粪肠球菌生长曲线的测定及其对小鼠脑组织的影响
屎肠球菌研究进展
屎肠球菌研究进展【摘要】屎肠球菌(Enterococcus Faecium)属肠球菌属,是人及动物肠道中正常菌群的一部分，在一定条件下可以致病，由于其耐药性强，目前对于屎肠球菌的治疗还没有什么很好的特效药。
在饲料应用上，屎肠球菌作为应用广泛的一类益生菌，进入宿主可产生多种益生功效。
本文主要对屎肠球菌的生理特征，致病性，耐药性，功能特性及其在仔猪上的应用进行了综述。
【关键词】屎肠球菌肠球菌耐药性功能免疫仔猪应用1.生理特征屎肠球菌属肠球菌属，是人及动物肠道中正常菌群的一部分，肠球菌为圆形或椭圆形、呈链状排列的革兰阳性球菌，无芽胞，无鞭毛。
生长温度为30℃～40℃，适宜pH为5.0～7.5。
最适生长温度为35～38℃。
屎肠球菌是兼性厌氧的乳酸菌，和大多数的乳酸菌一样，其耐酸性耐高温性等抗逆性能差。
2.致病性1998 年7月下旬至9月初, 江苏南通及其周围地区发生成批生猪发病, 数以千计病猪死亡；与病猪密切接触者也多人发病, 病原菌为肠球菌。
经中国药品生物制品检定所鉴定为屎肠球菌。
40例患者中男36例、女4例。
按临床表现分为轻症型7例, 脑膜炎型19例。
中毒性休克综合征型14例[1]。
屎肠球菌属于人体正常肠道菌群。
通常认为其毒力较弱, 较少引起人体感染, 只有抵抗力差或者儿童较容易感染，然而近年来，其感染所致发病率有逐年上升的趋势。
屎肠球菌对大多数抗生素耐药, 故临床治疗有一定的困难，其感染后的病死率高达22% ~ 73% 。
研究屎肠球菌耐药基因及毒力基因，探讨耐药机制及致病机制以寻找有效的治疗方法是预防和控制屎肠球菌感染最有效的方法[2]。
吴利先试验表明屎肠球菌临床感染株hyl基因阳性率明显高于非临床感染菌株, 从而认为hyl基因可能是屎肠球菌致病的毒力基因之一[3]。
hyl是一种侵袭性酶, 属于胞外酶, 它也是一种蛋白水解酶, 能特异性地分解细胞外基质成分透明质酸以协助细菌在组织内播散。
hyl可以通过破坏结缔组织间质中的透明质酸,分解结缔组织的蛋白多糖, 使细菌容易在组织中穿过而协助病原菌扩散。
细菌生长曲线的测定实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除细菌生长曲线的测定实验报告篇一：细菌生长曲线实验九测定细菌生长曲线[实验目的]1．了解细菌生长曲线特征：2．学习液体培养基的配制以及注意事项。
3．学习液体种子和固体种子的不同接种方法和注意事项。
4．利用细菌悬液浑浊度间接测定细菌生长。
[仪器和材料]1．实验材料(1)大肠杆曲，枯草杆曲培养液及大肠杆菌平板。
(2)牛肉膏蛋门胨葡萄糖培养基(150ml／250ml三角瓶x4瓶／大组)，配方：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，葡萄糖10g，加水至1000ml，ph7．5。
2．实验仪器取液器(5000μl，1000μl，200tμl各一支)；培养箱．摇床，722s分光光度汁；1000μl无菌吸头100个；5000μl 无菌吸头2(:细菌生长曲线的测定实验报告)个；1ml或4ml 玻璃或塑料比色皿4个，共用参比杯一个。
[实验原理]将一定量的细菌接种在液体培养基内．在一定的条件下培养，可观察到细菌的生长繁殖有一定规律性，如以细菌活菌数的对数作纵坐标，以培养时间作横坐标，可绘成一条曲线，称为生长曲线(图91)。
单细胞微生物发酵具有4个阶段，即调整(迟滞期)、对数期(生长旺盛期)、平衡期(稳定期)、死亡期(衰亡期)。
生长曲线可表示细菌从开始生长到死亡的全过程动态。
不同微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。
因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的．测定微生物生长曲线的方法很多，有血细胞计数法，平板菌落计数法，称重法和比浊法等。
