猪源粪肠球菌的分离_鉴定及应用_许光胜

中 国 兽 医 学 报 ２０１２年１１月 第３２卷 第１１期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｓｃｉ Ｎｏｖ． ２０１２ Ｖｏｌ．３２ Ｎｏ．１１
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猪 源 粪 肠 球 菌 的 分 离 、鉴 定 及 应 用
许光胜１，王喜亮２，吴 涛３，夏 昕２，范红结１＊ （１．南京农业大学 动物医学院，江苏 南京 ２１００９５；２．华 中 农 业
收 稿 日 期 ：２０１１－１０－２６ 基金项目：湖北省自然科学基金资助 项 目（２０１０ＣＤＢ１０１０１）；武
汉 市 科 技 攻 关 资 助 项 目 （２０１０２１０３７３７８－３） 作 者 简 介 ：许 光 胜 （１９６８－），男 ，博 士 。 ＊ 通 讯 作 者 ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｈｊ＠ｎｊａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１．８ 粪 肠 球 菌 特 性 研 究 １．８．１ 胆盐耐受性试验 菌株活化２代后，取１ｍＬ 接种 于 ９ ｍＬ 含 ０％，０．１５％，０．３％，０．５％ 胆 盐 ＭＲＳ肉汤 中，３７℃ 培 养 １２ｈ，稀 释 至 合 适 倍 数，取 ０．１ｍＬ 涂于 ＭＲＳ平板，观察生长情况。 １．８．２ 耐 酸 试 验 将 活 化 的 菌 种 以 ２％ 的 接 种 量 分别接种 ｐＨ 值 ２．０，２．５，６．４ 的 盐 酸 溶 液，３７℃ 静
１ 材 料 与 方 法
１．１ 分 离 材 料 金 黄 色 葡 萄 球 菌、猪 霍 乱 沙 门 菌、猪 致 病性大肠杆菌、大 肠 杆 菌 Ｋ８８、大 肠 杆 菌 Ｋ９９，由 华 中农业大学农业微生物学国家重点实验室提供。 １．３ 实验动物 湖北某规模 猪 场 的 仔 猪（３０ 日 龄）
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中 国 兽 医 学 报 ２０１２年１１月 第３２卷 第１１期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｓｃｉ Ｎｏｖ． ２０１２ Ｖｏｌ．３２ Ｎｏ．１１
１２０ 头 。 １．４ 粪肠球菌的 分 离 用 灭 菌 棉 拭 子 从 肛 门 采 集 健康猪的直肠 内 容 物，在 ＫＦ 链 球 菌 琼 脂 培 养 基 上 划线培养。３７℃、２４～４８ｈ 培 养 后，呈 红 色，光 滑 凸 起，周 边 整 齐，１ ｍｍ 左 右 大 小 的 菌 落 作 为 疑 似 菌 落 ，对 其 进 行 革 兰 氏 染 色 、过 氧 化 酶 试 验 进 行 初 步 筛 选。细菌呈单在、成 双 或 短 链 排 列 的 卵 圆 形 革 兰 阳 性 球 菌 且 过 氧 化 酶 试 验 阴 性 的 菌 株 ，作 纯 培 养 保 存 。 １．５ 生理生化鉴 定 按 粪 肠 球 菌 的 生 理 生 化 鉴 定 试验要求进行鉴定 。 ［３］ １．６ 分 子 生 物 学 鉴 定 １．６．１ 细菌 总 ＤＮＡ 的 提 取 对 通 过 生 化 鉴 定 初 步筛选出 的 粪 肠 球 菌，用 试 剂 盒 （ＴＩＡＮＧＥＮ）提 取 其总 ＤＮＡ，进行进一步确证。 １．６．２ １６ＳｒＲＮＡ 的 ＰＣＲ 扩 增、ＰＣＲ 产 物 纯 化 和 测序引物为通用引物：
＊ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｈｊ＠ｎｊａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
抗 生 素 在 动 物 疾 病 防 治 、提 高 饲 料 利 用 率 、促 进 畜禽生长等方面发挥了重要作用。但随着抗生素的 大 量 使 用 ，特 别 是 不 科 学 地 滥 用 ，导 致 耐 药 菌 株 的 大 量 产 生 、动 物 正 常 菌 群 失 调 、畜 产 品 中 药 物 残 留 等 问 题，严重危害养 殖 业 健 康 发 展，影 响 人 类 食 品 安 全， 引起世界各国政府及业内人士的高度重视。益生菌 作为 一 种 无 毒、无 害、无 残 留、无 抗 药 性 的 绿 色 饲 料 添加剂已成为动物疾病防治研究的一个新方向。 益生菌研究的关键问题是菌株筛选。长期的进
