致鹅败血症粪肠球菌的分离鉴定
长春及周边地区鹅致病性大肠杆菌的分离鉴定及敏感药物筛选
2018年第9期 吉林畜牧兽医5·实验研究·ShiYan YanJiu长春及周边地区鹅致病性大肠杆菌的分离鉴定及敏感药物筛选姚佳鑫，许祺珺，刘嘉怡，张国强，薛晶晶，赵立峰*吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118摘 要：为了给长春及周边地区鹅大肠杆菌病提供可行用药方案，本研究采集230份疑似大肠杆菌病患鹅的心、肝、脾等组织，进行病原学检测。
经过分离培养、纯培养、显微镜镜检、生化试验及分子生物学试验，其中190份被鉴定为大肠杆菌。
选用52种临床常用抗菌药物进行体外药敏试验，药敏试验结果表明：分离菌株对庆大霉素、阿莫西林、盐酸土霉素、诺氟沙星产生耐药性，对硫酸粘菌素、阿米卡星、磷霉素钠和氧氟沙星高度敏感。
关键词：鹅；大肠杆菌病；药敏试验鹅大肠杆菌病（goose E.colidisease,GED）是由致病性大肠杆菌引起的局部或全身性感染的细菌性疾病，各种年龄的鹅均可感染，感染率5%～30%不等，病死率在90%以上[1]。
临床上以脐炎、眼结膜炎、气囊炎、心包炎和败血症等为主要特征。
为了预防细菌性传染病，许多鹅场长期投喂抗生素药物，致使致病菌产生耐药性。
因此，有必要对病鹅进行药敏试验以确定敏感药物，进行合理的投药，使大肠杆菌病用药更有针对性。
本研究从长春及周边地区鹅场共收集230份病料，共分离得到190例致病性大肠杆菌样本，其中长春32例、双阳32例、松原30例、舒兰20例、白城18例、德惠12例、公主岭10例、农安10例、辽源8例、吉林6例、四平6例、龙昭6例。
对分离获得的菌株进行了敏感药物筛选，具体过程如下。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 病料来源于松原、通化、白城、舒兰、双阳、农安等多个地区的多家养殖场的疑似大肠杆菌病患鹅。
患鹅临床主要表现为食欲减退，精神沉郁，生长停滞，消瘦，拉白色稀粪。
鹅眼睑肿胀流泪，眼圈周围的羽毛被浸湿，瞳孔逐渐出现白色浑浊，角膜浑浊，眼球时有萎缩、坏死、失明。
健康婴儿粪便中粪肠球菌的分离鉴定与体外安全性评价
健康婴儿粪便中粪肠球菌的分离鉴定与体外安全性评价桑微1，李国花1，赵馨1，马雨哲1，钱卫生2，鲁曦1*（1.陕西科技大学食品科学与工程学院，陕西西安710021）（2.空军军医大学唐都医院室，陕西西安710038）摘要：为筛选出符合安全要求的粪肠球菌，该研究以采集的1月龄健康婴儿粪便样本为研究对象，采用MRS 分离纯化和16S rRNA测序进行菌种鉴定，共鉴定出64株粪肠球菌。
该研究对其中16株菌进行体外安全性评价，分别考察其溶血性、抗生素敏感性和6种毒力基因。
结果发现16株粪肠球菌均未出现β溶血现象；药敏试验发现菌株对四环素（56.25%）、红霉素（43.75%）耐药率较高，青霉素（37.50%）和环丙沙星（31.25%）次之，未发现万古霉素和替考拉宁耐受菌株；继上述实验获得的8株相对安全菌株进行毒力基因检测，共检出5种毒力基因：ace、asal、efaA、cylA、gelE，以ace＋efaA＋gelE＋为主要携带模式；综合评价后最终得到4株粪肠球菌候选菌株，编号为：LX29、LX31、LX41、LX50，可为后续的功能性研究和产品开发奠定基础。
关键词：粪肠球菌；抗生素耐药性；毒力基因文章编号：1673-9078(2024)03-83-90 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2024.3.0273Isolation, Identification, and in Vitro Safety Evaluation of Enterococcusfaecalis in the Stool of Healthy InfantsSANG Wei 1, LI Guohua1, ZHAO Xin1, MA Yuzhe1, QIAN Weisheng2, LU Xi1*(1.School of Food Science and Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi’an 710021, China)(2.Tangdu Hospital, Air Force Medical University, Xi’an 710038, China)Abstract: To screen for safe strains of Enterococcus faecalis, stool samples were collected from healthy 1-month-old infants and strains were cultured in MRS medium. A total of 64 E. faecalis strains were identified via 16S rRNA sequencing.Among them, 16 were selected for in vitro safety evaluation, and their