本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与浑浊度成正比，因此，可以利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度。
将所测得的光密度值(测oD550或oD620或oD600或oD420，可任选一波长)与对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。
注意，由于光密度表示的是培养液中的总菌数，包括活菌与死菌，因此所测生长曲线的衰亡期不明显。
一株致病性粪肠球菌的分离与鉴定
14
福建畜牧兽医 第 41 卷 第 3 期 2019 年
吲哚 -
表 1 病原菌的生化反应结果
MR
三糖铁试验 葡萄糖 乳糖 麦芽糖 蔗糖 甘露醇 尿素分解酶
触酶试验
+
A/A -曰-
+
+
+
+
+
+
-
按 2000 年美国 NCCLS 药敏试验法规制备袁 采用 NCCLS 法规渊2000冤判定标准进行判定袁结果见表 2遥 1.2.4 动物试验 小鼠注射菌液后袁 可见其背毛逆 立袁精神沉郁袁食欲减退曰48 h 内小白鼠全部死亡袁 剖检均可见脑出血袁肝尧脾肿大袁肝表面有针尖大小 的出血点曰对照组均正常遥 1 日龄雏鸡注射菌液后袁 雏鸡死前症状表现为精神沉郁袁 食欲减退袁 走路不 稳袁剖检可见败血症变化曰对照组正常遥
rococcus faecium.
Key words Pathogenic bacterium Enterococcus faecium 16S rRNA Sequence analysis
肠球菌是人类和动物肠道正常菌群的一部分袁 通常在引起腹腔和盆腔感染所分离的混合菌中发 现袁以往认为肠球菌是对人类无害的共栖菌袁但近年 研究已证实了肠球菌的致菌力遥 在需氧革兰氏阳性 球菌中袁 它是仅次于葡萄球菌的重要院内感染致病 菌袁肠球菌亦可引起院外感染遥肠球菌不仅可引起尿 路感染尧皮肤软组织感染袁还可引起危及生命的腹腔 感染尧败血症尧心内膜炎和脑膜炎等[1]遥 本试验的病 原菌分离自 1 羽发病雏鸡的肝脏及心脏遥 1 病原菌的分离与鉴定 1.1 材料和方法 1.1.1 材料 病料来源于 1 羽发病雏鸡袁 其症状表 现为精神沉郁袁羽毛蓬松袁步态不稳袁剖检可见卵黄 吸收不良袁肝脏土黄色袁其他未见明显变化遥 病菌即 分离自该雏鸡的肝脏及心脏遥 1.1.2 方法 1.1.2.1 培养基的制备 血琼脂平板尧 麦康凯琼脂 平板尧普通琼脂平板尧营养肉汤液体培养基袁按常规 方法制备袁灭菌袁4 益冰箱保存袁备用遥 1.1.2.2 细菌分离 无菌取患鸡心脏及肝脏于血平 板琼脂培养基上划线袁37 益培养 24 h遥 而后袁挑取形 态一致的菌落进行纯培养遥 1.1.2.3 形态学观察 将纯培养细菌涂片袁 进行革 兰氏染色尧镜检袁观察细菌形态和着色情况遥 1.1.2.4 生化试验 纯化后的细菌分别进行吲哚尧 MR尧葡萄糖尧乳糖尧麦芽糖尧蔗糖尧甘露醇尧尿素分解 酶试验尧 枸橼酸盐利用试验及三糖铁培养基接种
粪肠球菌
鉴别要点
1.本菌特征 革兰阳性球菌，触酶试验阴性，在6.5%NaCl中生长，胆汁七叶苷试验阳性，45℃中生长 。 2.与链球菌属和乳球菌属的鉴别 肠球菌属能在pH9.6的肉汤和45℃环境中生长，胆汁七叶苷和盐耐受试验阳性，而链球菌属和乳球菌属则相 反。 3.与屎肠球菌、鸟肠球菌的鉴别 粪肠球菌不分解L-阿拉伯糖，分解山梨觅醇。屎肠球菌能分解Ⅰ-阿拉伯糖，不分解山梨醇。鸟肠球菌分解 L-阿拉伯糖、山梨醇 。 4.与铅黄肠球菌、鹑鸡肠球菌的鉴别 粪肠球菌不分解鼠李糖，亚碲酸盐试定验阳性，铅黄肠球菌、鹑鸡肠球菌则相反。铅黄肠球菌与鹑鸡肠球菌 的区别，铅黄肠球菌产黄色素鹑鸡肠球菌则不产 。
简介
