苏云金芽孢杆菌毒性研究
苏云金杆菌的研究
2、样本和数据采集
考虑到苏云金杆菌的应用范围广泛，我们从农业领域相关的研究论文、专利 和书籍中搜集了关于苏云金杆菌的样本和数据。数据采集包括苏云金杆菌的菌种、 施用方法、防治对象、防治效果等方面的信息。
3、数据分析
对搜集到的样本和数据进行筛选、整理和分析。采用定量和定性相结合的方 法，对苏云金杆菌的耐药性、应用效果等方面进行深入研究。并运用表格、图表 等形式展示相关数据和结果。
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苏云金杆菌的研究
01 引言
03 研究方法
目录
02 研究现状 04 研究成果
引言
苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌， 广泛应用于农业中作为生物防治手段，对多种害虫具有高效的防治效果。本次演 示将探讨苏云金杆菌的研究现状和应用，首先概述苏云金杆菌的分类和特征，然 后介绍苏云金杆菌在农业中的应用及研究现状，并探讨相关研究方法。最后，将 总结苏云金杆菌的研究成果和发现，指出研究的不足之处，并展望未来的研究方 向。
研究成果
1、苏云金杆菌对农业的影响
苏云金杆菌作为一种生物防治手段，在农业中具有广泛的应用。其对农业的 主要影响表现在以下几个方面：
（1）高效防治害虫：苏云金杆菌对多种农业害虫具有高效的防治效果，特 别是对鳞翅目、膜翅目和鞘翅目等害虫有很好的防治效果。
（2）减少化学农药的使用：施用苏云金杆菌可有效减少化学农药的使用量， 降低环境污染。
3、苏云金杆菌在农业中的应用 及研究现状
苏云金杆菌作为一种生物防治手段，在农业中广泛应用于防治各种鳞翅目、 膜翅目和鞘翅目等害虫。目前，针对苏云金杆菌在农业中的应用研究主要集中于 以下几个方面：
（1）优化施用方法：研究苏云金杆菌的最佳施用时间和方法，以提高其对 害虫的防治效果和减少对非靶标生物的影响。
蛴螬高毒力苏云金芽孢杆菌研究
蛴螬高毒力苏云金芽孢杆菌研究苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)能产生具有强烈杀虫作用的晶体蛋白(insecticidal crystal protein,ICP),对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目等节肢动物,以及动植物线虫、蜱螨等都具有特异性的毒杀活性,而对非目标生物安全。
目前,通过现代生物技术和基因工程的方法对苏云金芽孢杆菌进行改造,扩大其杀虫谱,提高杀虫毒力,使多种因素和成分发挥作用,害虫不易产生抗药性,避免了化学农药所带来的环境污染和抗性问题。
标签：苏云金芽孢杆菌;高毒力;生物防治1 苏云金芽孢杆菌的研究历史1901年日本学者S.Ishiwata报道了从猝倒死亡的家蠶体内分离出一种杆状细菌,即Bt猝倒亚种(Bacillus thuringiensis subsp. scotto),从而揭开了人类对苏云金芽孢杆菌的研究史。
1911年Berliner报道了从德国苏云金省染病的地中海粉螟中分离出一种杆菌并定名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。
1927年,Matts再次从地中海粉螟中分离出类似的杆菌并沿用了苏云金芽孢杆菌的名称,这就是现在的模式种苏云金亚种Matts和Berliner(Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis Matts or Berliner)。
1938年,第一个苏云金芽孢杆菌商品制剂问世,用于防治地中海粉螟。
到1953年Hannay第一次发现苏云金芽孢杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关,并与Fitz-James一起证实了伴孢晶体是一种蛋白质。