hemolytic property, antibiotic sensitivity, and six virulence genes were determined. Based on the hemolysis results, the 16 strains of E. faecalis did not exhibit β-hemolysis.Further, the antibiotic sensitivity tests revealed that the strains were highly resistant to tetracycline (56.25%) and erythromycin(43.75%), followed by penicillin (37.50%) and ciprofloxacin (31.25%). No vancomycin- and teicoplanin-resistant strainswere found. Eight relatively safe strains were identified based on the above experiments, and five virulence genes: ace, asal, efaA, cylA, and gelE, were subsequently determined, with ace+efaA+gelE+ as the dominant mode. Finally, four candidate引文格式：桑微,李国花,赵馨,等.健康婴儿粪便中粪肠球菌的分离鉴定与体外安全性评价[J] .现代食品科技,2024,40(3):83-90.SANG Wei, LI Guohua, ZHAO Xin, et al. Isolation, identification, and in vitro safety evaluation of Enterococcus faecalis in the stool of healthy infants [J] . Modern Food Science and Technology, 2024, 40(3): 83-90.收稿日期：2023-03-07基金项目：国家自然科学基金项目（31970115）；陕西省重点研发计划（2022NY-030）作者简介：桑微（1999-），女，硕士研究生，研究方向：益生菌基础与应用，E-mail：通讯作者：鲁曦（1983-），男，博士，副教授，研究方向：益生菌资源开发与利用，E-mail：83strains of E. faecalis, namely LX29, LX31, LX41, and LX50, were acquired after comprehensive evaluation. Overall, our findings lay the foundation for subsequent functional research and product development.Key words:Enterococcus faecalis; antibiotic resistance; virulence gene肠球菌是广泛存在于自然界的一类乳酸菌，具有高pH和高盐耐受性，参与营养物质代谢，能产生细菌素抑制病原体生长，在食品发酵、防腐以及动物饲料等领域发挥重要作用[1] ；同时作为定殖于消化道的共生菌，具有调节人体和动物的免疫系统、维持肠道内稳态等功能，已被推荐作为益生菌食品添加剂和治疗肠道菌群失调及其它疾病的备选菌种[2] 。
种鹅大肠杆菌的分离鉴定及药敏实验
肠粘膜 、 输卵管粘膜及 腹水分别 接种于普通琼脂 平板 、 麦康 凯琼脂平板 、 鲜血琼脂平板 ， ３ ７ ￣ Ｃ 有氧条件 下培 养 ２ ４ ｈ ， 并观
察 其生 长情况 ， 对初次分离培养的细菌 ， 涂片 、 染色 、 镜检、 观 察 分离 菌在不 同培养基的生长情况及菌落情况 。 纯培养后挑
凝 固的蛋 白或卵黄小块 。 ２ ． ２ 病理 解剖 母鹅： 病 变主要特征是卵巢 卵泡引起变性 、 变色、 变 形。病情严重 者，即引起卵黄性 腹膜炎 ， 并 出现腹 水， 解剖 时可 闻到一种特殊异味。 肺充血或出血 ， 甚至形 成肝
２ ． ６ 药敏试验结果表明 该 菌对头孢噻肟钠 、阿米卡星 、 丁
或灰黄色小点。输 卵管内有时有干酪样 物Байду номын сангаас 留， 小肠钻膜充
４ ． １ 立即淘汰外生殖器病变严重 的公鹅和发病母鹅。
４ ． ２ 制备成大肠杆 菌灭 活苗进行免疫注射 。 ４ ． ３ 加强对饲养场地和动物饮水 的消毒措施 ， 经常清除场 内
血和出血。个别病鹅发现肝半边萎缩 ， 上有皱纹状。公鹅： 除 阴茎外面有出血和脓 泡外 ， 有时在其 内部亦有 出血斑 和千酪
样坏死物。 此外 ， 在输精管囊状扩大部亦发现有坏死病灶。 其
的粪便并进行发酵处理 ， 对场地进 行消毒 。
４ ． ４ 饲料 中适 当添 加蛋 白性饲料 、 维生 素及 微量元素 ， 合理
牛源粪肠球菌的分离鉴定及药敏试验
