河南省部分地区猪和鸡源粪肠球菌的分离鉴定与耐药性分析
猪源大肠杆菌的分离 鉴定及耐药性监测
大肠杆菌是一种常见的人类和动物肠道病原菌，其中一些菌株已经对多种抗 生素产生了耐药性。因此，对大肠杆菌进行分离鉴定和耐药性分析对于防控细菌 性感染和合理使用抗生素具有重要意义。本次演示以一株猪源大肠杆菌为例，介 绍了其分离鉴定和耐药性分析的过程。
实验材料包括采样猪的粪便、大肠杆菌标准菌株、药敏试纸、培养基等。实 验方法包括细菌分离、纯化、鉴定和药敏试验。结果发现，该菌株属于大肠杆菌 O157:H7血清型，具有较高的耐药性，对多种抗生素如青霉素、氨苄西林、头孢 曲松、氟苯尼考等产生了耐药性。肠杆菌菌株分别接种在含有不同浓度抗菌 药物的培养基上。通过测量抑菌圈的直径，评估菌株对抗菌药物的敏感性。参照 国际抗菌药物敏感性试验委员会（NCCLS）制定的标准，分析耐药性水平及变化 趋势。
三、结果
1、分离与鉴定结果
经过分离和鉴定，共获得50株猪源大肠杆菌。这些菌株在培养基上呈现出典 型的圆形、湿润、半透明菌落，革兰氏染色阴性，具有典型的大肠杆菌形态特征。 分子生物学鉴定结果表明，所有菌株均含有16S rRNA基因，与大肠杆菌属的亲缘 关系较近。
需要注意的是，本次演示的研究成果对于指导临床合理用药和控制羊源大肠 杆菌的传播具有一定的实践意义，但仍需进一步扩大样本量、增加实验代表性以 及加强多学科联合研究，以提供更全面、准确的研究结论。在未来的研究中，我 们应注重对新型检测技术和治疗方法的研究与开发，以便更好地应对耐药性和致 病性问题。
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研究羊源大肠杆菌的耐药性与致病性对于指导临床合理用药、控制病情具有 重要意义。目前，耐药性大肠杆菌已成为一个全球性的问题，给治疗带来了很大 的困难。因此，我们需要更加深入地研究羊源大肠杆菌的耐药机制和致病机理， 寻找有效的解决方法。
本研究采用细菌培养、分子生物学等技术手段对羊源大肠杆菌进行分离鉴定， 并对其耐药性和致病性进行分析。首先，对临床疑似感染大肠杆菌的羊只进行细 菌分离培养，获得纯菌落。接着，采用基因测序、PCR等方法对菌落进行分子生 物学鉴定，确定其为大肠杆菌。
河南省猪源大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析
引起 各 种肠 内外 的 感 染 ， 是 腹 泻 和 泌 尿 道感 染 的 主 要病 原 菌 。在养 殖 场 中 ， 大 肠 杆 菌病 是 危 害 严 重 的 常 见病 和多 发病 ， 其 发 病 率 和 死 亡 率位 于仔 猪 疫 病 之 首 。我 国一 些 猪 场 在 预 防 和 治 疗 疾 病 的 过 程 中 盲 目用 药 、 超剂量用药 ， 使 得 细 菌 的 耐 药 率 不 断 攀 升， 耐药 谱不 断扩 大 耐 药 菌 的 重要 储 库 为 畜 禽 粪 便 ， 其 可随着 畜 禽粪便 排 出体 外 ， 进 而 对环 境 中 的 土著 细 菌产 生 影 响 。这 些 细 菌 能 以人 类 和 动 物 相重 叠 的共生 菌为 载体 ， 转 移抗 生 素耐 药性 基 因“ ， 对人 类健 康造 成 巨大 威 胁 。 因此 ， 掌 握 猪 源 大 肠 杆 菌 的耐药 情 况 ， 可 预 防 和 治 疗 由该 菌 引 起 的 疾 病 ， 对维 护公 共卫 生安 全 有极 其重 要 的作 用 。 本研 究对 河南 省 Ａ、 Ｂ 、 Ｃ、 Ｄ ４个 地 区 的规 模 化 养猪 场抽 取 样 品进 行 大 肠 杆 菌 分 离 、 鉴定 ， 随 后 进 行耐 药性 试验 ， 初 步 掌 握 了河 南 省猪 源 大 肠 杆 菌 的 耐药 情况 ， 为 以后 大 肠 杆 菌 病 的 临 床用 药 和预 防控 制提 供科 学指 导 。
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 实验 材 料
１ ． １ ． １ 样 品来 源 ： ２ ０ １ ７年 １ —１ ２月 随 机 抽 取 河 南 省 Ａ、 Ｂ、 Ｃ、 Ｄ 四 个 地 区规 模 化 猪 场 肛 门 拭 子 样 品 ２ ４ ０份 。具 体抽 样数 量 见表 １ 。
表 １ ２ ０份）
鸡、猪粪便源大肠杆菌对4种抗生素耐药性的比较
