrupt the Bt spores permeability barrier and the spore does not lose its DPA,but some proteins important in spore germination are damaged by alkali,and the cortex-lytic enzymes are the target of alkali damage which has a great effect on the germination of Bt spores.【期刊名称】《广西科学》【年(卷),期】2017(024)003【总页数】8页(P303-310)【关键词】苏云金芽孢杆菌芽孢;拉曼光谱;DIC成像;碱;芽孢萌发【作者】陈欢君;周泉;王晓春;张云开;王桂文【作者单位】广西大学生命科学与技术学院,广西南宁 530004;广西科学院,广西南宁 530007;广西大学农学院,广西南宁 530004;广西科学院,广西南宁 530007;广西大学生命科学与技术学院,广西南宁 530004;广西科学院,广西南宁 530007【正文语种】中文【中图分类】Q935;Q937【研究意义】芽孢是部分细菌在遇到不良生长条件时形成的休眠体。
由于含水量极低，而且富含2，6-吡啶二羧酸与钙离子结合形成的CaDPA络合物(约占细胞干重10%)，再加上孢外厚厚的芽孢衣，芽孢对辐射、高温、干燥、极端pH值、静水压和一些有毒化学品等有很强的抵抗能力，是细菌的一种生存策略[1-2]。
另外，芽孢内核富含的一组小的酸溶性蛋白质(Small acid soluble proteins)也对DNA起保护作用[3]。
由于芽孢的强抗逆能力，常规的灭菌方法如巴氏灭菌、熏蒸灭菌、煮沸灭菌无法将细菌芽孢彻底杀灭，而采用高温高压或者一些物理手段如紫外线来灭菌，可能对灭菌对象(如器械、食品等)产生破坏或者受条件限制无法实施。
对于细菌芽孢的控制，一方面是设法让芽孢萌发使其失去各种抗性，然后使用常规的方法将其灭杀；或者是设法抑制或者破坏芽孢的萌发，使其无法萌发或者无法进一步生长。
因此了解芽孢的抗性，了解杀菌剂对芽孢的杀灭机理，对寻找更为有效合理的芽孢杀灭方法有重要意义。
【前人研究进展】已有大量的文献报道如何杀灭细菌芽孢及其杀灭机制，包括辐射、热处理和各种化学药剂[1]，其中杀灭芽孢的化学药剂种类繁多，应用广泛[4]。
强碱类物质不是常用的、直接的消毒剂，但通常以一定比例出现消毒剂中。
萌发是芽孢进一步繁殖生长的重要起点，与萌发相关的任何途径或者部件受损芽孢就可能无法萌发而失去繁殖能力。
芽孢既可以由营养萌发剂来触发，也可由非营养性物质或物理因素来触发，萌发剂受体、CaDPA释放通道蛋白、皮层水解酶等参与其中[5-7]。
通过观察处理后的芽孢萌发过程，可以了解到各种灭菌措施或化学药剂杀灭活芽孢的机制。
拉曼光谱是一种分子振动光谱，具有实时、快速、无损分析的优势，可以提供丰富的分子结构和组成信息，在生物医学及微生物单细胞分析领域有广泛的应用[8-9]。
多细胞实时微分干涉差(Differential interference contrast，DIC)显微镜术实现了单细胞水平高通量分析单个细菌芽孢的萌发动态，对认识芽孢的萌发机制起到很大的促进作用[7,10-12]。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)具有独特的杀虫特性，能高效灭杀鳞翅目幼虫而对哺乳动物几乎无害，是目前应用最广泛、生产规模最大的微生物杀虫剂[13-14]。
Bt与蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)虽在宿主范围以及对农业和人类健康的影响方面有很大差异，但是在遗传上十分相近[15]。
已有文献从群体水平报道强碱对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)芽孢萌发的影响，认为强碱并不直接杀灭芽孢，而是使皮层水解酶失活，从而使芽孢无法萌发[16]，但没有在单细胞水平上展开研究，无法了解具体的芽孢萌发细节，也不清楚碱处理对芽孢的其它组件是否产生影响。
【本研究切入点】应用单细胞拉曼光谱分析NaOH处理后的单个Bt芽孢孢内主要成分和结构的变化，应用实时DIC显微镜从单细胞水平监测NaOH处理后Bt芽孢的萌发动态和萌发参数。
【拟解决的关键问题】追踪分析经NaOH处理后的单个Bt芽孢在不同萌发剂触发下的萌发动态，获知NaOH处理对Bt芽孢与芽孢萌发的影响，从单细胞水平进一步了解强碱类物质对芽胞的杀灭机制。
1.1 实验菌株及培养基菌株：苏金云芽孢杆菌(B.thuringiensis)HD-1菌株，HD-1为库斯塔克亚种，购自中国普通微生物菌种保藏中心，编号为AS 1.1014。
种子培养基(LB)：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 值7.4～7.6。
液体培养基(CCY)：谷氨酰胺20 mg，酸水解干酪素1 g，酶水解干酪素1 g，酵母提取物 0.4 g，甘油 0.6 g，去离子水定容至1 000 mL，在定容前添加以下终浓度的微量元素：MgCl2·6H2O 0.5 mmol/L，MnCl·4H2O 0.01 mmol/L，FeCl3·6H2O 0.05 mmol/L，ZnCl2 0.05 mmol/L，CaCl2·6H2O 0.2 mmol/L，KH2PO4 13 mmol/L，K2HPO4 26 mmol/L。
121℃，20 min灭菌。
1.2 芽胞制备菌株在LB固体培养基活化24～36 h，挑取单菌落，转接入LB液体培养基，200 r/min过夜培养，取1%菌液转入产孢培养基(CCY)，200 r/min，培养48～60 h。