牛源粪肠球菌的分离鉴定及药敏试验作者：彬彬郭继文来源：《农民致富之友》2010年第20期肠球菌属(Enterococcus)细菌为兼性厌氧的革兰氏阳性球菌，是人、犬、禽、猪、马等动物胃肠道正常菌群之一，也广泛分布于土壤、水和食物中。
长期以来被认为致病力较低而未引起重视，但近年来，肠球菌属条件致病菌所致感染的发生率持续升高，尤其在原有严重基础疾病及机体免疫力降低时，极易侵入体内或易位，导致局部或全身重症感染，给临床治疗带来困难。
１材料与方法１.1材料１.1.1粪样选自黑龙江垦区某农场的40头健康荷斯坦泌乳牛，采集其新鲜粪便作为试验材料。
１.1.2培养基血平板、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、普通营养琼脂、麦康凯琼脂、SS琼脂、葡萄糖肉汤、营养肉汤、生化鉴定管等均购自广东环凯生物科技有限公司。
１.1.3试验动物18～26 g健康的小白鼠。
１.2方法１.2.1粪样的采集肛门式采集。
用无菌橡胶手套直接从试验牛的肛门采集新鲜粪样，分别装入无菌蓝盖试剂瓶中，立即送实验室4 ℃保存备用。
１.2.2细菌的分离鉴定１.2.2.1细菌的分离纯化培养将新鲜粪样接种于葡萄糖肉汤中，置37℃，18～24h，进行增菌培养。
再将肉汤培养物接种到KF链球菌琼脂上，置37℃，培养24h。
将可疑菌落进行涂片、革兰氏染色、镜检。
并接种于胰蛋白胨大豆琼脂、营养琼脂、血平板、麦康凯琼脂和葡萄糖肉汤、营养肉汤培养基中，置37℃培养18～24h，观察菌落生长状况。
观察细菌生长状况以及菌落形态特征，并将其进一步纯化培养。
将所得纯培养物置胰蛋白胨大豆琼脂斜面保存备用。
１.2.2.2触酶试验从固体培养基上挑取1接种环待检菌,置于洁净玻片上，再滴加3%过氧化氢一大滴，立即观察结果。
在30s内产生大量气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。
１.2.2.3溶血试验用平板法测定分离菌的溶血特性，即取分离菌接种于血平板上，于37℃培养24 h后观察菌落周围溶血现象。
致鹅败血症粪肠球菌溶血素激活因子基因克隆及序列分析
致鹅败血症粪肠球菌溶血素激活因子基因克隆及序列分析狄婷婷;高原;聂鑫【摘要】To understand the genetic variation of cytolysin activator(CylA) gene in Enterococcus faecalis , 2 pairs of specific primers were designed and synthesized according to the CylA gene sequence from GenBank for the 4 clinical isolates causing goose septicemia. The CylA gene was cloned into pMD18-T vector, and the recomfainant plasmid was screened to sequence and compared with the CylA genes of 4 pathogenic Enterococcus faecalis from patients in foreign countries and pigs in China respectively. The homology was alignmented and phylogenetic tree was reconstructed with Lasergene 7. 0. Result showed that CylA genes of 4 strains from goose were average 1 239bp in average, where was a completed open reading frame encoding 412 amino acids. No deletion and insertion in sequences, while only one nonsense mutation did not cause the variation of amino acid. There was not much variation in the remaining 8 strains of CylA gene and the deduced amino acids. The amino acids deduced by these CylA genes of 4 strains from goose shared 100 % homology. They were also close to the amino acids deduced by CylA genes of bacteria from patients in foreign countries and pigs in China, sharing the homologies of 98. 