Dulmage(1970)筛选出对夜蛾科毒力较高的菌株HD-1,并以此建立了标准品的生物测定程序,实现了苏云金芽孢杆菌制剂的标准化。
1962年,Barjac等首先根据生理生化反应和鞭毛抗原(H)血清反应的不同,把苏云金芽孢杆菌划分为6个亚群。
苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白毒性片段的结构域在毒杀昆虫中的作用
＊通 讯 联 系
Ｃ ｔ ｌ等 ＾通过 ｘ一射线 晶 体 衍 射 已经 确 定 了 ｃ ａｏ ｒｌ 珂 ⅢＤ蛋 白分子 的三维结 构 ， 图 １ 示 ， 总体 结 如 所 其
致幼 虫 的死 Ｉ 研 究 表 明 典 型 的 毒 性 多 肽 是 由三 个
后． 降解 为 有 活性 的 毒性 多 肽 。例 如 ， ｒ Ｉ杀虫 蛋 Ｃｙ ． ＂ 白约 １０ Ｉ， 毒 性 多肽 为 ７ Ｋ ３ Ｋ）其 ０ Ｄ左 右 据 研 究 ， 其
ｃ端 的 约 ６ Ｋ 片 段 是 经 过 蛋 白 酶 的 ７次 永 解 消 化 ，Ｄ ３ 作 用 而 被 除 去 的 。 通 过 ｘ一射 线 衍 射 分 析 ， 经 阐 已 明 了 ＣｖＡ ｒｌ ａ与 Ｃ ３ 的 三 维 结 构 ｙ ｒＡ 。 激 活 后 的
溶 解 并 被 蛋 白酶 激 活 成 毒 性 多 肽 ． 化 的 毒 性 多 肽 活 与昆虫 中肠 道 的 纹缘 膜 上 的受 体 （Ｂ Ｂ ＭＶ，ｒｓ ｂｒ ｂ ｈ ｏ— ａ
基酸序 列 的 同源 性 不 同种 类 的 Ｈ 所 编 码 的 毒 蛋 １
白不 仅 杀 虫 范 围 不 同 ， 且 大 小 也 不 一 样 ． 致 有 三 而 大 个 区 域 范 围 ： ２ — １８ Ｄ、 ５ — ６ Ｋ 和 ２ — １９ ３Ｋ ６ ７Ｄ ５
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生 物 工 程进 展｝ ０２ Ｖ ｌ２ ， ｏ２ ２０ ．ｏ ２ Ｎ ．
苏 云金 芽 孢 杆 菌杀 虫 晶体 蛋 白毒 性： 片段 的 结构 域 在毒 杀 昆虫 中 的作 用
孙运军 邹先琼 夏立板
湖 南师 范 大学 牛命 科 学 学 院微 生 物 学 系 ． 沙 长 ４ ０８ １０ １
东北地区高毒力苏云金芽孢杆菌HB-3 菌株生物学特性研究
形和方形两种晶体蛋白。纯化晶体及孢晶混合物的毒力测定结果表明， 该菌株对玉米螟具有较高毒力，Ｃ。 Ｌｓ 分别为
５ ８ ｇ ｍＬ和 ５ ９ ｇ ｍＬ， ． ２ｔ ／ ￣ ． ４ｔ ／ ￣ 对尖音库蚊也有一定毒力 ， Ｃｏ Ｌ ｓ分别为 １ ． ９ｔ ／ ６５ ｇ ｍＬ和 １． Ｏ￣ ／ ￣ ７ ５ ， ｍＬ。生理生化特性 ｇ 研 究结果表 明， － 已知 的蜡螟亚 种（ ａｉ ｕ ｕｉｇ ｅｓ ｕ ｓ． ａｌ ｉｅ基 本 一致 ， 清型为 Ｈ５ｂ 晶体 ＨＢ ３与 Ｂ ｃ ｌｓ ｈ ｒｎ ｉ ｉ ｓｂｐ ｇ ｌ ｒａ ） ｌ ｔ ｎｓ ｅ 血 ａ。
蛋白的 Ｓ） Ａ Ｅ分析表明， Ｂ３ 【 ｓＰ Ｇ Ｈ － 菌株晶体蛋白至少由分子量为 １３ Ｄ 、５ Ｄ 、５ Ｄ 和 ２ Ｄ 的 ４ ３ ａ６ ａ４ ａ ３ｋ ａ ｋ ｋ ｋ 种多肽
组成 。
关键词
苏云金芽孢杆菌 ； 晶体蛋 白； 毒力测定 ； 生物学 Ｓ４ ６ １ ７ ． １
（． １ 沈阳农业大学植物保护学 院农药科学 实验室 ， 阳 沈 １０６ ； ２ １１１ ．沈阳化工研究院 ， 阳 沈 １６０） ０１ １ １０２ ； １０ １ ３ 辽 宁出入境检验检疫局 ，大连 ．
摘要
从 自然死亡的玉米螟幼虫体 内分离获得一株对玉米螟高毒 的苏云金芽孢杆菌 ， 号为 ＨＢ ３ 编 －。该菌株产 生菱
