苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白提取方法比较研究
苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白提取和纯化
苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白提取和纯化摘要：苏云金芽孢杆菌是目前世界上研究最多、产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂，具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、易生物降解及无残毒等优点。
通过对苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白提取和纯化得到伴孢晶体。
经过稀释分成不同的浓度分别去检测杀虫活性。
关键词：伴孢晶体，苏云金芽孢杆菌，纯化1 材料与方法1.1 材料1.1.1 仪器设备和试剂超净工作台，高压灭菌锅，离心机，冷冻干燥机，-80℃低温冰箱，透析袋，移液管，玻璃棒，电子秤，养虫缸。
超纯水，0.5M/L的Nacl，生理盐水，5%的丙酮溶液。
1.1.2 研究菌株本实验室分离自病蚕体内的苏云金芽孢杆菌。
1.1.3 供试昆虫菜青虫。
1.1.3 培养基种子培养基[1]:酵母浸膏0.5％，蛋白胨1.0％，NaC1 1.0％，pH值7.0。
121℃灭菌30 min。
蒸馏水1000 ml，pH值7.0（用NaOH调pH值）。
发酵培养基[2]：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，葡萄糖0.3％，NaC1 0.2％，MgS04·7H2O 0.03％，K2HPO4 0.03％，MnSO40.005％，蒸馏水1000 ml。
调pH 7.5，121℃灭菌30 min，灭菌后pH 7.3。
1.2 方法1.2.1 种子液的培养在无菌的条件下，从保藏管中分别挑一环接种有种子夜培养基，30℃培养14 h。
1.2.2 菌株发酵按照3％的接种量转接500ml的发酵培养基，30℃，120 r／min培养60 h，镜检观测80％以上的菌体裂解时停止培养，离心收集提取晶体蛋白。
1.2.3 伴孢晶体的分离纯化[4]氨基酸可以3种形式存在，即带正电荷、带负电荷和两性离子，如在酸性溶液中带正电荷、在碱性溶液中则带负电荷。
若在某一pH 值下氨基酸净电荷为零，且在电场中不移动时，此pH 值为它的PI值(等电点)。
因为净电荷为零，净电斥力不存在，大部分蛋白质于等电点的pH值下，其溶解度是最小的。
苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白结构和功能研究进展
苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白结构和功能研究进展收稿日期：2007-05-16作者简介：吴洪福（1978-），男，黑龙江人，硕士研究生，研究方向为蛋白质分离纯化。
E-mail:chenyang69@吴洪福1,3，郭淑元2，李海涛1，高继国1（1.东北农业大学生命科学院，哈尔滨150030;2.北京理工大学生命科学与技术学院，北京100081;3.中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100094）摘要：对目前解析的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的三维结构进行了比较分析。
它们都有类似的结构，有三个结构域，结构域Ⅰ是由7个α螺旋以α5螺旋为中心形成的α螺旋束；结构域Ⅱ是由三个反平行β折叠形成的β棱柱；结构域Ⅲ是一个β“三明治”结构。
对这三个结构域的Loop 及氨基酸残基与杀虫活性的关系、与通道形成相关的杀虫作用机制的研究进展进行了综述。
关键词：杀虫晶体蛋白；结构域；Loop 中图分类号：S482.2+92文献标识码：A苏云金芽孢杆菌（Bacillus thringiensis ，Bt ）是一种革兰氏阳性（G +）细菌，它在形成芽孢的同时能产生伴孢晶体，又称杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins ，ICPs ），对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目昆虫及动植物寄生虫线虫等有特异性毒杀作用，而对人和家畜无害，不污染环境，在农林卫生害虫防治中应用广泛[1]。
杀虫晶体蛋白包括Cry 和Cyt 蛋白两大类。
Cry 晶体蛋白被敏感幼虫吞食后，在幼虫肠道碱性环境和蛋白酶的作用下释放出活性毒素，可与昆虫中肠上皮细胞的特异受体结合并形成孔道，破坏细胞渗透压平衡，最终导致昆虫死亡[1]。
本文对Cry 蛋白的结构与功能关系的相关研究进行综述。
1B t 杀虫晶体蛋白的结构解析和结构比较解析杀虫晶体蛋白三维结构的方法主要有两种：单对或多对同晶置换法（SIR/MIR ）和分子置换法（MR）[2]。
苏云金芽胞杆菌晶体蛋白2Ab32(Cry2Ab32)基因的克隆、表达与杀虫活性分析