6% to 100%. These results indicate that CylA gene in Enterococcus faecalis is highly conserved, which is likely to become the target genes of detection and diagnosis as well as immunoprophylaxis.%目的了解粪肠球菌溶血素激活因子(CylA)基因的遗传变异情况.方法根据GenBank上已发表的粪肠球菌CylA基因序列设计2对特异性引物,对临床分离的4株致鹅败血症粪肠球菌CylA基因进行克隆及序列测定,并与国外从人体分离的和国内从猪体分离的各4株致病性粪肠球菌的CylA基因,用LaSergene 7.0软件进行同源性比对和构建系统进化发育树.结果鹅源4株茵CylA基因均长1 239bp,有1个完整的开放阅读框,编码412个氨基酸；序列中无缺失和插入,仅有l处未引起其编码氨基酸变异的无义突变.其余8株菌CylA基因及推导的氨基酸变异程度均不大.4株鹅源菌CylA基因推导的氨基酸同源性为100％；与国外人源菌和国内猪源菌CylA基因推导的氨基酸遗传距离也较近,同源性为98.6％～100％.结论粪肠球菌CylA基因高度保守,有可能成为检测诊断和免疫预防的靶基因.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2012(028)007【总页数】6页(P683-688)【关键词】鹅;粪肠球菌;溶血素激活因子;克隆;同源性比对;系统进化发育树【作者】狄婷婷;高原;聂鑫【作者单位】内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古高校毒物与动物疾病监控重点实验室培育基地,通辽028042;内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古高校毒物与动物疾病监控重点实验室培育基地,通辽028042;内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古高校毒物与动物疾病监控重点实验室培育基地,通辽028042【正文语种】中文【中图分类】R378肠球菌引起医院内病人感染和死亡的例数正在逐步增加［1］，其致病菌主要是粪肠球菌［2－3］。
鸽源屎肠球菌的分离鉴定及药敏试验
切胶 送 生 工生 物 工 程 （ 上海 ） 股份有限公司进行测序 ； 将 测 定
进 行 同 源 性对 比 。
球菌 （ Ｅ ． ｆ ａ ｃ ａ ｌ ｉ ｓ ） 、 屎肠球 菌 （ Ｅ ． ｆ ａ ｅ ｃ ｉ ｕ ｍ） 、 鸡肠 球菌 （ Ｅ． ｇ ａ ｌ ｌ ｉ ｎ ａ ｒ ｕ ｍ） “ 。肠 球 菌 可 以 感 染 各 种 年 龄 阶 段 的禽 ， 其中
屎 肠 球 菌 临 床 上 能 引 起 禽 的 败 血 症 。 屎 肠 球 菌 在 鸡 的 饲 养 环 境 中也 普 遍 存 在 ， 能 够 引 起 各 种 日龄 的 鸡 发 病 。本 次 屎 肠 球 菌 感 染 鸽 主 要 表 现 为 精 神沉 郁 、 食欲下 降、 机 体 消瘦 、 腹 泻、 零星死亡 ， 可 初 步 断 定 为 慢 性感 染 的 表现 形 式 。 本实验从鸽的肝脏分离到 ２ 株 肠 球 菌 属 中 的屎 肠 球 菌 ， 并 对 其 生 物 学 特 性 进 行 了相 关 研 究 ， 现将其报告如下 。
１ ． ２ ． ４ 药敏试 验 ： 采用 纸片琼脂扩 散法 ， 药敏纸 片有 ： 菌 必 治（ ３ ０ Ｆ ｇ ／ 片） 、 氟哌酸 （ １ ０ ｇ ／ 片） 、 氯霉 素 （ ３ ０， ｔ ｔ ｇ ／ 片） 、 卡 那 霉素 （３ ０ ｕ ｇ ／ 片） 、 左 氟沙 星 （ ５ ｇ ／ 片） 、 丁 胺 卡 那 霉 素
１ ０ ａｉ ｒ ｎ ， 置 于 冰上 １ ０ ｍｉ ｎ ， １ ２ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ离 心 １ ０ ｍｉ ｎ ， 取 上 清 液作 为 Ｐ Ｃ Ｒ模 板 ； 根据 １ ６ Ｓ ｒ Ｄ ＮＡ Ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｌ Ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｐ Ｃ Ｒ Ｋ ｉ ｔ 说 明 书进 行 Ｐ Ｃ Ｒ扩增 ， 经 琼 脂 糖 凝 胶 电泳 鉴 定 后 ，
一株致病性粪肠球菌的分离与鉴定
14
福建畜牧兽医 第 41 卷 第 3 期 2019 年
吲哚 -
表 1 病原菌的生化反应结果
MR
三糖铁试验 葡萄糖 乳糖 麦芽糖 蔗糖 甘露醇 尿素分解酶
触酶试验
+
A/A -曰-
+
+
+
+
+
+
-
按 2000 年美国 NCCLS 药敏试验法规制备袁 采用 NCCLS 法规渊2000冤判定标准进行判定袁结果见表 2遥 1.2.4 动物试验 小鼠注射菌液后袁 可见其背毛逆 立袁精神沉郁袁食欲减退曰48 h 内小白鼠全部死亡袁 剖检均可见脑出血袁肝尧脾肿大袁肝表面有针尖大小 的出血点曰对照组均正常遥 1 日龄雏鸡注射菌液后袁 雏鸡死前症状表现为精神沉郁袁 食欲减退袁 走路不 稳袁剖检可见败血症变化曰对照组正常遥
rococcus faecium.