鸡、猪粪便源大肠杆菌对4种抗生素耐药性的比较蒲承君;吕明环;曾钰涵;宫小燕;孙英【摘要】以琼脂稀释法对67株鸡源大肠杆菌及61株猪源大肠杆菌进行最低抑菌浓度(MIC)测定,并以SPSS分别进行卡方检验和Probit模型估算,分析不同来源大肠杆菌耐药差异显著性及不同抗生素的半数抑菌浓度(MIC50),以期对不同畜禽粪便来源的大肠杆菌耐药差异进行详细准确的探讨.结果显示,鸡源大肠杆菌对头孢噻肟、诺氟沙星、环丙沙星和四环素耐药率分别为98.51％、68.66％、56.72％和100％,猪源大肠杆菌对头孢噻肟耐药率为88.52％,对诺氟沙星、环丙沙星和四环素则100％耐药.除四环素,鸡源、猪源大肠杆菌对诺氟沙星、环丙沙星、头孢噻肟的耐受差异显著(P＜0.05),51％的鸡源大肠杆菌和89％的猪源大肠杆菌均呈4重耐药.SPSS分析结果表明,Probit模型估算结果优于当前MIC50常规计算方法,头孢噻肟、诺氟沙星、环丙沙星和四环素对鸡源大肠杆菌MIC50分别为40.031μg·mL-1、40.020 μg·mL-1、2.683 μg· mL-1和101.418 μg·mL-1,对猪源大肠杆菌MICs0分别为8.724 μg· mL-1、56.044 μg· mL-1、31.214 μg·mL-1和130.915 μg·mL-1.回归方程显示环丙沙星对鸡源大肠杆菌抑制作用最强;高于40.031 μg·mL-1时,诺氟沙星抗菌作用弱于头孢噻肟,低于120.23 μg·mL-1时,诺氟沙星抗菌作用强于四环素;头孢噻肟、环丙沙星、诺氟沙星和四环素对猪源大肠杆菌的抑菌作用则呈递减趋势.同时验证了诺氟沙星和环丙沙星属同种作用机制,基于Probit模型计算更简单、快速、直观.研究结果可为畜禽养殖中大肠杆菌的耐药差异监控提供一定的数据基础.%We determined minimum inhibitory concentration (MIC) of four antibiotics to 67 Escherichia coli in chicken feces and 61 Escherichia coli in pig feces by agar dilution method,and then established Chi-square test and Probit model with Statistical Product andService Solutions (SPSS) to analyze the significance of antibiotic resistance difference and MIC50.Results indicated that resistance rate of cefotaxime,norfloxacine,ciprofloxacin and tetracycline was98.51％,68.66％,56.72％ and 100％ for Escherichia coli in chicken feces respectively.However,for Escherichia coli in pig feces,resistance rate of cefotaxime was 88.52％,and resistance rate of the other three antibiotics reached 100％.Except for tetracycline,the resistance difference between Escherichia coli in chicken feces and Escherichia coli in pig feces was significant (P＜0.05).The phenomenon was supposed to correlate with the wide use of tetracycline in livestock farms.89％ of Escherichia coli in pig feces was quadruple drug resistance while 51％ of Escherichia coli in chicken feces was quadruple drug resistance.Escherichia coli which were sensitive to the four antibiotics were not found in our study.SPSS analysis suggested that the results calculated with Probit model were better than the normal method.MIC50 of cefotaxime,norfloxacine,ciprofloxacin and tetracycline of Escherichia coliin chicken feces was 40.031 μg·mL-1,40.020 μg·mL-1,2.683 μg·mL-1 and 101.418 μg·mL-1 while that in pig feces was 8.724 μg·mL-1,56.044 μg·mL-1,31.214 μg·mL-1 and 130.915 μg·mL-1.Regression equation showed that ciprofloxacin could inhibit Escherichia coli in chicken feces significantly.When the concentration