细菌分类学上，肠球菌属早期并不存在，现今的一些菌种本归属于链球菌属。肠球菌在分类学上已经过多次 变迁。1930年，肠球菌被归入 D群链球菌。1984年，DNA-DNA杂交和 16SrRNA测序表明屎链球菌（S．faecium） 和粪链球菌（S．faecalis）与其他链球菌显著不同。同年，Schle-ifer等提出肠球菌应从链球菌中脱离出来， 形成一个新的肠球菌属（Enterococcus）。到目前为止，以 16SrRNA测序和 DNA-DNA杂交作为分类基础，该属 已增加到 28种之多。不久之后，可能还会重新分类 。粪肠球菌为该属中最常见的即为代表种。该属通常指粪便 来的可以用氮钠分离鉴定的一群革兰氏阳性球菌。由于肠球菌的菌种均含有Lancefield的D群抗原，亦称D群粪肠 球菌或D群肠球菌。肠球菌的DNA G+C含量33%-39%mol。
粪肠球菌属于动物肠道内的正常菌群，一般认为粪肠球菌对动物或人的机体无害，是一种共生菌。近年研究 已证实，部分粪肠球菌在长期进化中出现毒力基因，可引起广泛的感染。而且由于抗生素的长期和大量不规范使 用，粪肠球菌获得性耐药性不断上升，治疗粪肠球菌感染日益困难 。
粪菌移植对阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力的影响
粪菌移植对阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力的影响杨璐;关方霞;李庆华;许玲;刘雯雯;刘艳霞;黄团结;邢衢;李鹏;张乐【期刊名称】《郑州大学学报（医学版）》【年(卷),期】2017(052)006【摘要】目的:观察粪菌移植(FMT)对阿尔茨海默病模型小鼠(APP+转基因小鼠)学习记忆能力及脑内β淀粉样蛋白(Aβ)沉积的影响.方法:将15只小鼠分为APP-组、APP+组、FMT组,每组5只.对FMT组APP+小鼠进行FMT,每天1次,连续4周,APP+组及APP-组用生理盐水灌肠处理.4周后,通过Morris水迷宫实验观察各组小鼠认知能力和学习记忆能力;采用Western blot法检测小鼠脑组织中衰老相关蛋白(P21、P53、Sirt1、Sirt2、PCNA)的表达情况;采用刚果红染色法观察小鼠脑内Aβ沉积的变化情况.结果:与APP-组相比,APP+组小鼠逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少,目标象限停留时间减少(P<0.05).经FMT处理后,FMT组小鼠与APP+组小鼠相比,逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增多,目标象限停留时间延长,Aβ沉积减少,脑组织中衰老相关蛋白P21、P53表达减少,而Sirt1、Sirt2、PCNA表达增多(P<0.05).结论:FMT可以改善阿尔茨海默病小鼠的学习记忆能力,减缓衰老,减少脑组织Aβ沉积.%Aim:To study the effects of fecal microbiota transplantation(FMT) on learning and memory ability and amyloidβ-protein(Aβ) deposition in Alzheimer′s disease mice.Methods:A total of 15 mice were randomly allocated into APP -group, APP+group, and FMT group(n=5).The APP+mice in FMT group were treated with FMT for 4 weeks, while the mice in APP+group and APP-group were enemaed with normal saline.The learning and memory ability of mice was tested byMorris water