Key words Pathogenic bacterium Enterococcus faecium 16S rRNA Sequence analysis
肠球菌是人类和动物肠道正常菌群的一部分袁 通常在引起腹腔和盆腔感染所分离的混合菌中发 现袁以往认为肠球菌是对人类无害的共栖菌袁但近年 研究已证实了肠球菌的致菌力遥 在需氧革兰氏阳性 球菌中袁 它是仅次于葡萄球菌的重要院内感染致病 菌袁肠球菌亦可引起院外感染遥肠球菌不仅可引起尿 路感染尧皮肤软组织感染袁还可引起危及生命的腹腔 感染尧败血症尧心内膜炎和脑膜炎等[1]遥 本试验的病 原菌分离自 1 羽发病雏鸡的肝脏及心脏遥 1 病原菌的分离与鉴定 1.1 材料和方法 1.1.1 材料 病料来源于 1 羽发病雏鸡袁 其症状表 现为精神沉郁袁羽毛蓬松袁步态不稳袁剖检可见卵黄 吸收不良袁肝脏土黄色袁其他未见明显变化遥 病菌即 分离自该雏鸡的肝脏及心脏遥 1.1.2 方法 1.1.2.1 培养基的制备 血琼脂平板尧 麦康凯琼脂 平板尧普通琼脂平板尧营养肉汤液体培养基袁按常规 方法制备袁灭菌袁4 益冰箱保存袁备用遥 1.1.2.2 细菌分离 无菌取患鸡心脏及肝脏于血平 板琼脂培养基上划线袁37 益培养 24 h遥 而后袁挑取形 态一致的菌落进行纯培养遥 1.1.2.3 形态学观察 将纯培养细菌涂片袁 进行革 兰氏染色尧镜检袁观察细菌形态和着色情况遥 1.1.2.4 生化试验 纯化后的细菌分别进行吲哚尧 MR尧葡萄糖尧乳糖尧麦芽糖尧蔗糖尧甘露醇尧尿素分解 酶试验尧 枸橼酸盐利用试验及三糖铁培养基接种
致鹅败血症粪肠球菌溶血素激活因子基因克隆及序列分析
ｃ ｍｐ ｒｄｗｉｈｔ ｅＣｙＡ ｅ ｅ ｆ ａｈ ｇ ｎｃＥｎ ｅｏ ｏ ｃ ｓ ａ ｃ ｌｓｆｏ ｐ ｔｅ ｔ ｎｆ ｒｉｎｃ ｕ ｔｉｓａ ｄ ｐｇ ｎＣ ｉａｒｓ ｅ ｏ ａ ｅ ｔ ｈ ｌ ｇ ｎ ｓｏ ｐ ｔ ｏ ｅ ｉ ４ ｔｒｃ ｃｕ ｅａ ｉ ｒ ｍ ａｉｎ ｓｉ ｏ ｅｇ ｏ ｎ ｒ ｎ ｉｓｉ ｈ ｎ ｅ ｐ ｃ ｆ ｅ
Ｃｌ ｎｉ ｎｄ ｓ ｑ ｅ ｅ ａ ａ ｙ ｉ ｆ ｃ ｔ ｌ ｓ ｎ ａ ｔｖ ｔ ｒ ｏ ｎｇ ａ ｅ ｕ ｎｃ ｎ ｌ ｓｓ ｏ ｙ ｏ ｙ ｉ ｃ ｉ ａ ｏ
ｉ ｏ ｓ ｅ ｔ ｅ ａｃ ｕｅ ｙＥｎｅｏ ｏ ｃ ｓ ａ ｃ ｌ ｎ ｇ ｏｅｓｐ ｉ ｍｉ ａ ｓｄｂ ｔｒ ｃ ｃｕ ｅａｉ ｃ ｆ ｓ
Ｃ ｌ 基 因序 列 设 计 ２对 特 异 性 引 物 ， 临 床 分 离 的 ４株 致 鹅 败 血 症 粪肠 球 菌 Ｃ ｌ 基 因进 行 克 隆及 序 列 测 定 ， 与 国 外 从 人 ｙＡ 对 ｙＡ 并 体 分 离 的和 国 内从 猪 体 分 离 的 各 ４株 致 病 性 粪 肠 球 菌 的 Ｃ ｌ 基 因 ， Ｉ ｓ ｒ ｅ ｅ ７ ０软 件 进 行 同 源 性 比 对 和 构 建 系统 进 化 ｙＡ 用 ｅｇ ｎ ． ａ
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ｋｇ，
６．５％ＮａＣｌ等条件下的生长耐受性试验以及动力 ｆＭＯＴ）试验区别菌属。确定为肠球菌的菌株，用甘
露醇（ＭＡＮ）、山梨醇（ＳＢＬ）、山梨糖（ＳＯＲ）等糖（醇）
类发酵试验来分群［７］。判断为肠球菌属第１Ｉ群的菌 株，用亚碲酸盐（ＴＥＬ）利用试验［８】、丙酮酸盐（ＰＲＵ） 利用实验、依罗霉素（ＥＦＲＯ）敏感试验、甲基葡萄糖
ｍｍ～１
ｍｍ的
ｈ，观察该细菌的生长状况。
１６Ｓ
圆形、边缘整齐、带棕色环的棕黑色菌落；在粪肠
ｒＤＮＡ鉴定 基上可见直径约为０．５
１
ｍｉｉｌ～
１６Ｓ
ｍｍ、圆形、边缘整齐、带粉红色环的紫色菌落。 用光学显微镜观察，４株分离菌株均为单个、