（．Ｌ ｂｒｔｒ ｆＰｅ ｉｉｅＳ ｉ ｃｓ Ｃ ｌ ｇ ｆＰｌｎ ｒｔ ｔ ｎ， ｈ ｙ ｎ ｒ ｕｔｒ ｌ ｎｖｒｉ ，Ｓ ｅｙ ｎ １ ａｏａｏｙｏ ｓ ｃｄ ｃｅ ｅ， ｏｌ ｅ ａ ｔ ｏｅ ｉ Ｓ ｅ ａ ｇＡｇ ｉ ｌ ａ ｉｅｓ ｙ ｈ ａ ｇ ｔ ｎ ｅ ｏ Ｐ ｃｏ ｎ ｃ ｕ Ｕ ｔ ｎ
１０ ６ ，Ｃ ｉａ ２ ｈ ｙ ｎ ｅｅｒｈＩｓ ｔｔ ｏ ｈｍｉ ｌｉｄ ｓ ｙ ｈ ｎ ａ ｇ １０ ２ ， ｈｎ １ １ １ ｈｎ ； ．Ｓ ｅ ａ ｇＲ ｓ ｃ ｎｔ ｕｅ ｆＣ ｅ ｃ ｎ ｕｔ ，Ｓ ｅｙ ｎ １０ １ Ｃ ｉ ｎ ａ ｉ ａ ｒ ａ；
苏云金芽孢杆菌工程菌BMB20-4的杀虫晶体蛋白检测及毒力测定
株提高 ４ ， ４ 毒力效价显著提高 。 对小菜蛾提高了 ０７ 倍 ， ．２ 对棉铃 虫提 高了 ０７ 倍． ．５
关键词 ； 苏云菌芽孢杆 菌 Ｉ 杀虫晶体蛋 白 Ｓ Ｓ Ｐ ＧＥ电泳 ， Ｄ－ Ａ 生物测定 中囝分类号 ： １ Ｑ８ ２ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ：０４４ ２ （０ ６０ —０ ００ １０ —３ ９ ２０ ）４０２ —３
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６ ６
阜阳师范学院学报 （ 自然科学版 ）
第２ ３卷
至对数生长期， 然后按 １１０ 种量接 种至装有发 １７ ３ 待测样品毒力效价的测定方法跚 ／０ 接 ．． 酵培养基的三角瓶 中， 其中工程菌 Ｂ 。 ＭＢ 的发酵培 用Ｓ Ｓ软件对实验数据进行 回归分析， Ａ 得到 回 养 基 分 两 组 ， 组 加 入 红 霉 素 ， 为 Ｂ 。 （ｎ 归方程和半致死浓度Ｌ ５ 值 ， 一 记 ＭＢ州 ａ ｃ０ 计算毒力效价．
摘
要： 苏云金 芽孢 杆菌的杀 虫晶体蛋 白由单基 因编 码 ， 经过遗 传操 作 ， 建成 Ｂ Ｂ ０４ 构 Ｍ ２－ 工程菌． 本研 究对工 程菌
Ｂ ２ ＭＢ ０４进行 了杀虫 晶体蛋 白检测和 发酵液毒力测 定． 结果表 明ｔ 工程菌 Ｂ ２ — ＭＢ ０４杀虫晶体蛋 白质含量 比天 然菌
Ｖｏ． ３， ． １ ２ Ｎｏ ４
Ｄｅ ． ２ ０ ｃ ０６
苏云金芽孢杆菌工程菌 Ｂ ２ ＭＢ 的 杀 虫晶体蛋 白检测及毒 力测定
王 明跃 ｈ ，张小 平 。
（． １ 安徽师范大学 生命科学学院 ， 芜湖 ２ １０ ￣． ４ ００ ２ 阜阳职业技术学院 ， 阳 ２ ６ ３ 阜 ３０ １）
表 达 水 平 受 到 自身 调 节 系 统 及 毒 素 基 因 拷 贝数 限
苏云金芽孢杆菌的研究——综述
苏云金芽孢杆菌的研究摘要苏云金芽孢杆菌是目前应用最广泛、研究最深入、生产量最大的微生物杀虫剂。
目前已发现多种Bt亚种或血清型对害虫具有杀虫活性,同时也发现了一些新的杀虫晶体蛋白，通过纯化得到高效的杀虫晶体蛋白也是目前研究热点之一。
本文简要介绍了Bt的发展历史、晶体蛋白的纯化及在杀虫方面的一些应用。
关键词苏云金芽孢杆菌、历史、伴孢晶体、杀虫苏云金杆菌(Bacillu .thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，为昆虫病原细菌，其菌体为短杆状、有鞭毛，一般单生或形成短链。
在芽孢形成期可产生具有杀虫活性的伴孢晶体,且伴孢晶体(原毒素)对鳞翅目或双翅目等多种昆虫具有毒杀活性[15]。
苏云金杆菌是一种应用广泛的绿色环保型微生物杀虫剂，全世界年产值已突破1亿美元[1]。
自20世纪60年代实现工业化生产以来,已成为世界上用途最广、商业开发最成功、产量最大的微生物杀虫剂,每年以20%的速度增长[2,3]。
苏云金杆菌杀虫剂的稳定性较差、残效期短、杀虫速度慢等问题都待解决，关于苏云金芽孢杆菌的研究都将继续进行。