包 涵 体 蛋 白采 用饲 喂 法 进 行 生 物 活 性 测 定 ， 结果表 明， Ｃ ｒ ｙ ２ Ａ ｂ ３ ２对 小 菜 蛾 （ Ｐ ｌ ｕ ｔ ｅ ｌ ｌ ａ ｘ ｙ ｌ ｏ ｓ ｔ ｅ ｌ ｌ ａ ） 、 玉 米 螟 （ Ｏ ｓ ｔ ｒ ｉ ｎ ｉ ａ ｆ ｕ ｍａ ｃ ａ ｌ ｉ ｓ ） ￥ ｒ ｌ 棉铃虫 （ Ｈ ｅ ｌ ｉ ｃ ｏ ｖ ｅ ｒ ｐ ａ ａ ｒ ｍｉ ｇ ｅ ｒ ａ ） 均 有杀 虫 活性 ， 半 致 死浓 度（ ｍｅ ｄ ｉ ａ ｎ ｌ ｅ ｔ ｈ ａ ｌ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ， ｃ 。 ） 分别为 ８ ． ９ ９ 、 １ ９ ． ３ ４ 和２ １ ． ２ ４ ｉ ｘ ｇ ／ ｍＬ ， 对 甜菜 夜 蛾 （ Ｌ ａ ｐ ｈ ｙ ｇ ｍａ ｅ ｘ ｉ ｇ ｕ ａ ） 的致 死 率 不 高 ， 但 能 明显 抑制 甜 菜 夜蛾 的生 长 。ｃ ｒ ｙ ２ Ａ ｂ ３ ２ 新 基 因 的发 现 将为 重 要 农业 害 虫 的防 治提 供 更 多选 择 ， 为 进 一步 研 究 Ｃ ｙ２ ｒ Ａｂ 类
ｆ ｒ ａ ｇ ｍｅ ｎ ｔ ｌ ｅ ｎ ｇ ｔ ｈ ｐ ｏ ｌ ｙ ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｉ ｓ ｍｓ ， Ｐ Ｃ Ｒ ． Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ ） 方 法 对 苏 云 金芽 胞 杆 菌 （ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｔ ｈ ｕ ｒ ｉ ｎ ｇ ｉ ｅ ｎ ｓ ｉ ｓ ） 菌株 Ｂ Ｎ２ ３ ． ５中
苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的制备方法
图 2 10 % SDS2聚丙烯凝胶电泳图 1～6 依次为 :等沉 HD273 、等沉 HD22 、等沉 HD21 、离心 HD273 、
沉淀 ,但它不仅简化了实验操作程序 、耗时短 ,而且其 纯度较高 。该方法的结论对于获取不同要求的 Bt 蛋 白做进一步研究具有一定的参考价值 。
苏云金芽孢杆菌产生的伴胞晶体是一种碱溶性 蛋白 ,由 cry 基因和 cyt 基因所编码 。在 p H 值高于 915 时大多数的 cry 毒素和 cyt 毒素溶解 ,少数需要 在 p H 12 时才能完全溶解 。因此选用了 p H 916 的 Na2CO3 缓冲液保证大多数的蛋白从菌体中溶出 。 21212 提取方法的影响
丙烯酰胺凝胶电泳 。10 %的分离胶 ,319 %的堆积胶 , 21112 摇床转速对 Bt 菌生长的影响
10 mA 保持 20 min 后加大电流至 30 mA ,当染料的
苏云金芽孢杆菌是好氧菌 ,培养该菌要有足够的
前沿迁移至凝胶的底部时结束 。考马斯亮蓝染色 10 氧气来满足它们的需要 ,所以培养基中的溶氧量越多
1 材料和方法
111 材 料 菌种 : 苏云金芽孢杆菌 ( B acill us t hu ri ngiensis)
HD21 ,HD22 和 HD273 菌株 ,南开大学保藏菌种 。 112 培养基
第一作者 :硕士研究生 。 3 2005 年中国工业微生物研讨会获奖论文 收稿日期 :2005 - 04 - 23
苏云金芽孢杆菌伴孢晶体纯化方法研究
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苏 云 金 芽 孢 杆 菌 伴 孢 晶 体 纯 化 方 法 研 究
蒋 辰 李 红 梅 。 弓 爱 君 邱 丽 娜 ， ， ，
一
分离 。重复 几 次 以尽 量 去 除 孢 子 。然 后 用 超 声 波 处
理 ， 芽孢 、 体 在 水 中均 匀 分 散 ［ ， １ ０ 离 心 使 晶 ５ 于 ００ ０ｇ ］ １ ￣２ ｎ 弃去 上清 液 ， 了消除 晶体 中内生 蛋 白酶 ０ ０ｍｉ ， 为 对 晶体 的非 特 异 降解 ， １ｍｏ ・ Ｎａ １ 用 ｌ Ｌ Ｃ 生理 盐水 洗 涤沉 淀 。Ａｕ ｕ ｇ ｓ用 １ｍｏ ・Ｌ Ｎａ １ ３ ℃ 洗 涤 ｌ Ｃ 于 ７
取新 鲜 固体斜 面培养 基 （ 肉膏 ３ｇ 蛋 白胨 １ ， 牛 ， ０ｇ
心纯 化
ｄ ｅ
喜
其 中蔗糖 密度梯度 离心 方法 简单 ， 本较低 ， 成 但蔗糖 溶
氯化钠 ５ｇ 琼脂 １ ～２ ， １０ ， ５ ０ｇ 水 ０ ０ｍＬ， Ｈ 值 ７ ４ ｐ ． ～ ７ ６ ， 别做好标 记 ， 无菌操 作方 法将待 接菌 种接 入 ． ）分 用
高速离 心法 和生物物 理法 等 。作 者在此 对这些 方法 进 行 了综 述 。
比较严格 。其 常用 的密 度试 剂 有 蔗糖 、 工 聚合 蔗 人
糖 （ ｉ ｌ 、 金 属 盐 （ ｓ １Ｎａ ｒ 、 化 密 度梯 度 介 Ｆｃ １ 碱 ｏ） ＣＣ、 Ｂ）碘
ｚ ａ ｉｍ ｉ
１ 伴 孢 晶体 粗 品 的 制 备
苏云金芽孢杆菌生物农药的制备、伴胞晶体的分离纯化及杀虫活性