was above 40.031 μg·mL-1,antibacterial function of norfloxacine was weaker than cefotaxime.Below 120.23 μg· mL-1,antibacterial function of norfloxacine was stronger than tetracycline.The order of antibacterial function to Escherichia coli in pig feces was followed by cefotaxime ＞ ciprofloxacin ＞norfloxacine ＞ tetracycline.At the same time,it verified the same inherent mechanism for antibacterial function of norfloxacine and ciprofloxacin.Calculation of MIC50 based on Probit model was more simple,faster and more direct.Results provided essential information for monitoring the resistance difference of Escherichia coli in livestock farms.【期刊名称】《生态毒理学报》【年(卷),期】2017(012)001【总页数】7页(P141-147)【关键词】抗生素;大肠杆菌;鸡源;猪源;琼脂稀释法;最低抑菌浓度;卡方检验;Probit 模型【作者】蒲承君;吕明环;曾钰涵;宫小燕;孙英【作者单位】中国农业大学资源与环境学院,北京 100193;中国农业大学资源与环境学院,北京 100193;中国农业大学资源与环境学院,北京 100193;中国农业大学资源与环境学院,北京 100193;中国农业大学资源与环境学院,北京 100193【正文语种】中文【中图分类】X171.5抗生素在畜禽养殖中的广泛使用已使动物肠道内的细菌产生多重耐药，耐药菌可随着畜禽粪便排出体外，进而对环境中的土著细菌产生影响[1-2]。
河南省猪源粪肠球菌的分离、鉴定与耐药性分析
河南省猪源粪肠球菌的分离、鉴定与耐药性分析董鹏;李金磊;狄元冉;韩楠;方忠意;高延玲;周红霞;吴志明【摘要】旨在掌握河南省猪源粪肠球菌的耐药情况.从规模化猪场抽取样品300批,采用常规方法进行粪肠球菌分离、培养、纯化,应用全自动细菌鉴定/药敏系统和PCR技术对分离菌株进行种水平鉴定,利用微量肉汤稀释法对分离菌株进行药物敏感性分析.结果表明,有154株分离菌被鉴定为粪肠球菌,总体分离率为51.33%;分离菌株对头孢西丁、克林霉素、泰妙菌素、头孢噻呋、磺胺异噁唑、红霉素、替米考星等抗菌药物耐药严重,耐药率均在90%以上,对强力霉素(多西环素)、氟苯尼考、青霉素、复方新诺明耐药性相对较强,耐药率在60%~90%.综上提示,河南省猪源粪肠球菌耐药情况严重.【期刊名称】《畜牧与饲料科学》【年(卷),期】2017(038)007【总页数】3页(P13-15)【关键词】粪肠球菌;猪;分离;鉴定;耐药性【作者】董鹏;李金磊;狄元冉;韩楠;方忠意;高延玲;周红霞;吴志明【作者单位】河南省兽药饲料监察所,河南郑州 450008;河南省兽药饲料监察所,河南郑州 450008;河南省兽药饲料监察所,河南郑州 450008;鹤壁市畜产品质量监测检验中心,河南鹤壁 458030;河南省兽药饲料监察所,河南郑州 450008;河南省兽药饲料监察所,河南郑州 450008;河南省兽药饲料监察所,河南郑州 450008;河南省兽药饲料监察所,河南郑州 450008【正文语种】中文【中图分类】S858.285.11;S854.43肠球菌原属于链球菌属，1994年正式被独立划分为肠球菌属［1］。
粪肠球菌是一种革兰阳性菌，是重要的条件致病菌［2］，广泛分布于自然界中，常栖居于人和动物的肠道中。
近年来，肠球菌感染人和动物的报道不断增加，随着耐药菌株的增多，感染后的治疗也越来越困难［3］。
先前认为粪肠球菌是人和动物的共生菌，但近年来研究发现，粪肠球菌已逐渐成为人和动物革兰阳性菌感染中仅次于葡萄球菌的第二大病原菌［4］。
猪肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定和药敏试验
猪肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定和药敏试验徐引弟,王治方,朱文豪,梁跃,郭成留【摘要】摘要:从2006-2009年河南省发生猪高热综合征的168家规模化猪场456份病料中,分离出粗大的革兰氏阴性杆菌,通过培养特性试验、生化试验和PCR试验,鉴定出了149株猪肠外致病性大肠杆菌。