maze.And then Western blot was employed to detect the expression of senescence related proteins (P21, P53, Sirt1, Sirt2, PCNA) in mice brain tissue, and the change of Aβdeposition in the brain was observed by Congo red staining.Results:Com-pared with the APP-group, the escaping latency of the APP+group was longer, while the times of crossing the platform quad-rant was less and the time of spending in the target quadrant was shorter(P<0.05).After FMT, the escaping latency of the mice was decreased, the times of crossing the platform quadrant and the time of spending in the target quadrant were increased (P<0.05).And the deposition of Aβin brain tissue of FMT group was reduced compared with the APP +group(P<0.05).Addi-tionally, the expressions of P21 and P53 in brain tissue of FMT group reduced, and the expressions of Sirt1, Sirt2 and PCNA in-creased significantly(P<0.05).Conclusion:FMT could improve the learning and memory ability of Alzheimer′s disease mice by slowing down its aging and reducing the formation of Aβdeposition in brain.【总页数】5页(P702-706)【作者】杨璐;关方霞;李庆华;许玲;刘雯雯;刘艳霞;黄团结;邢衢;李鹏;张乐【作者单位】郑州大学生命科学学院郑州450001;郑州大学生命科学学院郑州450001;郑州大学第一附属医院干细胞研究室郑州450052;郑州大学生命科学学院郑州450001;郑州大学生命科学学院郑州450001;郑州大学生命科学学院郑州450001;郑州大学生命科学学院郑州450001;郑州大学生命科学学院郑州450001;郑州大学生命科学学院郑州450001;郑州大学生命科学学院郑州450001;郑州大学生命科学学院郑州450001【正文语种】中文【中图分类】R592【相关文献】1.粪菌移植及联合果胶治疗对DSS诱导结肠炎小鼠的影响 [J], 胡庆;吕沐瀚;邓明明2.粪菌移植对DSS诱导的结肠炎小鼠内脏敏感性的影响 [J], 陈立;王承党3.粪菌移植对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠肠道功能及细胞因子的影响 [J], 王志豪; 李作孝4.人源性BACE2对阿尔茨海默病小鼠海马区淀粉样斑块形成及空间学习记忆能力的影响 [J], 刘希;郑娜;卢宏5.粪菌移植对慢加急性肝衰竭小鼠模型肠道菌群的影响 [J], 高安;徐玉静;陆圣威;孙蔚;甘建和因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大肠杆菌细胞生长曲线的测定实验难点