JIUJIANG UNIVERSITY实验论文题目苏云金芽孢杆菌生物农药(Bt制剂)的制备、伴孢晶体的分离纯化及杀虫活性院系生命科学学院专业生物技术姓名樊晓乐、严学芬、王伟、周明宣、邹红虹班级B0933指导教师张炳火二零一一年十一月摘要：苏云金芽孢杆菌是目前世界上研究最多、产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂，具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、易生物降解及无残毒等优点。
本试验采用固体培养，对一株苏云金芽孢杆菌进行了发酵，制备了Bt制剂，对伴孢晶体进行了分离纯化，采用菜地试验，检测了Bt制剂和伴孢晶体对白菜虫害的防治效果。
关键词：苏云金芽孢杆菌（Bt）；伴孢晶体；杀虫活性前言苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌，其菌体为短杆状，生鞭毛，单生或形成短链。
它在芽孢形成过程中产生称为δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白(控制合成这种蛋白质的基因在质粒上），这些蛋白具有很高的杀虫活性。
Bt由于具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、生物降解无残毒、所用原料简单等优点，在虫害防治中发挥着越来越重要的作用，随着对Bt研究的深入，Bt的基因改造、毒理学研究、杀虫机理、对人类的安全性等方面的研究都对高纯度的Bt伴胞晶体提出了极大的需求。
因此，Bt伴胞晶体的分离纯化方法逐步得到了发展，如等密度梯度离心法、液体双相分离法、等电点沉淀法、离子交换分离法、碱裂解法、高速离心法和生物物理法等。
本实验采用2种液体培养基、2种培养条件对苏云金芽孢杆菌进行培养。
镜检观察当90％以上的芽孢脱落时处理菌体，经碱液裂解后比较等电点沉淀和液体双相分层法提取Bt蛋白的收率和纯度。
1 材料与方法1.1 菌种苏云金芽孢杆菌为九江学院生命科学学院微生物实验室保藏。
1.2 培养基种子培养基：牛肉膏0.5%,蛋白胨1.0%,NaCl 1.0%,调pH 7.2 左右,121℃灭菌30 min。
发酵培养基：牛肉膏0.5%,蛋白质 1.0%,葡萄糖0.3%,NaCl 0.2%, MgSO4·7H2O 0.03%, K2HPO4 0.03%, MnSO4 0.005%,调pH 7.5,121℃灭菌30min,灭菌后pH 7.3。
苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体杀虫剂研究进展
广东化工2021年第10期·86·第48卷总第444期苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体杀虫剂研究进展黄慧敏1，曾远婷1,2，王磊1*(1．华南农业大学材料与能源学院制药工程系，广东广州510642；2．深圳唯新生物科技有限公司，广东深圳518116)Research Progress of Bacillus Thuringiensis and its Parasporal Crystal InsecticidesHuang Huimin1,Zeng Yuanting1,2,Wang Lei1*(1.Department of Pharmaceutical Engineering,School of Materials and Energy,South China Agricultural University,Guangzhou510642；2.Shenzhen Weixin Biotechnology Company Limited,Shenzhen518116,China)Abstract:With the rapid development of economy in our country,we pay more attention to the ecological benefit of the development of agriculture and forestry. The biopesticide is widely used in agriculture and forestry because of its high efficiency,broad spectrum,environmental protection and bio-safety.Till now,the research on Bacillus thuringiensis has a history of more than100years.A kind of protein crystal could produced by Bacillus thuringiensis in the process of sporulation forming.In this paper,the application of Bacillus thuringiensis and its parasporal crystals in insect control was reviewed.Keywords:Bacillus thuringiensis；Parasporal crystal；Insecticide；Biopesticide；Agriculture and forestry development苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性菌，可产生伴孢晶体[1-2]，其相关产品杀虫作用高效，对人类无毒害，对环境无污染，目前在农业杀虫领域得到广泛的应用[3-4]。