对分离菌进行小鼠毒力试验、血清分型及药敏试验,结果显示,所分离肠外致病性大肠杆菌对小鼠均有毒力,以O11、O161、O8、O138、O9、O101及O26最为流行,对头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮、阿米卡星、头孢唑啉敏感。
【期刊名称】河南农业科学【年(卷),期】2011(040)001【总页数】4【关键词】关键词:猪肠外致病性大肠杆菌;分离;鉴定;药敏试验大肠杆菌是一类广泛存在于自然界,并能引起人和动物共同感染的重要人畜共患病病原。
依其致病机制可分为3类:共生型、肠内致病型和肠外致病型。
根据猪的日龄、生理与免疫状况等差异,疾病的发生有所不同,常见的猪大肠杆菌病分为3种,仔猪黄痢、仔猪白痢和猪水肿病,目前这些疫病的发病机制与危害已被人们广泛认识[1]。
近几年,北美和欧洲许多学者相继报道了一类危害严重,可特定定殖于宿主肠道外其他组织,并严重致病的一类新的大肠杆菌菌群肠外致病性大肠杆菌（extraintestin al pathogenic Escherichia coli,ExPEC）。
肠外致病性大肠杆菌是一类能引起人和动物肠外组织感染的重要人畜共患病病原,可致使不同宿主发生脑膜炎、败血症、泌尿道感染和呼吸道感染。
该病每年给全球公共医疗业造成巨大的财政支出,已引起全世界的广泛关注[1-6]。
2006年6月以来我国爆发的高热综合征给养猪业造成了巨大经济损失。
高热综合征主要由高致病性猪呼吸与繁殖综合征引起,同时有圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪流感病毒、伪狂犬病毒的感染,细菌性病原如猪链球菌、大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌等继发感染和混合感染。
河南省鸡源致病性大肠杆菌的分离鉴定
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２ ０ 年 １ ｌ 月从河 南的新郑 、中牟 、 ０５ ～１
汝州 、 睢县 、 温县 、 民权 、 阳等 ３ 个县市的典型大 荥 ２ 肠杆菌病病变的病 、 死鸡取病料 ， 南河南农业大学畜 禽研究所提供。由本实验室进行分离 、 鉴定 、 保存 。
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鸡大肠杆菌病是 由大肠埃希 氏杆 菌某些血清 型菌株所引起的一类疾病的总称 ［ １ １ 。近几年来 ， 随 着集约化养鸡业 的发展 ，饲养规模的不断扩大 ， 该 病 的流行也愈趋严重 ， 给养鸡业带来 巨大的经济损 失。大肠杆菌血清型复杂 ， 目前 为止 ， 到 已知 Ｏ抗 原有 １３ ． 中引起禽类发病的大肠杆菌的主要 ７种 其 血清型有 ６ ０种 ，不同地 区 、不同鸡场有不同的 Ｏ
Ｓ ａｘ ｈ ｎ ｉ ｃ ｉ ｅ ｆ ｗ ｉｅｅｔ ｒｓ ｓ ａｎ． ｈ ｅｕｔ ｓｏ ｅ ｈ ｔ ｔｅｅｉ ｉｎｆ ａｔ ｄｆ ｒｎｅＰ Ｍａ ｈｃ ｎｏ ｏｄｆ ｒｎ ｏｓ ｔ ｉｓ Ｔ ｅｒｓｌ ｈ ｗ ｄ ｔａ ｈ ｒ ｓ ｉｃｎ ｉｅｅ ｃ（＜ ｋ ｔ ｆ ｃ ｒ ｓ Ｓ ｇ ｉ ｆ
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猪源奇异变形杆菌的分离鉴定与耐药性分析
奇 异 变形 杆菌 （Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）属 于 肠杆 菌科 （Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）变形 杆 菌 属 （Ｐｒｏｔｅｕｓ）的 成 员 之 一 是一种没有芽孢 、没有荚膜 的革兰阴性菌 Ｊ。
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该菌分布广泛 ，存在于泥土 、水 、粪便 以及人 与动物 的体 表 、黏 膜 和 消 化 道 中 ；可 以 引 起 人 和 多 种 动 物 消 化 系统 、泌 尿 系 统 感 染 Ｉ４ ；该 菌 能 够 引起 猪 发 病 ，临床上 表 现为 高 热 、腹 泻 、呕 吐 、气 喘等 症 状 ，严
ＤＯＮＧ Ｍｅｎｇ—ｍｅｎｇ，ＸＵ Ｙａｎ—ｚｈａｏ，ＨＡＮＧ Ｂｏ—ｌｉｎ，ＹＡＮＧ Ｌｅｉ，ＳＵＮ Ｙａ－ｗｅｉ，ＷＡＮＧ Ｑｉｎｇ，ＨＵ Ｊｉａｎ－ｈｅ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３，Ｃｈｉｎａ）