1Bt的发展历史1901年，日本学者石渡繁胤(Ishiwata)从虫尸体液中分离出苏云金杆菌猝倒变种(Bacillus.thuringiensis var.sott) 成为苏云金杆菌研究的起点[4]。
1911年，Berliner 发现一杆菌，并详细描述了该菌的形态和培养特征，定名为苏云金杆菌(Bacil-lus.thuringiensis)，指明苏云金杆菌含伴孢晶体(Paraspora crystl) 。
1938年，苏云金杆菌商品化，用于防治地中海粉螟。
20世纪50年代许多国家进行了商业性生产。
从发现该菌至今已有整整105年历史,世界上有超过万篇的研究报道,涉及生物学、分类命名、有效成分、杀虫机理、分子生物学、遗传学、产品化和安全性,包括近年来的转基因植物等诸多方面[5]。
1953年，Hannay第一次发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关，并和Fitz-James于1955年证实，伴孢晶体是一种蛋白质。
苏云金芽孢杆菌杀虫方面的研究及运用进展
B.t.杀虫毒素主要有三种
• 1、伴孢晶体（ICPs）即σ-内毒素。 伴孢晶体（ 内毒素。 伴孢晶体 ） 内毒素 • 2、苏云金素即 外毒素。 苏云金素即β-外毒素 苏云金素即 外毒素。 • 3、芽孢。 芽孢。 芽孢
Ⅰ、伴孢晶体 伴孢晶体
在其芽胞期能形成对特定昆虫具有毒 性的由杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, ICPs)组成的伴胞晶体。
营养期杀虫蛋白 （Vegetative Insecticidal Proteins,VIPs） • Bt在营养期分泌的的一种很有应用前景的杀 虫蛋白。 VIPs 主要分为VIP1、VIP2 和VIP3 三种。
Bt的应用及应用中所遇的问题 的应用及应用中所遇的问题
• 1.苏云金芽胞杆菌对多种昆虫都有很高的杀 虫活性，因此被广泛地应用于生物农药的 开发。
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新的命名规则和分类原则 分类 第一级 第二级 第三级 第四级 同源性 小于45% 45% 至75% 之间 75% 至95% 之间 95% 以上 命名规则
使用阿拉伯数字，如Cry1 和Cry2, 它们之间的同源性小于45%。 使用大写英文字母，如Cry1A Cry1B 之间的同源性在45% 至75% 之间。 使用小写英文字母，如Cry1A a 和 Cry1A b, 其同源性在75% 到95% 之 间。 使用阿拉伯数字, 如Cry1A a1 和 Cry1A a2的同源性大于95%。
※
由于芽孢衣蛋白质与伴孢晶体蛋白质的 同源性致死。芽孢致死害虫的剂量、死 亡斜率、致死症状与伴孢晶体相近。
※
几丁质酶（Chitinase，Chi ）： 是微生物、高等植物和昆虫体内普遍合成的一 种具有生物催化活性的水解酶类。
蛴螬高毒力苏云金芽孢杆菌研究
年 ， 一 个 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 商 品 制 剂 问 世 ， 于 防 治 地 中 海 第 用
果 ， 植 株 矮 小 变 黄 ， 低 产 量 ， 响 品质 。 使 降 影
蛴 螬 是 花 生 产 区 的 主 要 害 虫 。２ ０ — ２ ０ ０ ３ ０ ４年 笔 者 在 河
． 粉 螟 。到 １ ５ ９ ３年 Ｈａ ｎ ｙ 一 次 发 现 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 的 杀 ２ ２ 花 生 蛴 螬 的 危 害 ｎａ 第
虫一 起 证 实 了 伴 孢
