苏云金芽孢杆菌毒素的生产
苏云金芽孢杆菌使用说明
注 意 事 项 ：
1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放
置会导致菌种衰退；
2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行；
3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能
正常生长； 4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来 电询问； 5、某些厌氧菌的培养，自开封到接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧 状态；培养过程中亦要保持厌氧状态； 6、某些菌种，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需要 5-‐10%CO2 促 进生长； 7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况，应停止使用对应产品。 8、部分菌种有致病性、扩散性，请专业人员在专业环境下有保护性操作。 保 藏 条 件 ： -‐20℃保存（复溶液于 2-‐8℃保存） 保 藏 时 间 ： 2-‐10 年，应根据菌种状况及时转接
苏云金芽孢杆菌
编号
名称
北京华越洋生物 NRR00380
苏云金芽孢杆菌
基 本 信 息 ： பைடு நூலகம்
名称：苏云金芽孢杆菌
规格：300ul 甘油菌
储存温度：-‐80℃
基 因 组 ：
苏云金芽孢杆菌
简 介 ：
苏云金杆菌，简称 Bt,是包括许多变种的一类产晶体芽孢杆菌。该菌可
（必要时，可适当延长培养时间）。
菌 株 传 代 ：
将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量
增大接种量：如用无菌吸管吸取≥50μl 新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓
慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。
2022年湖南师范大学树达学院生物科学专业《微生物学》期末试卷B(有答案)
2022年湖南师范大学树达学院生物科学专业《微生物学》期末试卷B(有答案）一、填空题1、能产芽孢的细菌较少，主要是属于革兰氏______性细菌的______属和______属，前者是好氧菌，其芽孢囊呈______状，后者是厌氧菌，其芽孢囊的外形常呈______状。
2、病毒的非增殖性感染有______、______和______3种类型。
3、在代谢回补顺序中，约有10条途径都是围绕着补充______途径中的关键中间代谢产物______以及______途径中的关键中间代谢产物______ 进行的。
4、各大类微生物都有其生长适宜的pH范围，如细菌为______、放线菌为______、酵母菌菌为______、霉菌为______、藻类为______、原生动物为______。
5、核糖体的功能是______，它由存在于表层的______和位于内层的______两种成分组成；在真核生物细胞质中的核糖体的沉降系数一般为______，而在线粒体中则为______，原核生物的一般为______。
6、微生物与人类关系的重要性，你怎么强调都不过分，微生物是一把十分锋利的双刃剑，它们在给人类带来______的同时也带来______。
7、1971年，McCord和Fridovich提出了一个关于厌氧菌氧毒害机制的______学说。
其根据是厌氧菌缺乏______酶，一般也缺乏______酶，因此易受______等的毒害。