大肠杆菌细胞生长曲线的测定实验难点
大肠杆菌细胞生长曲线的测定实验涉及到多个步骤,其中有几个难点：
1. 培养基的选择：大肠杆菌在不同的培养基条件下生长的情况会有所不同,因此在进行生长曲线实验前需要选择一个合适的培养基。
同时,培养基的质量对实验结果也会有影响,需要注意使用新鲜的培养基。
2. 细胞密度的准确测定：测定生长曲线需要准确地确定细胞数量,但直接计数难度较大。
在实验中常用的方法是通过测量细胞培养液的浓度或浊度来间接估算细胞数。
但这些方法也有一定的局限性,需要严格按照方法操作并进行多次检测。
3. 实验条件的控制：细胞生长曲线的测定需要严格控制温度、湿度、氧气含量等多个生长条件。
如果实验条件不稳定,会导致数据的误差增大。
4. 数据处理的准确性：测量出的生长曲线数据需要经过统计学处理和分析,并进行可靠性检验。
在处理数据的过程中,需要避免人为因素的影响,以保证实验结果的准确性。
致羔羊脑炎粪肠球菌的分离鉴定
落， 革兰染 色镜检 ， 初 步筛 选 ， 将 培养 物 转接 于 Ｌ Ｂ鲜 血平 板 ， ３ ７℃ 恒 温 培 养 ２ ４ ｈ待 做 进 一 步 鉴 定 。将
４℃冷 增菌 的培 养 物划 线 接 种 于改 良亚 碲酸 钾 血 琼
将
１ ． １ ． １ 病料
分离菌株 接种 Ｌ Ｂ肉汤 ， 分别 置 １ Ｏ 、 ３ ７ 、 ４ ５ 、 ５ ０℃下 培
养、 并进行 ６ ５ ｇ ／ Ｌ Ｎ ａ Ｃ １ 耐盐 试验 、 ｐ Ｈ ９ ． ６耐 受 试 验 、
病 死羔羊 的肝脏 、 淋 巴结 、 脑脊液 等 。 １ ． １ ． ２ 培 养基
欣试验 、 美 蓝牛乳试验 等 。
１ ． ２ ． ３ 细 菌生化鉴定及 药敏 试验 用全 自动 细菌 鉴
鉴 定培养 基＿ １ 等。
１ ． １ ． ３ 主要仪 器及 试剂 ＶＩ Ｔ Ｅ ＫＩ Ｉ 全 自动 细 菌 鉴定
定仪 （ ＶＩ Ｔ ＫＥ Ｉ Ｉ ） 进行糖发酵 试验及药敏试 验 。
２ ０ １ １ 年 １ ２月 中旬 ， 新疆 乌 苏某 羊 场饲 养 的小 尾
１ ． ２ ห้องสมุดไป่ตู้ 法
寒 羊发生 了一 起 急性 传 染病 ， 出生 ２ ０余 天 的羔羊 陆
续 发生 了以 脑炎 为 主要 症 状 的死 亡 。发病 羔 羊 主要 表 现为体 温 升高 至 ４ １℃左右 ， 共 济 失调 ， 角 弓反 张 ， 病程 １ 周左 右 ， 先后死 亡 ３ Ｏ余 只 ， 但母 羊无 症 状 。剖 检 濒死期 羔羊见肝脏 、 脾脏 肿大 ， 胸腔 有积 液 ， 肺 脏呈
（ 石 河 子 大学 动 物 科 技 学 院 预 防兽 医 研 究 室 ， 新疆 石河 子 ８ ３ ２ ０ ０ ０ ）
条件治病菌之(粪)肠球菌研究观察
条件致病菌肠球菌摘要：肠球菌不像大多数的乳酸菌一样，它不被认为是“安全可靠”（GRAS）。
对于肠球菌的安全评价仍存有争议。
虽然肠球菌被认为是“积极“或在奶酪技术中有用，但它的隔离种群已经作为对人类的条件致病菌出现。
因此，这些细菌对发酵乳制品是否有益处于似是而非的地位，以为它存在有潜在的危险。
本篇综述是概述了肠球菌的积极的和消极的两种特性，并举例说明这个菌的具有争议的特性。
根据食品安全评价准则，我们提出对于每个潜在的技术应变逐个进行评估，并且建议肠球菌在发酵食品中使用前进行个别研究。
1.简介肠球菌最初列为D群链球菌，这种分类可以追溯到由兰斯菲尔德建立的计划。
1984年，肠球菌给予了新的位置被列为肠球菌属，在经过DNA-DNA和DNA-RNA杂交的研究后证明它与链球菌属有较远的关系(Schleifer and Kilpper-Balz, 1984)。
到目前为止32种已被提议列入肠球菌属（2005年10月26号)。
肠球菌种适宜在6.5％氯化钠，40％胆汁盐且pH值在9.6，并可以在60°C的环境下生存30分钟。
大多数品种也可以在10℃至45℃之间生长(Moellering,1992;Flahautet al.,1996)。