暗 Ｈｏｏｒ ｈａ ａａ ｅ 危 ｉ ｌａ 晶体 是 一 种 蛋 白质 。 Ｄｕｍａ ｅ １７ ） 选 出 对 夜 蛾 科 毒 力 北 定 州 市 调 查 ， 黑 鳃 金 龟 （ ｌｔ ｃ ｉ ｐ ｒｌ ｌ） 害 严 ｌ ｇ （９０ 筛 较 高 的 菌 株 ＨＤ一 １并 以 此 建 立 了 标 准 品 的 生 物 测 定 程 序 ， ， 实现 了苏云 金 芽 孢杆 菌 制 剂 的标 准 化 。１６ ９ ２年 ， ａｊｃ Ｂ ｒ 等 ａ 首 先 根 据 生 理 生 化 反 应 和 鞭 毛抗 原 （ 血 清 反 应 的 不 同 ， Ｈ） 把 苏 云金 芽 孢 杆 菌 划 分 为 ６个 亚 群 。 １ ６ ９ ７年 、 ９ ８年 Ｈｅ １６ ｉ ｍ— ｐｌ 形态特征 、 化反应 、 型 和酯 酶型 结合 在一 起 ， 出 ｅ把 生 Ｈ 提 了产 伴 孢 晶 体 的 细 菌 分 类 表 。 １ ７ ９ ６年 Ｚ ｋ ａｙ ｎ最 先 提 ａ ｈ ｒｏ 出 ： 粒 可 能 对 伴 孢 晶 体 的 编 码 起 作 用 。 Ｄ ｂ ｂ ｖ 等 质 ｅａｉ ｏ 重 ， 成花 生 严 重 减 产 ， 重 地 块 花 生 产 量 不 足 ５ 造 严 ０公 斤 ／ 亩 ；０ ５ ２ ０ ２ ０ — ０ ８年 调 查 ， 绿 丽 金 龟 （ ｏ ｌ ｏ ｐ ｌｎａ 铜 Ａｎ ｍａａｃｒ ｕｅ ｔ）
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苏云金芽孢杆菌毒性研究作者：李依韦尹萌萌袁琴来源：《安徽农业科学》2019年第20期摘要以菜青虫为试验材料，用苏云金芽孢杆菌浸泡过的小白菜饲喂菜青虫，提取菜青虫体内的伴孢晶体，通过生物测定法对苏云金芽孢杆菌的毒性进行研究，并对出发菌株进行紫外诱变筛选高毒性菌株。
结果表明，苏云金芽孢杆菌毒性與伴孢晶体含量有关，伴孢晶体含量越多，毒力越高;紫外诱变16min时得到菌株B16，伴孢晶体含量比出发菌株提高8.2%，杀虫效率比出发菌株提高77%。
该研究为苏云金芽孢杆菌生产高效率生物农药提供菌种。
关键词苏云金芽孢杆菌;伴孢晶体;毒力测定;紫外诱变中图分类号Q939.96文献标识码A文章编号0517-6611（2019）20-0159-03doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.20.042开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Toxicity Study of Bacillus thuringiensisLI Yiwei，YIN Mengmeng，YUAN Qin（College of Life Science，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao，Inner Mongolia 028000）AbstractCabbage caterpillar were used as research materials in the experiment，which was fed cabbage caterpillars with cabbage soaked in Bacillus thuringiensis.Parasporal crystals from Pierisrapae was extracted，study on the toxicity of Bacillus thuringiensis by bioassay and screening of highly virulent strains by UV mutagenesis of the starting strains were done.The results showed that the toxicity of Bacillus thuringiensis was related to the content of spore crystals，the more the content