8、细菌沥滤又称细菌冶金，主要分三阶段：______，______，______；其中后一步是关键，它由化能自养细菌______来完成的。
9、微生物转录水平的调控一般都是蛋白质或某些小分子物质对基因转录的阻遏或激活，而在翻译水平上也发现了类似的______作用。
10、外毒素的种类很多，常见的如______、______、______和______ 等。
二、判断题11、由于间体是细胞膜内陷形成的，因此其组成结构和功能与细胞膜是完全相同的。
实验三 芽孢杆菌发酵
1、采用平板计数法计算发酵液菌体浓度并利用细 菌计数器计算芽孢形成率；采用平板计数法计算 粉剂中芽孢数量,根据实验结果分析影响菌体生长 及芽孢形成的因素 2、根据实验结果绘制时间与还原糖、溶氧、转速、 通气量、pH及菌体浓度的过程曲线，并解释曲线 变化的原因
思考题
1、简述苏云金芽孢杆菌的杀虫原理； 2、利用发酵罐培养苏云金芽孢杆菌过程中， 溶氧对菌体生长有何影响。 3、为了解发苏云金芽孢杆菌发酵过程中二氧 化碳浓度的变化，请设计实验测定尾气中二氧 化碳浓度的方法，并说明实验原理。
生物工艺学实验：实验 三
苏云金芽孢杆菌的培养及粉 剂制备
生命科学学院
实验目的
学习苏云金芽孢杆菌的种子制备、发酵生产 和产品检测的方法； 掌握苏云金芽孢杆菌发酵生产的调控原理。
实验原理
1、苏云金芽孢杆菌
内生芽孢的革兰氏阳性土壤细菌，是应用最广的 一种微生物杀虫剂，它的主要活性成分是一种或 数种杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)，又称δ-内毒素。
斜面培养基 酵母粉 0.5，蛋白胨 种子培养基： 葡萄糖 2，酵母浸粉 MgSO4 0.05，硫酸铵 发酵培养基: 葡萄糖 3，酵母浸粉 MgSO4 0.05，硫酸铵
1，NaCL 0.5，pH7.0 0.5，蛋白胨 0.5， K2HPO4 0.1， 0.5，pH7.0 0.5，玉米浆 1，K2HPO4 0.1， 1，pH7.0，121℃,20min
实验原理
2、伴孢晶体 杀虫伴孢晶体蛋白本身无毒，在酸性条件下会 变性失去作用，对于人和哺乳动物，当它进入 机体后，马上在胃酸作用下变性，而在腔肠动 物体内，没有酸性环境，不会马上变性，在碱 性条件下马上分解，释放毒性蛋白，起到对集 体的毒害作用。
苏云金芽孢杆菌毒素的生产
分离、发酵、 分离、发酵、纯化技术
B.t.分离技术主要有以下几种： 分离技术主要有以下几种： 分离技术主要有以下几种 土壤分离技术 ：温度筛选、 利用醋酸钠进行 选择筛选 、弹土分离法、 抗生素选择性筛选 从植物中分离B.t. 从植物中分离
温度筛选
B.t.的芽孢因为中皮层主要成分为肽聚糖和形 成过程中产生大量DPA-Ca螯合物而具有耐热 性，在80℃下热处理20min也不会死亡，在 75℃的亚致死温度下处理15min可以提高其成 活率。利用这一特性，可以进行温度筛选。温 度筛选范围广，不易漏筛，但是工作量大且B.t. 要达到一定浓度。
ICPs纯品的制备 纯品的制备
ICPs纯品的制备： 目前纯品的制备方法主 纯品的制备： 纯品的制备
要有等密度梯度离心法、液体双向分离法、等 电点沉淀法、离子交换分离法、碱裂解法、高 速离心法、生物物理法等。
等密度梯度离心法
等密度梯度离心法是利用密度的差异将伴孢晶体与杂 质分离，从而获得纯品。 其常用的密度试剂有蔗糖 、人工聚合蔗糖、碱金属盐 (CsC1、NaBr)、碘化密度梯度介质等 溴化钠密度梯度离心纯化实验步骤： 溴化钠密度梯度离心纯化实验步骤：配制密度不同的溴化
固态发酵
固态发酵是B.t.生物农药生产的一种新方式。相较于液 体发酵，具有培养基对环境污染少、易处理，能源消 耗量低，技术设备简易，产物浓度高，后处理方便等 优点。作为一项新型技术，固态发酵还存在着很大的 发展空间。 无论是液体发酵还是固态发酵，都需注意培养基中营 养物质、pH、温度、含氧量的控制。对于B.t.的发酵 生产，还需注意噬菌体的长期污染会降低产量。