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：１６Ｓ ｒＲＮＡ ；Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ ；ｓｗｉ ｎｅ ；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ；Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｖｉｔｙ Ｔｅｓｔ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒｓ：ＸＵ Ｙａｎ－ｚｈａｏ ；ＨＡＮＧ Ｂｏ—ｌｉｎ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｉａｇｎｏｓｅ ｔｈｅ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｐｉｇ ｆａｒｍ ｉｎ Ｈｅｎａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ，ｗｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｃｋ ｐｉｇｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅｓ ａｎ ｄ ｉｓｏｌａｔｅｄ １ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｇｒａｍ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｉｌｌｕｓ．Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｔｅｓｔ，ｄｒｕｇ ｓｅｎ— ｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ ａｎｄ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎ ａｌｙｓｉｓ ｗｅｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａ ｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｉｎ ａｃｃｏｒｄａｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ．Ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｔｅｕ ｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ ｗａｓ ａｂｏｖｅ ９８％ ． Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ Ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ａｓ ＺＢ１７．Ｓｅｑｕ ｅｎｃｅ ａｎ ａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｈａｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｈｏｍｏｌｏｇ ｙ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｔｅｕｓ
鸡大肠杆菌地方菌株的分离鉴定与耐药性测定
诺 明、 四环素及青霉素产生较高的耐药性， 其耐药率分别
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文献标 识 码 ： Ｂ
文章 编号 ：０ ４ ５ ９ （０ ６０ — ０ ７ ０ １ ０ — ０ ０２ ０ ）６ ０ ０ — ２ 上 ， 种菌株 涂布两 个平 皿 。 一 再用 无菌 尖头镊 子将 １ 药 ２种 敏 片 分两 批 （ 批 ６片 ） 匀 的贴 到 上述 已涂 布 细菌 的培 每 均 养基 表 面。将贴好 药敏 试纸 片 的平 板翻转 ， ３ ℃温箱 内 置 ７ 培养 ２ ４小时 ， 出观察 结果 。 取
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河南省部分地区猪和鸡源粪肠球菌的分离鉴定与耐药性分析李金磊;董鹏;狄元冉;方忠意;高延玲;周红霞;吴志明【摘要】In order to understand the drug resistance of Enterococcus faecalis from swine and chickens in Henan province,480 samples were collected from scaled pig and chicken farms in four areas,E.faecalis were isolated and identified by PCR and BD PhoenixTM-100 Compact automatic microbial analysis system. The drug resistance analysis was carried out by