of the accompanying spore crystal，the higher the virulence.The strain B16 obtained by UV mutagenesis at 16min raised the content of parasporal crystals by 8.2% compared with the original strain，insecticidal efficiency raised by 77% compared to the original strain.The study provides strains for the production of highefficiency biological pesticides by Bacillus thuringiensis.Key wordsBacillus thuringiensis;Parasporal crystal;Virulence determination;UV mutagenesis在农业生产中害虫防治是一项重要任务，随着人们环保意识的不断增强，生物农药正引起广泛关注[1]。
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）制剂克服了传统化学农药污染环境、危害人畜、易产生抗性等缺点，具有选择性强、安全、原料简单等优点，是目前用途最广、产量最大的微生物杀虫剂[2]。
利用苏云金芽孢杆菌生产的生物农药在农业生产上应用最广、产量最大[3]。
对100多种害虫有致病和毒杀作用。
针对目前苏云金芽孢杆菌残效期短、杀虫谱窄、见效慢的问题，筛选高毒力菌株以提高苏云金芽孢杆菌生物制剂的杀虫效果成为研究热点[4]。
笔者对苏云金芽孢杆菌进行紫外诱变，筛选得到高毒力菌株，为以后生产高毒性生物农药提供菌种。
1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌种。
苏云金芽孢杆菌（内蒙古民族大学生命科学学院微生物生物技术实验室保存）。
1.1.2菜青虫。
在室外人工种植小白菜，使其自然生长，定期进行观察，会有虫卵出现[5]，均采用菜青虫幼虫，其体征表现为青绿色，体圆筒形，中段较肥大，背部有一条不明显的断续黄色纵线，气门线黄色，每节的线上有2个黄斑。
密布细小黑色毛瘤，各体节有4～5条横皱纹。
1.2试验方法1.2.1苏云金芽孢杆菌生长曲线绘制。
将纯化的苏云金芽孢杆菌单菌落接种到LB液体培养基中，30 ℃、220 r/min培养1 h，此时测得细胞浓度为93.9%。
取此培养物接种于LB液体培养基中振荡培养。
分光光度计在600 nm波长处每隔2 h测定吸光度，绘制生长曲线。
每次测完吸光度的菌液番红染色，显微镜下观察伴孢晶体[6-7]。
在伴孢晶体出现期间，每隔2 h从菌液中取8 mL菌液于离心管中，离心管命名为E11、E12、E1 用于后续测定伴孢晶体。
1.2.2伴孢晶体制备。
配制溶菌酶溶液500、250、200、100 μg/mL，各取200 μL分别加入含有1 mL菌液的离心管中， 20 min后染色镜检观察细胞的完整性。
选择500 μg/mL的溶菌酶制备孢晶混合液。
在“1.2.1”中每隔2 h取培养物加入配好的500 μg/mL溶菌酶溶液1 mL，溶解20 min后 -20 ℃冷冻30 min，取出立即放入40 ℃水浴中温浴15 min，反复冻融3次，即为孢晶混合液。
将孢晶混合液高速低温离心20 min，棄上清，蒸馏水悬浮沉淀物，振荡使悬浮液产生大量泡沫，弃去泡沫，重复几次，直到产生很少的泡沫为止，重复此操作2次后收集沉淀， 40 ℃烘干得到淡黄色晶体蛋白粗提物，即为伴孢晶体[8]。
1.2.3苏云金芽孢杆菌毒力测定。
1.2.3.1不同培养时间出发菌株毒力测定。