生产上的应用
B.t.菌生物农药制剂防治农业害虫 菌生物农药制剂防治农业害虫 将B.t.的ICPs基因转入其他物种获得抗虫植物 的 基因转入其他物种获得抗虫植物
苏云金杆菌的利用现状、发展及问题探讨
到２００５年使生物农药使用量占到农药总量的３０％，２０１５年占到５０％。
目前，我国农药耗用量每年达１５０万吨以上，按此比例计算，２００５年需生物农药４５万吨，２０１５年达７５万吨。
而目前我国生物农药仅８０００吨，在农药总量中不到１％。
由此可见，生物农药具有很好的发展前景。
苏云金杆菌作为应用最广泛的生物农药，其发展潜力是可以预测的。
２苏云金杆菌的产生背景及发展１９叭年，德国南部一个叫苏云金的小城镇上，一家面粉加工厂发生了一件怪事，一种叫地中海粉螟的仓库害虫，平时粉蛾飞舞，幼虫在面粉中爬来爬去，这一天，有人发现那些小爬虫突然卷曲死ｌ二。
这件事弓ｆ起了生物学家贝尔内里的注意，经过无数次努力，贝尔内里从虫ｔｒ＿｜中分离出来这利，杆状细菌。
４年以后．克林诺发现．在细菌的芽孢形成不久，还会形成一些正方形或菱形的晶体，可惜这个发现来被重视。
１９５３年，汉纳证明了这种晶体是有赤的噩白晶体，粉螟幼虫自然死【＝＝的原因不吉臼明了。
这种细菌以发现的地方命名，叫嚣云金杆菌。
经过几十年的势力。
科学家们用实验证明苏云金杆菌可以防治鳞翅曰、膜翅日、直翅目、鞘翅目等１３０多种害虫。
３苏云金杆菌的杀虫机理苏云金杆菌杀虫作用的主要成分是孢子形成过程中产生的伴孢晶体（ＩｃＰｓ），它足单基因表达的产物”。
伴孢晶体经敏感昆虫口服后，在中肠碱性环境中，被降梓为活性的多肽片断（ＩｃＰ的毒性片断包含三个不同的结构域。
一般认为结构Ｉ参与孔道的形成．结构域ＩＩ决定毒素与受体的特异性结合。
结构域ＩＩＩ主要调节毒素的活性）”’，再与巾肠受体蛋白（陷锄）结合，形成细胞膜通道，破坏渗透膜，引起细胞溶解，展终导致虫体死亡。
ＩｃＰ的杀虫作用表现出种属专一性，然而，ＩｃＰ对敏感昆虫的特异性和毒力，除决定于菌株本身外，还决定于昆虫肠液对伴孢晶体的溶解和激活方式，幼虫中肠上皮细胞毒蛋白专一性受体的存在以及昆虫对ＢＴ的抗性“３。
目前，全世界拱分离到５００００株苏云金杆菌，分为６２种血清型和矩种。
苏云金芽孢杆菌杀虫剂作用机理及应用
苏云金芽孢杆菌杀虫剂作用机理及应用一、苏云金芽孢杆菌杀虫作用机理1、苏云金杆菌致病机理苏云金杆菌对昆虫的致病作用是通过它所产生的毒素和芽孢而引起的。
一般是伴孢晶体的毒素使昆虫发生毒血症而死亡，由于晶体毒素对昆虫中肠上皮有破坏作用，使肠壁受损，中肠的碱性、高渗内含物进入昆虫血腔，使血液pH升高导致染病幼虫麻痹而死亡。
而芽孢是在肠道中萌发为菌体通过由晶体毒素破坏的中肠肠壁进入血腔，菌体在血腔中进行繁殖从而引起昆虫败血症的发生，造成染病昆虫的死亡。
而β-外毒素是RNA聚合酶的竞争抑制剂，可干扰昆虫有关激素的合成，从而导致幼虫发育畸形或不能正常化蛹。
苏云金芽孢杆菌虽然有较强的杀虫能力，但它必须经吞食过程进入体内才能杀死昆虫。
因此，在实际应用中，将其与吸引昆虫的物质一起喷洒，可以增加昆虫吞食的可能性。
二、苏云金芽孢杆菌在害虫防治上的应用苏云金芽孢杆菌类的各变种对鳞翅目、膜翅目、直翅目、双翅目、鞘翅目等350余种昆虫有不同程度的防治效果，但主要应用于防治下列害虫。
1、经济作物类棉铃虫，红铃虫，造桥虫，烟青虫。
2、蔬菜类菜青虫，小菜蛾，菜螟。
3、粮食作物类二化螟，三化螟，稻苞虫，稻纵卷叶螟，玉米螟等。
4、果树类松毛虫，桃小食心虫，尺蠖，大袋蛾，卷叶蛾等。
三、苏云金芽孢杆菌的使用方法苏云金芽孢杆菌杀虫剂效果对虫龄越小防治效果越好，使用时必须掌握好时机和用量。