病原菌总ＤＮＡ，进行１６Ｓ ｒＤＮＡ的扩增，ＰＣＲ反应 体系为：总体积２５ ＩｘＬ，ＰＣＲ反应条件为９４。Ｃ
１
材料和方法
病料、菌株和载体无菌采集濒死期和刚死亡
状排列的革兰氏阳性球菌，做接触媒试验。接触媒 试验阴性者，分别用发酵葡萄糖（ＭＲＳ肉汤）产气试
１．１
验、吡咯烷酮芳胺酶（ＰＹＲ）试验［５］、胆汁．七叶苷 （ＢＥ）试验［６１，ｐＨ９．６、１０℃、４５℃、６０℃３０
ｒａｉｎ、
鹅的血液、心脏、肝脏、淋巴结和脑组织液等样
引
物
参照Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｔ等提供的肠球菌１６Ｓ
ｒＤＮＡ通用引物序列［３］，上游引物：２７ｆ：５＇－ＡＧ ＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ～３，下游引物：１ ４２９ｒ：
５’．ＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ．３’，
由ＴａＫａＲａ公
司合成。 １．５表型特征鉴定
１．５．１
细菌的分离纯化将采自４个不同鹅场的病
ｌｙｍｐｈａｄｅｎ ａｎｄ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｆｌｕｉｄ ｏｆ ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉｃ ｇｏｓｌｉｎｇ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ
ａｓ
ａ
ｇｏｏｓｅ
ｆａｒｍ ｉｎ Ｔｏｎｇｌｉａｏ．Ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔ ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｔｈｅ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｏｆ ｔｈｅ
ｒＤＮＡ检测、系统进化分析和致病性试验，确定这４
收稿日期：２０１１－５。１７ 基金项目：内蒙古自治区自然科学基金（２００６０７０１０４１８）；内蒙古自治区高等学校科学研究项目（ＮＪ０５０７７） 作者简介：狄婷婷（１９８５一），女，内蒙古乌兰察布人，硕士研究生，主要从事动物传染病的分子流行病学研究 ＋通信作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｍｍｄｇａｏｙｕａｎ＠１６３．ｔｏｍ
万方数据
中国预防兽医学报
１．５．４毒力因子表型试验将分离纯化的细菌接种 于５％兔血琼脂平板和３％的明胶琼脂平板上， ３５℃有氧培养２４ ｈ，再将３％的明胶琼脂平板置于
４℃５ １．６ １．６．１
基上均可见直径约为１ ｍｍ～１．５ ｍｍ、圆形、边缘 整齐、表面光滑、不透明的灰白色菌落；在胆盐七 叶苷琼脂培养基上可见直径约为ｏ．５
纸片滴加上述溶液ｌｏ旺，置暗处室温放置５
６
ｈ～
料分别编号为ＭＥ。、ＭＥ：、ＭＥ，和ＭＥ。。血液、淋 巴液样本，１２
０００
ｈ。大量接种细菌于脑心浸液肉汤琼脂培养基，放
ｒ／ｒａｉｎ离心１０ ｍｉｎ，沉淀物加
ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ
依罗霉素纸片，３５℃孵育１８ ｈ～２４ ｈ。出现任何抑 菌环即表示依罗霉素敏感［９］。 （４）甲基葡萄糖吡喃糖苷产酸试验：配制含有１０∥Ｌ 甲基葡萄糖吡喃糖苷和０．００６％溴甲酚紫的心浸液， 分装试管每管２ ｍＬ，１２１℃灭菌１０ ｍｉｎ。将分离纯 化的细菌接种于脑心浸液肉汤液体培养基中培养过 夜，取１滴培养基加入甲基葡萄糖吡喃糖苷心浸液 试管中，３５℃孵育１ ｄ（最长需孵育７ ｄ）。肉汤由紫 色变黄色为阳性［９］。
＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ
Ｉ艋床表现昏睡、持续性下痢、跛行和瘫痪等症状， 病理剖检可见心、肝、脾等组织器官肿大、淤血、 出血和坏死，表面有纤维素性渗出物，病死率高达 ３０％～５０％。为了确定病原，本实验室从病雏内脏 中分离得到４株细菌，对其进行了形态学和生长耐
受性观察，菌属区别、分群和菌种鉴定试验，１６Ｓ
肠球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）为寄生于动物肠道 内的条件致病菌。已经从发病的猪、羊、驴、鸡、 鸭、鹧鸪和蜜蜂等动物体内分离出致病性肠球菌， 主要是粪肠球菌旧】。目前国内还没有粪肠球菌感染 鹅致病的报道。 ２００８年４月，通辽某鹅业公司的祖代和父母代 鹅场２０日龄－－３０ １３龄雏鹅发生急性败血性传染病，
吡喃糖苷（ＭＧＰ）产酸试验［９］、色素生成（ＰＩＧ）试验［】０１
以及分解乳糖（ＬＡＣ）、蔗糖（ＳＵＣ）、水杨素（ＰＡＳ）、 阿拉伯糖（ＡＲＡ）、棉子糖（ＲＡＦ）、木糖（ＸＹＬ）等其他 生化试验确定菌种。 １．５．３．２试验方法：（１）生长耐受试验、色素生成试 验［１０］和动力试验：将分离纯化的细菌无菌接种于 ６．５％ＮａＣｌ肉汤、ｐＨ９．６肉汤等培养基或生化试验 管中培养，观察该病原体的耐盐、耐碱、色素生成 和运动性情况；同时，接种于脑心浸液肉汤液体培 养基中，分别在１０℃、４５℃和６０℃３０ ｍｉｎ的条 件下培养，观察对温度的敏感性。 （２）糖（醇）类发酵试验、特殊盐类利用试验：将 分离纯化的细菌分别无菌接种于微量生化鉴定管或 相应培养基中，按要求进行培养并于规定的时间观 察和记录反应结果。 （３）依罗霉素敏感试验：溶解１００ ｍｇ依罗霉素 于０．１ ｍＬ二甲亚砜中，加蒸馏水９．９ ｍＬ。每片滤
１．６．３ １６Ｓ
ＮａＣｌ等条件下的生长耐受性试验以及ＭＯＴ试验来 用ＤＮＡＳｔａｒ 区别菌属（表ｌ １。结果显示分离株为肠球菌属细菌。
表１
Ｔａｂｌｅ ｌ
ｒＤＮＡ片段的测序和分析
将测定序列与ＧｅｎＢａｎｋ中已登录的近年来国内外分 离的粪肠球菌菌株序列比较并制作进化树，进行同 源性和系统进化分析。 １．７致病性试验将分离鉴定的粪肠球菌接种于脑 心浸液肉汤琼脂平板上，置３７℃中有氧培养２４
ｍｉｎ、６．５％
９４℃５０ Ｓ、５８℃５０ Ｓ、７２℃５０ Ｓ；９４℃７ ｒａｉｎ；
３０个循环。ＰＣＲ产物经０．８％的琼脂糖凝胶电泳分 离。按Ｓｏｌａｒｂｉｏ凝胶回收试剂盒操作说明进行回收。
１．６．２ １６Ｓ
ｒＤＮＡ的克隆和鉴定将回收的ＰＣＲ产
物连接ｐＭＤｌ８－Ｔ载体转化感受态ＤＨ５仅细胞中。 提取重组质粒经ＢａｍＨ Ｉ和Ｓａｌ Ｉ双酶切及ＰＣＲ鉴 定。由宝生物工程（大连）有限公司测序。
（内蒙古民族大学动物科学技术学院内蒙古高校毒物与动物疾病监控重点实验室培育基地，内蒙古通辽０２８０４２）
摘
要：为确定导致通辽某鹅场雏鹅败血症的病原，本研究将从病鹅心、肝、淋巴结和脑组织液中分离的革
兰氏阳性球菌纯化培养，进行形态学和生长耐受性观察，菌属区别、分群和菌种鉴定试验，１６Ｓ ｒＤＮＡ检测、系 统进化分析和致病性试验。结果表明，分离菌株（ＨＱ８３１４３１）为中等致病力粪肠球菌，具有Ｂ型溶血特性，可致小 鼠急性败血症。分离菌株与参考菌株ＡＴＣＣ２９２１２及国内外分离的其他１５株粪肠球菌１６Ｓ ｒＤＮＡ的同源性均在
９９．０％以上，位于系统发育树的同一分支。 关键词：粪肠球菌；鹅；败血症；分离鉴定；１６Ｓ ｒＤＮＡ；系统进化分析 中图分类号：￥８５２．６１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８—０５８９（２０１２）０３．０１９２．０５