mini-broth dilution susceptibility test.The result showed that total 254 isolates of E.faecalis were isolated,the isolating rate was 52.9%.The resistances of E.fae-calis isolates tocefoxitin,tiamulin,clindamycin,sulfisoxazole,erythromycin and tilmicosin were all above 90%,resistance to seven or more antimicrobials was observed in over 90% of E.faecalis isolates.The re-sults indicated that the drug resistance of E.faecalis from pigs and chickens in Henan province is serious, the better environmental hygiene should be provided to food animals to prevent the proliferation and spread of drug-resistant bacteria.%为了掌握河南省猪、鸡源粪肠球菌的耐药情况,从4个不同地区的规模化养殖场猪、鸡抽取样品480份,通过对细菌的分离培养和纯化,采用PCR和BD PhoenixTM-100全自动微生物鉴定系统对分离的粪肠球菌进行鉴定,并通过微量肉汤稀释法对分离菌株进行药物敏感性分析.结果显示,共分离菌株254株,分离率为52.9%.分离菌株对头孢西丁、泰妙菌素、克林霉素、磺胺异恶唑、红霉素、替米考星等耐药严重,耐药率均在90%以上,90%以上的菌株对7类及7类以上的抗菌药物耐药.表明河南省猪、鸡源粪肠球菌耐药情况严重,食用动物的环境卫生有待进一步改善,防止耐药菌的扩散和蔓延.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2018(039)004【总页数】6页(P122-127)【关键词】粪肠球菌;分离;耐药性;猪;鸡【作者】李金磊;董鹏;狄元冉;方忠意;高延玲;周红霞;吴志明【作者单位】河南省兽药饲料监察所,河南郑州450008;河南省兽药饲料监察所,河南郑州450008;河南省兽药饲料监察所,河南郑州450008;河南省兽药饲料监察所,河南郑州450008;河南省兽药饲料监察所,河南郑州450008;河南省兽药饲料监察所,河南郑州450008;河南省兽药饲料监察所,河南郑州450008【正文语种】中文【中图分类】S852.611;S858.31肠球菌原属于链球菌属，是一种革兰阳性菌，广泛分布于植物、地表水、土壤、蔬菜及动物等多种生物，对高温及恶劣环境有较强的耐受性[1-2]。
肠球菌与多种食源性动物疫病有关，能引起猪腹泻，给养殖业造成重大损失，并威胁人的健康[3]。
临床分离的肠球菌中，粪肠球菌约占80%～90%，而屎肠球菌只占5%～10%[4]。
粪肠球菌是人和动物肠道中一种重要的条件致病菌，在畜牧业生产中常作为益生菌饲料添加剂来调节畜禽肠道菌群。
但是，近年来由于抗生素的广泛使用，在兽医临床研究中，由肠球菌引起的动物疾病也日益增多[5-7]；在人类公共卫生安全上，粪肠球菌已成为医院感染的重要病原菌之一[8]，我国医院分离的病原菌中，粪肠球菌位居前3位[9]。
作为可以衡量抗菌药物耐药性水平的革兰阳性指示菌，对猪、鸡源粪肠球菌的耐药性分析和研究具有重要意义，可以为科学制定抗菌感染防治方案及细菌耐药性监测提供必要的数据支持。
本试验从河南省A、B、C、D 4个地区的规模化养猪、鸡场抽取样品，对粪肠球菌进行分离、鉴定，随后进行耐药性试验，以期掌握河南省猪、鸡源粪肠球菌的耐药情况，为指导临床合理用药和粪肠球菌的控制提供科学依据。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株肠球菌标准菌株ATCC 29212，购自中国兽医药品监察所。
1.1.2 样品来源 2016年1月至2016年12月抽取河南省A、B、C、D 4个地区规模化养殖场猪、鸡肛门拭子样品480份，具体抽样数量见表1。
表1 样品抽样数量统计Table 1 The number of samples sampled地区Area猪源/份Isolatedfrompigs鸡源/份Isolatedfromchickens总计/份TotalA9030120B9090180C603090D6030901.1.3 培养基与试剂革兰阳性细菌鉴定板，BD公司产品；一次性无菌采样棒(BHI)，郑州君越科莱特健康科技有限公司产品；KF链球菌琼脂培养基、营养琼脂、脑心浸液琼脂，北京路桥技术有限公司产品；革兰阳性细菌药敏板，天津市金章科技发展有限公司产品。