苏云金芽孢杆菌农药药效较慢，一般害虫进食30min后停止为害作物，24h开始死亡，48h达到死亡高峰，72h死亡率达95%以上。
1、单用喷粉，喷雾均可。
2、混用为提高药剂的防治效果，特别是在害虫大发生和多种害虫混合发生时，可与非碱性的杀虫双、杀虫单、甲胺磷、三唑磷等常用化学杀虫剂混用，作用互补，效果更佳。
但必须现配现用，最好不和其他杀菌剂混用，以免影响防治效果。
3、与其他生物农药混用可与白僵菌，小菜蛾GV等混用。
四、苏云金芽泡杆菌使用注意事项：1、温度使用苏云金芽孢杆菌制剂的适宜温度在25℃以上，温度过低完全失去杀虫作用：在25～30℃时使用，其防治效果比10～15℃时高出1～2倍，温度低于20℃时最好不使用。
苏云金芽孢杆菌
❖ 用苏云金芽孢杆菌防治动物血吸虫病 ❖ 用苏云金芽孢杆菌防治猪蛔虫病 ❖ 用苏云金芽孢杆菌防治绵羊绿铜蝇 ❖ 用苏云金芽孢杆菌防治蚊虫 ❖ 用苏云金芽孢杆菌防治细菌引起的感染性疾病
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苏云金芽孢杆菌在工农业生产中的应用
❖ 用苏云金芽孢杆菌防治酒曲害虫黑菌虫 ❖ 用苏云金芽孢杆菌防治棉铃虫 ❖ 用苏云金芽孢杆菌防治水稻稻纵卷叶螟 ❖ 用苏云金芽孢杆菌防治杨树食叶害虫 ❖ 用苏云金芽孢杆菌防治根结线虫 ❖ 用苏云金芽孢杆菌防治蔬菜害虫 ❖ 用苏云金芽孢杆菌防治春尺蠖
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Bt的发现
1901
日本学者石度繁从患猝倒病的家蚕幼虫中分离到第1个产生晶 体的芽孢杆菌。
1911
Berliner从德国苏云金地方一家面粉厂染病的地中海粉螟中分离到一个相 似的菌株，并正式定名为苏云金芽孢杆菌（Bt）。
一个叫克林诺的科学家发现，在这种细菌的细胞中可以形成方形或菱 形的晶体，可惜这个发现并未被重视。
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❖ 用苏云金芽孢杆菌研制热稳定性禽流感口服疫苗 刘梅等(2007)利用苏云金芽孢杆菌具有很强热稳定性及 对畜禽无毒性的优点，通过建立苏云金芽孢杆菌细胞表面 展示系统，即将AJ基因与S一层蛋白(Surface layer protein)融合后，AI病毒NP蛋白展示到受体菌株表面，从 而开发出活菌疫苗。该热稳定性AIV—苏云金芽孢杆菌重 组口服疫苗在对小鼠的实验中，表现较强免疫原性。
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苏云金芽孢杆菌
Bacillus thuringiensis
苏云金杆菌解读
精心整理苏云金杆菌解读苏云金杆菌，简称Bt，又称苏云金芽孢杆菌，1901年由日本细菌学家石渡繁胤首先在受病害的蚕蛾中发现，但是当时没有保存下来。
1911年，德国人贝尔奈(Berliner)从德国苏云金省一家面粉厂地中海粉螟上，分离到一种有很强杀虫力的细菌，并正式定名为苏云金芽胞杆菌。
是包括许多变种的一类产晶体的芽孢杆菌。
商品名称作用机理苏云金杆菌杀虫活性物质有二种，一种是晶体和孢子。
它是一种蛋白质（Cry蛋白），当害虫取食了伴孢晶体和芽孢之后，在中肠蛋白酶的作用下，伴孢晶体溶解，释放出对鳞翅目幼虫有较强毒杀作用的δ-内毒素。
这种毒素使幼虫的中肠麻痹，与中肠细胞膜受体结合，肠道内碱性内含物漏入血腔，孢子和菌体通过被破坏的肠壁进入体腔。
使其呈现中毒症状，食欲减退，对接触刺激反应失灵，厌食，呕吐，腹泻，行动退缓，身体萎缩或卷曲。
经一段发病过程，害虫肠壁破损，毒素进入血液，引起败血症，同时芽孢在消化道内迅速繁殖，最终麻痹而死。
还有一种Bt毒素，作用方式是干扰中肠细胞的线粒体功能，引起害虫中毒死亡。