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉＣａｔｉＯｎ Ｏｆ Ｅ－门ｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ
本，保存于一７０℃冰箱中备用。参考菌株
ＡＴＣＣ２９２１２为标准菌株质控粪肠球菌，购自上海复 祥生物科技有限公司。大肠杆菌ＤＨ５ Ｏｔ由本实验室 保存。ｐＭＤｌ８一Ｔ载体购自ＴａＫａＲａ公司。 １．２实验动物三级（无特定病原体）ＫＭ小鼠６０ 只（雌雄各半），２０日龄，平均体质量１５ ｋｇ～１８ 购自吉林大学实验动物中心。 １．３主要试剂脑心浸液肉汤、胆盐七叶苷琼脂、 粪肠球菌选择琼脂、亚蹄酸钾血琼脂基础、肉汤， 购自青岛海博生物有限公司。６．５％ＮａＣｌ肉汤、 ｐＨ９．６肉汤、５％兔血琼脂培养基和普通琼脂培养 基，均按常规方法配制。３％的明胶琼脂培养基、 生化鉴定管、药敏纸片，购自北京奥博星生物技术 有限责任公司。Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶购自Ｐｒｍｏｅｇａ公 司；ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、蛋白酶Ｋ、Ｔ４ＤＮＡ连接 酶均购自ＴａＫａＲａ公司；溶菌酶、Ｓｏｌａｒｂｉｏ凝胶回收 试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。
Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｎｅｒ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｃａｕｓｉｎｇ ｇｏｓｌｉｎｇｓ ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ，ａ Ｇｒａｍ—Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｃｃｉ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｅａｒｔ，ｌｉｖｅｒ，
５０斗Ｌ／ｍＬ生理盐水，３７。Ｃ孵化３０
离心１０ ｍｉｎ，沉淀物４℃保存待用；组织样本研磨 后，加等体积的生理盐水，操作方法同上。将离心
沉淀物无菌接种于脑心浸液肉汤琼脂培养基上，分
别在有氧和微厌氧条件下置３７℃培养１２ ｈ－－２４
ｈ，
挑取典型菌落接种到脑心浸液肉汤液体培养基中， 分离纯化。 １．５．２形态学观察在有氧和微厌氧条件下将分离
ｃａｕｓｉｎｇ ｇｅｅｓｅ ＳｅｐｔＩＣｅｍ 一一
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ｆＫｅｙｓｔｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｆｏｓｔｅｒｉｎｇ Ｂａｓｅ ｏｆ Ｉｎｎｅｒ
Ｗａｎ—ｘｉｎ，ＤＯＮＧ Ｇｕｏ－ｊｕｎ，ＺＥＮＧ
Ｙｕ—ｒａｎ
Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｈｉｇｈ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｓｐｅｃｔｉｎｇ Ｐｏｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｔｏｎｇｌｉａｏ ０２８０４２，Ｃｈｉｎａ）