粪肠球菌和屎肠球菌都是人类消化道微生物自然存在的菌种，在胃肠道中因为个体差异其含量差异变化很大（在每克消化系统内容物中含有102和108）。
肠球菌通常从食品、植物、水和土壤中分离，可能由于它的来源是粪便使得他们的天性在恶劣环境中比较耐受(Giraffa,2002)。
在牛奶和奶酪制品中通常会找到粪肠球菌、屎肠球菌和少量的坚忍肠球菌，偶然也会发现小肠肠球菌和铅黄肠球菌。
不同于其他乳酸菌，肠球菌不能被认为是“一般认为安全”（GRAS），并且它在水中检测是作为粪便污染物的指标的(Godfree et al.,1997)。
一般认为对于肠球菌的安全评价程序是一个模棱两可的状况。
一方面，肠球菌在作为奶酪技术中作为发酵培养物被认为是由积极作用的(Giraffa,2003)；另一方面，它们被认为是新兴的人类病原体(Moellering,1992)。
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粪肠球菌生长曲线的测定及其对小鼠脑组织的影响王蒙蒙;张莉;李慧;汪骁轩;魏殿华;高静雯;高建鹏;张华雷;齐亚银【摘要】为测定致羔羊脑炎粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的生长曲线,寻求一种快速而准确的方法测定不同生长时期粪肠球菌数量,并客观评价其毒性强弱及其对小鼠脑组织的影响,试验采用平板菌落计数法和OD-Monitor振荡比浊法(Dλ值法)测定粪肠球菌的生长曲线,探究该菌在合适时间段内的吸光值(D600nm)与平板菌落计数法测定的活菌数(CFU)的关系.用粪肠球菌感染小鼠,观察记录小鼠的死亡情况,最后采用Karber法计算粪肠球菌感染小鼠的半数致死量(LD50).用LD50的剂量感染小鼠,及时采集死亡小鼠脑组织,未死亡的小鼠72h后全部剖杀取脑组织,一部分做涂片染色,制作病理切片,观察病理变化;一部分进行培养,用于PCR方法进行细菌的回收鉴定.结果显示,用两种方法测定此株粪肠球菌的生长曲线基本一致,在2～8 h生长迅速,为对数生长期,8～14 h生长缓慢,为稳定期,14h之后死亡数增加,进入衰亡期;对12h粪肠球菌D600nm与CFU的关系进行探讨,成功建立回归方程:y=20.769x-1.3422,R2 =0.997;其感染小鼠的LD50为7.77×1011个活菌.以此剂量感染小鼠,脑组织涂片染色和培养染色,均能看到革兰氏阳性球菌;PCR结果显示,均出现了大小为112 bp的条带.对脑组织进行病理学观察发现该菌可导致脑组织充血、出血、形成微血栓,脑膜充血.通过生长曲线和其D600nm与CFU关系的建立,可实时监测粪肠球菌数量,为后期更深入研究粪肠球菌穿越血脑屏障的机制奠定重要的理论基础.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2018(045)004【总页数】9页(P1041-1049)【关键词】粪肠球菌;Dλ值法;平板菌落计数法;半数致死量【作者】王蒙蒙;张莉;李慧;汪骁轩;魏殿华;高静雯;高建鹏;张华雷;齐亚银【作者单位】石河子大学动物科技学院,石河子832000;石河子大学动物科技学院,石河子832000;石河子大学动物科技学院,石河子832000;石河子大学动物科技学院,石河子832000;石河子大学动物科技学院,石河子832000;石河子大学动物科技学院,石河子832000;石河子大学动物科技学院,石河子832000;石河子大学动物科技学院,石河子832000;石河子大学动物科技学院,石河子832000【正文语种】中文【中图分类】S816.7粪肠球菌是革兰氏阳性菌,是人和动物肠道内正常菌群之一,其数量仅次于大肠杆菌[1]。
通常不引起发病,为一种重要的机会致病菌[2]。
中国农业部2017年公布的《允许使用的饲料添加剂品种目录》中，粪肠球菌作为一种饲料级微生物添加剂被成功收录。