甘蓝夜蛾、烟青虫、玉米螟、稻纵卷叶螟、二化螟、松毛虫、茶毛虫、茶尺蠖、玉米粘虫、豆荚螟、银纹夜蛾等多种害虫。
使用技术1、防治玉米螟，每亩用16000IU/毫克可湿性粉剂150～200克，拌细沙土3～5公斤，拌匀撒于心叶内。
2、防治棉铃虫、造桥虫、水稻、稻纵卷叶螟、螟虫，每亩用8000IU/毫克可湿性粉剂200~400克，或16000国际单位／微升悬浮剂100—150毫升，兑水50～70公斤喷雾。
3、防治果树、林木、松毛虫、食心虫、尺蠖、茶茶毛虫、茶尺蠖：每亩用16000国际单位／毫克可湿性粉剂150~200克/亩，兑水50公斤喷雾。
国际单位／微升悬浮剂250—300倍液喷雾。
9、防治枣尺蠖，用8000国际单位／毫克可湿性粉剂600—800倍液，或16000国际单位／微升悬浮剂200倍液喷雾。
注意事项1、施用期一般比使用化学农药提前2～3天，对害虫的低龄幼虫效果好。
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抗生素选择性筛选
B.t.较其他芽孢杆菌对抗生素的抗性显著。用 抗生素处理后可以有效分离出B.t.，但由于B.t. 各亚种之间对抗生素的敏感性不同，个别亚种 会因抗生素浓度过高而不能形成芽孢和伴孢晶 体，从而造成漏筛。将醋酸钠和抗生素分离法 合二为一，可大大提高分离效率。
从植物中分离B.t. 从植物中分离
苏云金芽孢杆菌毒素的生产工艺
苏云金芽孢杆菌
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，B.t.） 于1901年由日本科学家S.Ishwata从家蚕中发 现至今已有109年历史。 B.t.已成为目前产量最大、应用最广的一类微 生物杀虫剂，占到生物农药生产量和使用量的 90%左右。
B.t.杀虫毒素主要有三种
液体双相分离法： 液体双相分离法：利用互不相溶的两种液体对晶体
和芽孢的亲和性不同(即晶体、芽孢表面特性不同)而达 到分离目的。
等电点沉淀法： 等电点沉淀法 若在某一pH 值下氨基酸净电荷为零，
且在电场中不移动时，此pH 值为它的PI值(等电点)。 大部分蛋白质于等电点的pH值下，其溶解度是最小的
离子交换分离法： 离子交换分离法：利用离子交换树脂上的可交换离
利用醋酸钠进行选择筛选
B.t.芽孢的萌发直接受pH值影响。加入适量醋 酸钠的培养基可以选择性地抑制B.t.芽孢的萌 发，经热处理而不被杀死；而其他种类芽孢杆 菌因其芽孢萌发，经热处理后被杀死。利用这 种筛选分离方法可以消除干扰菌以达到高效分 离筛选的目的。
弹土分离法
将土壤样品干燥后研碎，洒在灭菌滤纸上，待 滤纸面上沾有一层均匀样品粉末后对着培养皿 口轻弹，后培养。该方法简单，但培养后检出 的菌类数量大，种类多，不易识别纯化。
子发生的变换反应达到分离和提纯的目的。常借助离 子交换柱进行动态离子交换以实现这一目的。酶和蛋 白质都有电解质性质，故可用离子交换法进行分离提 纯。
碱裂解法： 碱裂解法：苏云金芽孢杆菌产生的伴孢晶体是一种
碱溶性蛋白，由cry基因和cyt基因所编码。在pH值高 于9。5时，大多数的cry毒素和cyt毒素溶解，少数需要 在pH值为12时才完全溶解。因此选用pH值9。6的碳 酸钠缓冲溶液才能保证大多数的蛋白质从菌体中溶出。
分离、发酵、 分离、发酵、纯化技术
B.t.分离技术主要有以下几种： 分离技术主要有以下几种： 分离技术主要有以下几种 土壤分离技术 ：温度筛选、 利用醋酸钠进行 选择筛选 、弹土分离法、 抗生素选择性筛选 从植物中分.t.的芽孢因为中皮层主要成分为肽聚糖和形 成过程中产生大量DPA-Ca螯合物而具有耐热 性，在80℃下热处理20min也不会死亡，在 75℃的亚致死温度下处理15min可以提高其成 活率。利用这一特性，可以进行温度筛选。温 度筛选范围广，不易漏筛，但是工作量大且B.t. 要达到一定浓度。