1.1.4 仪器设备低温可叠放摇床(MaxQ SHKE6000-8CE)，Thermo公司产品；细菌浊度仪，北京中西远大产品；全自动细菌鉴定/药敏系统(BD PhoenixTM-100)；梯度PCR仪(MyCycle)、凝胶成像系统，Bio-Rad公司产品。
1.1.5 引物粪肠球菌引物P1：5′-ACTTATGTGACTAACTTAACC-3′，P2：5′-TAATGGTGAATCTTGGTTTGG-3′，扩增片段长度为326 bp。
1.2 方法1.2.1 预增菌将一次性无菌采样棒采集的样品尽快送到实验室，37℃培养16 h～20 h，同时设阳性和阴性对照。
1.2.2 样品的分离、纯化取预增菌菌液1环～2环，划线于KF链球菌琼脂培养基上，37℃培养48 h±2 h，选取单个典型菌落进行纯化，最后将纯化好的菌落划线接种于脑心浸液琼脂培养基。
1.2.3 菌株的鉴定1.2.3.1 PCR鉴定用灭菌棉签挑取纯化好的菌落，加入装有无菌生理盐水的1.5 mL离心管中，反复冷冻煮沸2次～3次，12 000 r/min离心取上清作为PCR扩增模板。
同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。
50 μL总反应体系为：预混酶25 μL，ddH2O 18 μL，P1 1 μL，P2 1 μL，模板5 μL。
反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 5 min；4℃结束反应。
同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。
PCR结束后，取8 μL PCR产物，用15 g/L琼脂糖进行电泳，15 V/cm电泳20 min～30 min，凝胶成像系统观察结果。
1.2.3.2 鉴定系统鉴定对PCR鉴定为粪肠球菌阳性的样品，采用全自动细菌鉴定/药敏系统进一步鉴定。
1.2.4 药敏试验取营养琼脂上经鉴定的粪肠球菌菌落，用生理盐水调制0.5 MCF，吸取10 μL加入到10 mL肉汤中，然后分别取100 μL加入到96孔药敏板中，37℃培养16 h～20 h，读取药敏试验结果。
2 结果2.1 菌株分离结果经预增菌培养，KF链球菌琼脂培养基分离纯化，最后经PCR及全自动细菌鉴定/药敏系统鉴定，河南地区规模化猪、鸡场共分离粪肠球菌254株，分离率为52.9%(254/480)，其中猪源粪肠球菌154株，分离率为51.3%(154/300)，鸡源粪肠球菌100株，分离率为55.6%(100/180)。
具体情况见表2和图1。
表2 河南省各地区猪、鸡源粪肠球菌分离情况Table 2 Isolation rate of Enterococcus faecalis from pigs and chickens of several areas in Henan province地区Area猪源Isolatedfrompigs抽样数Numberofsamples分离数NumberofIsolation分离率/%Isolationrate鸡源Isolatedfromchickens抽样数Numberofsamples分离数NumberofIsolation分离率/%Isolationrate总体Total抽样数Numberofsamples分离数NumberofIsolation分离率/%IsolationrateA904550.0302170.01206655.0B904044.4903538.91807541.7 C603355.0302790.0906066.7D603660.0301756.7905358.9总计Total30015451.318010055.648025452.9M.DNA标准DL 2 000；P.阳性对照；N.阴性对照；K.空白对照；1～20.样品M.DNA Marker DL 2 000;P.Positive control; N.Negative control; K.Blank control;1-20.Samples图1 河南省猪、鸡源粪肠球菌PCR鉴定部分结果Fig.1 PCR identification results of Enterococcus faecalis isolated from pigs and chickens in Henan province2.2 药敏试验结果将分离菌株进行头孢西丁、克林霉素、泰妙菌素、磺胺异恶唑、红霉素、替米考星、头孢噻呋、强力霉素、青霉素、氟苯尼考、复方新诺明、氧氟沙星、恩诺沙星、庆大霉素、利萘唑胺、阿莫西林/克拉维酸、万古霉素等17种抗生素药物敏感性试验，分离的254株粪肠球菌对头孢西丁、克林霉素、泰妙菌素、磺胺异恶唑、红霉素、替米考星、头孢噻呋耐药较严重，耐药率分别为99.14%、98.71%、97.84%、96.12%、93.97%、93.97%、93.10%，对强力霉素(多西环素)、青霉素耐药相对严重，耐药率均在80%～90%，对万古霉素全部敏感。