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｔｕｍ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ ｐｉｇｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，１６ＳｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｅｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，
大学 动物医学院，湖北 武汉 ４３００７０；３．武汉工业学院，湖北 武汉 ４３００２３）
摘要：通过培养特征、形态观察、生理生化鉴定、１６ＳｒＤＮＡ 序列分析和种 特 异 性 片 段 扩 增 等 方 法 ，从 健 康 猪 直 肠 内 容 物中分离到３株粪肠球菌，其中菌株 ＮＡ１４对常见病原微生 物 具 有 较 强 的 拮 抗 能 力 ；进 一 步 研 究 表 明 该 菌 株 具 有 较 强的耐 受 人 工 胃 液 和 耐 胆 汁 的 能 力 ，能 够 耐 受 ６０℃、３０ ｍｉｎ；动 物 试 验 表 明 饲 料 中 添 加 该 粪 肠 球 菌 能 够 降 低 仔 猪 腹 泻 ，改 善 仔 猪 生 产 性 能 ，增 强 猪 瘟 疫 苗 的 免 疫 效 果 ；因 此 该 菌 株 作 为 动 物 益 生 菌 具 有 好 的 应 用 前 景 。 关 键 词 ：猪 ；粪 肠 球 菌 ；分 离 鉴 定 ；益 生 菌 中 图 分 类 号 ：Ｓ８５２．６１１ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１００５－４５４５（２０１２）１１－１６４５－０６
Ｆ： ５′－ＣＧＴＧＣＣＴＡＡＴＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡ －Ｃ３′； Ｒ：５′－ＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＣＡＡＴＣＡＴＣＴＡＴＣＣ －３′。
ＰＣＲ反应体系：１０×ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋ ）３μＬ；２．５ｍｍｏｌ ｄＮＴＰｓ ０．５μＬ；上下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各 ０．５μＬ；基 因组 １μＬ；Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 ０．２５μＬ；灭 菌 蒸 馏 水 １９．２５μＬ。ＰＣＲ 条 件 为：程 序 设 定 为：９４℃ ５ ｍｉｎ； ９４℃ １ ｍｉｎ，５５℃ １ ｍｉｎ，７２℃ １ ｍｉｎ，３０ 个 循 环；后 ７２℃ 延 伸 １０ ｍｉｎ。 预 期 扩 增 的 片 段 大 小 为 １ ４７５ｂｐ。 用 ＤＮＡ 纯化试剂盒（ＴＩＡＮＧＥＮ）对其进行纯化，并 对其测序，将测序结果在 ＮＣＢＩ中进行比较。 １．６．３ 粪肠球菌 种 特 异 性 片 段 扩 增 确 证 粪 肠 球 菌的种特 异 性 片 段 为 ｄｄｌＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ［４］。 以 肠 球 菌 的基因 组 为 模 板，设 计 ｄｄｌＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ 片 段 的 引 物 序列 为：Ｅ１：５′－ＡＴＣＡＡＧＴＡＣＡＧＴＴＡＧＴＣＴＴ－３′； Ｅ２：５′－ＡＣＧＡＴＴＣＡＡＡＧＣＴＡＡＣＴＧ－３′。
化、与宿主形成的共生关系，使得来源于本动物的 益 生菌能 够 更 好 的 适 应 其 体 内 环 境，发 挥 更 好 的 效 果 。 ［１－２］ 本研究拟 从 健 康 猪 直 肠 内 容 物 中 筛 选 猪 源 粪肠球菌，通过 对 其 生 物 学 特 性 研 究 及 动 物 试 验 验 证其功效，为其 作 为 猪 用 微 生 态 饲 料 添 加 剂 奠 定 基 础。
ＰＣＲ 程序设定为：９４℃ ５ｍｉｎ，９４℃ １ｍｉｎ，５７℃ １ｍｉｎ，７２℃ １ｍｉｎ，３０个循环后７２℃延伸１０ｍｉｎ。 １．７ 抑 菌 性 能 筛 选 将 确 证 的 粪 肠 球 菌 菌 株 于 ＭＲＳ培养基，置３７℃，培养 １６ｈ，离 心 培 养 液，取 上 清，采 用 管 碟 法，分 别 对 金 黄 色 葡 萄 球 菌、沙 门 菌 和 大肠杆菌作抑 菌 试 验，测 量 抑 菌 圈 大 小。 选 取 抑 菌 效果好的菌株进行生理特性研究。
ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ＮＡ１４ｈａｖｅ ａ ｍｏｒｅ ｃｏｍｍｏｎ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｃａｐａｃｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ．Ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｈａｖｅ ｓｈｏｗｎ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｈａｓ ａ ｓｔｒｏｎｇ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｇａｓｔｒｉｃ ｊｕｉｃｅ ａｎｄ ｂｉｌｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｂｉｌｉｔｙ，ｃａｎ ｗｉｔｈｓｔａｎｄ ６０℃ ，３０ ｍｉｎ．Ａｎｉｍａｌ ｔｅｓｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ｃａｎ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｐｉｇｌｅｔ ｄｉａｒｒｈｅａ，ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ＮＡ４ｈａｖｅ ａ ｗｉｄｅ ａｐｐｌｉｃａｔｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔ ａｓ ａｎ ａｎｉｍａｌ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｉｇ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ｆｒｏｍ ｐｉｇｓ
ＸＵ Ｇｕａｎｇ－ｓｈｅｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｘｉ－ｌｉａｎｇ２，ＷＵ Ｔａｏ３，ＸＩＡ Ｘｉｎ２，ＦＡＮ Ｈｏｎｇ－ｊｉｅ１＊ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９５，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ；３．Ｗｕｈａｎ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ Ｕｎｉ－ ｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００２３，Ｃｈｉｎａ）
置培养。取接种０，０．５，１，１．５，２ｈ 的 培 养 液，稀 释 至合适倍数，取 ０．１ ｍＬ 涂 于 ＭＲＳ 平 板，观 察 生 长 情况。 １．８．３ 高温耐受性试验 ＭＲＳ 液体中接种 ２％ 已 活化的 菌 种，３７℃ 条 件 下 培 养 ３～４ｈ。 菌 液 经 过 ６０～７０℃ 的 热 处 理，３７℃ 设 为 对 照，经 过 ０，５，１０， １５，２０ｍｉｎ后将菌液稀释合适的倍数，用 ＭＲＳ 平 板 测其含菌数。 １．８．４ 生长曲线 的 测 定 将 活 化 好 的 粪 肠 球 菌 按 １％的接种 量 接 入 ＭＲＳ 肉 汤 中，３７℃ 静 置 培 养，每 隔 ２ｈ 取 样 ，以 平 板 计 数 估 算 其 生 长 状 况 ；以 时 间 为 横 坐 标 ，细 菌 的 对 数 为 纵 坐 标 绘 制 生 长 曲 线 。 １．９ 抗生素 敏 感 性 试 验 采 用 Ｋ－Ｂ 纸 片 扩 散 法， 选取 了 青 霉 素、氨 苄 西 林、万 古 霉 素、红 霉 素、四 环 素、环丙沙星、诺氟沙星、呋喃妥因、氯霉素等 ８ 种抗 菌 药 物 进 行 药 敏 试 验。 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ＡＴＣＣ２５９２３ 作 为 质 控 菌 ，试 验 操 作 及 判 断 标 准 参 照 ＮＣＣＬＳ（２００９ 版 ）最 新 版 本 的 标 准 进 行 。 １．１０ 粪肠球 菌 饲 料 添 加 应 用 研 究 将 １２０ 头 ３０ 日龄健康仔猪随 机 分 为 ２ 组，分 别 为 对 照 组 和 试 验 组，每组６０ 头。２ 组 仔 猪 体 质 量 初 始 无 显 著 差 异。 对照组饲喂常规 饲 料 （不 含 抗 生 素），试 验 组 饲 喂 添 加０．０２％的粪肠球菌（含 量 为 １０１０ ＣＦＵ／ｇ）的 饲 料。 饲 粮 消 耗 量 采 用 逐 日 计 量 方 法 ，计 算 平 均 日 增 重 、耗 料量和料肉比等，并统计腹泻率及死亡率。 另 外，猪 瘟疫苗按猪场常规免 疫 程 序，饲 喂 后 １０，３０ｄ，所 有 试验猪静脉采 血，分 离 血 清，采 用 猪 瘟 ＥＬＩＳＡ 试 剂 盒按说明书要求检测血清中猪瘟抗体。数据统计处 理采用 ＳＰＳＳ统计软件１３．０，进行方差分析。