史自涛等[3]、魏清甜等[4]、刘松等[5]报道了粪肠球菌替代抗生素添加到饲料中对仔猪和蛋鸡的生产性能等方面均有提高。
但近年来，由粪肠球菌引起的人和动物的疾病越来越普遍[6]，粪肠球菌是世界范围内医院感染的常见细菌[7],尤其是引起动物的脑炎[8]和脑膜炎的病例呈上升趋势[9-10]，给养殖业带来严重的经济损失，也给人们的健康带来巨大的隐患。
因此，研究粪肠球菌的致病机制迫在眉睫。
目前,国内外常用的测定细菌生长曲线的计数方法有很多种[11]，但每一种方法都有其弊端。
为寻求一种快速而又准确的方法实时监测粪肠球菌的数量变化,本试验以致羔羊脑炎粪肠球菌为研究对象,利用CFU和OD-Monitor振荡比浊法(Dλ值法)测定其生长曲线，并探究一定生长阶段内二者之间的关系,建立数学模型。
据此，选择合适生长阶段的细菌，培养所需的细菌数量，以小鼠为试验动物研究粪肠球菌的致病力强弱和对小鼠脑组织的影响，为进一步研究粪肠球菌如何穿越血脑屏障导致动物发生脑炎和脑膜炎的机制提供参考。
1 材料与方法1 材料1.1.1 菌株来源粪肠球菌由石河子大学动物科技学院传染病实验室保存。
1.1.2 试验动物体重为18～22 g的健康昆明系小鼠购自石河子大学实验动物中心。
1.1.3 主要试剂与仪器脑心浸出液肉汤(BHI)购自青岛高科园海博生物技术有限公司；PBS缓冲液(pH 7.2～7.4)购自Biosharp公司。
隔水式恒温培养箱(GH-600BC)购自北京市永光明医疗仪器厂；恒温培养振荡器(ZHWY_2102C)购自上海智城分析仪器制造有限公司；BioTek酶标仪(PowerWave XS2)购自基因有限公司。
1.2 方法1.2.1 菌液复苏将保存于-80 ℃冰箱的粪肠球菌取出依次放入-40、-20、-4和4 ℃的冰箱中解冻，采用分区划线法在BHI固体培养基上接种,37 ℃恒温培养箱培养过夜后得到单个菌落。
1.2.2 粪肠球菌生长曲线的测定1.2.2.1 根据D600 nm值测定生长曲线挑取单个菌落接种于盛有50 mL无菌的BHI液体培养基中放入37 ℃恒温培养振荡器中培养,每2 h取200 μL菌液，3 000 r/min离心10 min，弃去上清，用PBS悬浮，以PBS为空白对照测定其D600 nm值,每个时间点重复测3次，取平均值，连续监测24 h。
采用Excel 2010软件，以3次测定的D600 nm平均值为纵坐标、培养时间t为横坐标,绘制菌液的生长曲线。
1.2.2.2 根据平板菌落计数法测定生长曲线根据曹铁红[12]方法加以改进，挑取单个菌落接种于盛有50 mL无菌的BHI液体培养基中置于37 ℃恒温培养振荡器中培养,每2 h取100 μL菌液加入到盛有0.9 mL无菌BHI液体培养基的EP管中,混合均匀，依次做10倍倍比稀释，即分别稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，选取10-6、10-7、10-8 3个稀释度的菌液200 μL在BHI固体培养基上做平板涂布试验，每个梯度重复3次，将平板倒置于37 ℃恒温箱中培养12～24 h，记录每个平板上的菌落数，菌落个数在30～300个的平板计数有效。
取有效计数值的平均值根据公式(每毫升中总活菌数=同一稀释度3次重复的菌落平均数×稀释倍数×5)计算得出CFU值。
采用Excel 2010软件分别绘制出以时间t为横坐标、CFU为纵坐标的菌液生长曲线。
1.2.3 菌液CFU与D600 nm值相关性分析将该菌单个菌落分别接种于5 mLBHI液体培养基中，37 ℃恒温振荡器培养12 h。
参考黎满香[13]和徐凤等[14]方法将细菌培养液离心取菌体，用灭菌的PBS缓冲液悬浮,然后进行倍比稀释。
分别测定1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32不同稀释倍数各浓度的D600 nm值。