苏云金芽孢杆菌的研究——综述
苏云金芽孢杆菌的研究摘要苏云金芽孢杆菌是目前应用最广泛、研究最深入、生产量最大的微生物杀虫剂。
目前已发现多种Bt亚种或血清型对害虫具有杀虫活性,同时也发现了一些新的杀虫晶体蛋白，通过纯化得到高效的杀虫晶体蛋白也是目前研究热点之一。
本文简要介绍了Bt的发展历史、晶体蛋白的纯化及在杀虫方面的一些应用。
关键词苏云金芽孢杆菌、历史、伴孢晶体、杀虫苏云金杆菌(Bacillu .thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，为昆虫病原细菌，其菌体为短杆状、有鞭毛，一般单生或形成短链。
在芽孢形成期可产生具有杀虫活性的伴孢晶体,且伴孢晶体(原毒素)对鳞翅目或双翅目等多种昆虫具有毒杀活性[15]。
苏云金杆菌是一种应用广泛的绿色环保型微生物杀虫剂，全世界年产值已突破1亿美元[1]。
自20世纪60年代实现工业化生产以来,已成为世界上用途最广、商业开发最成功、产量最大的微生物杀虫剂,每年以20%的速度增长[2,3]。
苏云金杆菌杀虫剂的稳定性较差、残效期短、杀虫速度慢等问题都待解决，关于苏云金芽孢杆菌的研究都将继续进行。
1Bt的发展历史1901年，日本学者石渡繁胤(Ishiwata)从虫尸体液中分离出苏云金杆菌猝倒变种(Bacillus.thuringiensis var.sott) 成为苏云金杆菌研究的起点[4]。
1911年，Berliner 发现一杆菌，并详细描述了该菌的形态和培养特征，定名为苏云金杆菌(Bacil-lus.thuringiensis)，指明苏云金杆菌含伴孢晶体(Paraspora crystl) 。
1938年，苏云金杆菌商品化，用于防治地中海粉螟。
20世纪50年代许多国家进行了商业性生产。
从发现该菌至今已有整整105年历史,世界上有超过万篇的研究报道,涉及生物学、分类命名、有效成分、杀虫机理、分子生物学、遗传学、产品化和安全性,包括近年来的转基因植物等诸多方面[5]。
1953年，Hannay第一次发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关，并和Fitz-James于1955年证实，伴孢晶体是一种蛋白质。
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苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白提取方法比较研究
罗朝辉;夏立秋;丁学知;王海龙;曾智
【期刊名称】《湖南师范大学自然科学学报》
【年(卷),期】2007(030)003
【摘要】采用液体双相分层法和等电点沉淀法提取苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白.原子力显微镜观测,发现液体双相分层提取的晶体蛋白具有完整典型的晶体结构;等电点法提取的得率高,不能检测到完整的晶体结构.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,等电点法提取的蛋白质含量是液体双相法提取的蛋白含量的1～2倍.将2种方法提取的晶体蛋白对初孵棉铃虫幼虫生物测定均表现杀虫生物活性,经统计分析,液体双相法提取的蛋白质生测毒力比等电点法的高1.5～3倍.
【总页数】5页(P94-98)
【作者】罗朝辉;夏立秋;丁学知;王海龙;曾智
【作者单位】湖南师范大学生命科学学院,微生物分子生物学湖南省重点实验室,中国,长沙,410081;湖南师范大学生命科学学院,微生物分子生物学湖南省重点实验室,中国,长沙,410081;湖南师范大学生命科学学院,微生物分子生物学湖南省重点实验室,中国,长沙,410081;湖南师范大学生命科学学院,微生物分子生物学湖南省重点实验室,中国,长沙,410081;湖南师范大学生命科学学院,微生物分子生物学湖南省重点实验室,中国,长沙,410081
【正文语种】中文
【中图分类】Q936
【相关文献】
1.拉曼镊子分析单个苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白 [J], 王桂文;姚辉璐;彭立新;何碧娟;黎永青
2.5种中国苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白基因分析 [J], 张光美;Raymo.,A
3.苏云金芽孢杆菌中华亚种CT—43菌株伴胞晶体蛋白的特性 [J], 孙明;喻子牛
4.苏云金芽孢杆菌的分离鉴定及伴孢晶体蛋白生物毒力效果分析 [J], 刘晨;王祯;朱先约;杨瑞;倪博立
5.14株苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白对猪蛔虫第3期幼虫的毒性比较 [J], 邓干臻;姚宝安;冯汉莉;袁林茂;周艳琴;李继州;郭玉红;喻子牛
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