通过叶片浸泡饲喂法，在菌液培养到22～30 h时，每2 h取菌液进行毒力测定，将菌液依次命名为A22、A24、A26、A28、A30。
将新鲜的白菜嫩叶切割成3～4 cm见方的小块，并用刀背在叶片上划成纵横交错的刻痕，然后浸入菌悬液中，使叶片各部分比较均匀地接触菌液然后取出，阴干，最后放入养虫瓶。
不同时间菌液各放入菜青虫（2～3龄健康幼虫）9头，室温下培养，每天观察死亡情况，根据下列公式计算死亡率并进行分析，筛选苏云金芽孢杆菌产生毒蛋白的最佳时间[9]。
死亡率=死亡菜青虫数供试菜青虫数×100%校正死亡率=处理组死亡率-对照组死亡率1-对照组死亡率×100%1.2.3.2菜青虫肠道内菌群及其毒力检测。
为了验证苏云金芽孢杆菌导致菜青虫死亡，把杀死的菜青虫肠液取出接入液体培养基，30 ℃、220 r/min培养20 h，显微镜下观察。
继续培养至26 h，以“1.2.3.1”中方法和条件测定毒力，其结果与出发菌株毒力相比较[10]。
1.2.3.3紫外诱变。
将培养26 h的苏云金芽孢杆菌按照“1.2.2”方法制备孢晶混合液进行紫外诱变，诱变时间为12、14、16、18、20 min，编号B12、B14、B16、B18、B20，诱变菌液用于菌种筛选。
1.2.3.4诱变菌液毒力测定。
不同诱变时间的菌液按“1.2.3.1”中方法进行毒力测定，分别在12、24、36、48 h计算菜青虫死亡率。
同时对诱变菌液进行培养并按照“1.2.2”中方法提取伴孢晶体，每种诱变菌液设置3个重复F21、F22、F2 提取结果与出发菌株比较筛选高毒力菌株。
2结果与分析2.1苏云金芽孢杆菌的生长曲线由图1可知，0～8 h为迟缓期，显微镜下观察到此期间菌体形态细小且数量较少，8～20 h为对数生长期，此时菌体增大，数量急剧增长。
20～26 h为稳定期，此时菌体生长迟缓。
26 h后进入衰退期，菌体数量下降。
每2 h观察菌体形态，在培养20 h后芽孢开始出现，后逐渐增多，22 h有伴孢晶体形成。
2.2不同培养时间伴孢晶体含量由表1可知，在培养22～26 h，随培养时间延长，伴孢晶体增多，26 h时最多，为0.010 5 g/mL。
培养26～30 h伴孢晶体数量呈下降趋势。
2.3不同培养时间出发菌株毒力测定由表2可知，将各菌株浸泡过的小白菜给菜青虫饲喂后，杀虫效率经SPSS 22.0软件分析，杀虫率有显著差异（P<0.05）。
由图2可知，培养不同时间苏云金芽孢杆菌杀虫率不同，A26菌株杀虫率最高，即培养26 h的菌液杀虫效果最好，毒性最强。
2.4肠液菌株检测及毒力测定由图3可知，在同一培养时间下，菜青虫肠液内苏云金芽孢杆菌毒力比出发菌株低，与肠液内的蛋白对菌株毒性有减弱作用有关，这与邵宗泽等[11]的研究结果一致。
2.5诱变菌株毒力测定由表3可知，用诱变后菌株浸泡过的小白菜饲喂菜青虫，杀虫效率经SPSS 22.0软件分析，与出发菌株比较B16在不同诱变时间杀虫效果均显著高于其他菌株（P<0.05）。
由图4可知，B14、B16、B20菌株的杀虫率均比出发菌株高，但B16菌株杀虫效果最好，与出发菌株相比，杀虫率提高77%。
2.6诱变菌株伴孢晶体含量分别提取B12、B14、B16、B18、B20在培养26 h时的伴孢晶体，并提取出发菌株伴孢晶体作对照。
由表4可知，B16菌株伴孢晶体含量最高，为0.011 36 g/mL，与出发菌株相比提高8.2%。
3结论该研究利用苏云金芽孢杆菌毒杀菜青虫，并测定不同时间菌株的杀虫能力以及伴孢晶体含量，通过紫外诱变技术获得高毒力诱变菌株。
结果表明菌株毒力的强弱与伴孢晶体含量有关，伴孢晶体量越多，菌株毒力越强;筛选到一株高毒力菌株B16，其伴孢晶体含量比出发菌株提高8.2%，毒力比出发菌株提高77%，为以后苏云金芽孢杆菌高毒力菌株的选育提供理论依据。
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