根据已知平板计数结果和倍比稀释所测得D600 nm值，采用Excel 2010软件绘制以CFU为横坐标、D600 nm值为纵坐标的标准曲线。
1.2.4 标准曲线准确度验证根据所得标准曲线方程,将生长曲线不同时段的D600 nm值代入方程式得出理论CFU值，并绘制出曲线与实际CFU生长曲线进行比较验证。
1.2.5 半数致死量的测定1.2.5.1 绝对致死量的测定将粪肠球菌菌液用四区划线法接种于BHI固体平板上，37 ℃恒温箱培养24 h后挑取单个菌落接种于无菌的BHI液体培养基中，37 ℃、180 r/min震荡培养18 h后离心菌体，用PBS缓冲液冲洗、悬浮，4 ℃保存备用。
取20只18～22 g的健康小鼠，随机均分为5组，每组4只。
第1～4组每只小鼠分别腹腔注射1.0×1010、1.2×1010、2.0×1010和2.6×1010 CFU/mL的菌液0.3 mL,第5组每只小鼠注射0.3 mL灭菌PBS缓冲液，连续观察48 h，记录小鼠的死亡情况。
根据试验结果，改变注射剂量直至摸索出致小鼠的绝对致死量(LD100)。
1.2.5.2 半数致死量的测定将培养好的菌液4 ℃、6 000 r/min离心10 min，用无菌PBS缓冲液清洗细菌沉淀2次，用PBS缓冲液制备细菌悬液[15]，使其浓度达到预试验摸索的LD100，然后进行10倍梯度稀释。
取36只18～22 g的健康小鼠，随机均分为6组,每组6只,分置6个清洁干燥的笼中饲养3 d无异常后，将5组不同稀释梯度的细菌悬液分别腹腔注射小鼠，每只小鼠注射0.3 mL；对照组腹腔注射0.3 mL灭菌PBS缓冲液，记录各组小鼠的死亡情况，将死亡小鼠及时剖检，观察腹腔变化，确定不是因腹腔感染而死。
最后将所得数据按寇氏法(Karber)[16]计算得出该菌的半数致死量(LD50)。
为确保试验结果的准确性，重复试验一次。
1.2.6 粪肠球菌对小鼠脑组织的影响用LD50的剂量感染小鼠，连续观察72 h，及时采集死亡小鼠脑组织，未死亡的在72 h后全部剖杀，取脑组织。
1.2.6.1 细菌鉴定无菌操作，取脑组织进行涂片，用瑞士染色法，待自然晾干后在显微镜下观察。
将脑组织取出后无菌接入灭菌的BHI液体培养基中，置于摇床中37 ℃、1 800 r/min培养18 h后取出，涂片，进行革兰氏染色，镜检；将剩余的菌液使用针对tuf基因(GenBank登录号：AF274736.1)设计的特异性引物(上游引物：5′-TACTGACAAACCATTCATGATG-3′；下游引物：5′-AACTTCGTCACCAACGCGAAC-3′)进行PCR鉴定，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
PCR反应体系20 μL：2×PCR Taq Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL，菌液1 μL，灭菌双蒸水补至20 μL。
PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min。
PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，出现大小为112 bp的特异性扩增条带为阳性，否则为阴性。
1.2.6.2 小鼠脑组织病理组织学观察取小鼠脑组织于10%福尔马林中固定24 h，脱水处理后按常规病理切片方法进行包埋后切片，然后用HE染色，显微镜观察病理变化(设置3只小鼠为空白对照)。
2 结果2.1 粪肠球菌生长曲线的测定结果粪肠球菌D600 nm值法测定生长曲线见图1。
由图1可知，粪肠球菌接种2 h后D600 nm值迅速上升直到8 h达到最大值,表明该菌处于对数生长期。
8～14 h曲线平缓趋于一条直线,表明细菌生长一直处于一种平稳的状态,进入稳定期。
14 h之后，曲线呈缓慢下降趋势，表明细菌进入了衰亡期。
粪肠球菌平板菌落计数法测定生长曲线见图2。