ICPs纯品的制备 纯品的制备
ICPs纯品的制备： 目前纯品的制备方法主 纯品的制备： 纯品的制备
要有等密度梯度离心法、液体双向分离法、等 电点沉淀法、离子交换分离法、碱裂解法、高 速离心法、生物物理法等。
等密度梯度离心法
等密度梯度离心法是利用密度的差异将伴孢晶体与杂 质分离，从而获得纯品。 其常用的密度试剂有蔗糖 、人工聚合蔗糖、碱金属盐 (CsC1、NaBr)、碘化密度梯度介质等 溴化钠密度梯度离心纯化实验步骤： 溴化钠密度梯度离心纯化实验步骤：配制密度不同的溴化
2、苏云金素即 外毒素。是部分B.t.分泌到体外的一类核苷 苏云金素即β-外毒素 苏云金素即 外毒素。
类物质，具有热稳定性和广谱杀虫作用，对蝇类幼虫、夜蛾科和 鞘翅目害虫有很好的杀毒作用。
3、芽孢。当受感染昆虫中肠受伴孢晶体损伤后，活芽孢萌发成 芽孢。 芽孢
营养体，穿透肠壁进入血液并大量繁殖，使昆虫患败血症死亡。
1、伴孢晶体（ICPs）即σ-内毒素。 蛋白质，在昆虫体外 伴孢晶体（ 内毒素。 伴孢晶体 ） 内毒素
与特定的生物膜类脂物相互作用使其重新排列，最终导致细胞溶 解。在活体内，因昆虫肠液碱性条件和酶的作用降解成毒性多肽， 使昆虫肠上皮细胞的酶功能、蛋白质代谢和运输过程受干扰，或 是作为酶的抑制剂和细胞自溶的启动剂造成内质网空泡，线粒体 瓦解，最终细胞自溶使昆虫死亡。
生产上的应用
B.t.菌生物农药制剂防治农业害虫 菌生物农药制剂防治农业害虫 将B.t.的ICPs基因转入其他物种获得抗虫植物 的 基因转入其他物种获得抗虫植物
有研究表明，B.t.普遍存在于植物叶面，叶面 菌群有高度的血清型特异性，植物物种和B.t. 菌株表型不存在相关关系。采用植物微生物分 离常用方法，再结合4%NaCl培养基选择分离 法、土壤B.t.分离法中的醋酸钠分离法和抗生 素分离法等就能分离得到较纯的B.t.。
发酵技术
B.t.的工业生产主要分为菌种培养、发酵、浓缩（离心 或板框过滤）、干燥、剂型化、产品检验六道程序。 目前，B.t.的大规模生产主要采用液体深层发酵。 B.t.的最佳培养条件为：在恒温培养箱中，使用液体发 在恒温培养箱中， 在恒温培养箱中 酵培养基(胰蛋白胨 胰蛋白胨1． ％，葡萄糖0． ％， ％，葡萄糖 ％，玉米粉 酵培养基 胰蛋白胨 ．0％，葡萄糖 ．5％，玉米粉 0．5％，酵母膏 ．2％，磷酸氧二钠 ．1％ ，磷酸二 ％，酵母膏 ％，磷酸氧二钠 ． ％，酵母膏0． ％，磷酸氧二钠0． ％ 氧钾0． ％ ， 培养瓶中配制25mL培养液， 培养液， 氧钾 ．1％)，l50ml培养瓶中配制 培养瓶中配制 培养液 30℃培养 ℃培养36h，振荡频率为 ，振荡频率为250次／min。 次 。
杀虫晶体蛋白（ 杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）的纯化 ， ）
ICPs粗品的制备： ICPs随着B.t.孢子囊的破裂而释 粗品的制备： 粗品的制备
放。用磁力搅拌器搅拌分离培养纯化后的B.t.制成的菌 悬液，除去泡沫层中较轻的孢子，重复几次基本除尽 孢子后，用超声波处理使ICPs和芽孢均匀分布，离心 弃上清液，用特殊试剂处理以消除晶体蛋白酶对晶体 的非特异性降解作用后，溶于生理盐水即制成粗品。 粗品中残留细胞碎片、不溶性培养基和芽孢，需进一 步纯化。
固态发酵
固态发酵是B.t.生物农药生产的一种新方式。相较于液 体发酵，具有培养基对环境污染少、易处理，能源消 耗量低，技术设备简易，产物浓度高，后处理方便等 优点。作为一项新型技术，固态发酵还存在着很大的 发展空间。 无论是液体发酵还是固态发酵，都需注意培养基中营 养物质、pH、温度、含氧量的控制。对于B.t.的发酵 生产，还需注意噬菌体的长期污染会降低产量。