第二章 可见分光光度法

第二章紫外-可见分光光度法

物质是有颜色的，利用比较溶液本身或加入试剂后呈现出的颜色深浅的方法来确定溶液中有色物质的含量的方法为比色分析法。以人的眼睛来检测颜色的深浅的方法为目视比色法。以光电转化器件（如光电池）为检测器来区别颜色深浅的方法为光电比色法。

分光光度法是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析, 所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。紫外光谱（UV）能够提供分子中的共轭体系的结构信息，可用于判断共轭体系中取代基的位置、种类和数目。红外光谱（IR）在未知结构化合物的鉴定中，主要用于功能基的确认，芳环取代类型的判断等。由于UV和IR只能给出分子中部分结构的信息，而不能给出整个分子的结构信息，能提供化合物的结构信息较少，所以单独以UV和IR不能确定分子结构，必须与NMR谱、MS谱以及其他理化方法结合才能得到可靠的结论。

紫外-可见分光光度法即是利用物质本身（或生成的有色化合物即“显色”后测定）对紫外及可见光的吸收进行测定，其特点：

①灵敏度高。可用于测定试样中1%-0.001%的微量成分，甚至可测低至10-6-10-7的痕量成分。

②准确度高。测定的相对误差为2%-5%，采用精密分光光度计时，可减少至1%-2%。特别适用于低含量和微量含量组分的测定，不适于中和高含量组分的测定。但如果采取适当的技术措施，比如示差法，也可测定高含量组分。

③适用范围广。

④操作简单，快速，仪器价格不昂贵。

⑤目前，分析仪器制造技术和计算机技术的结合使光度分析获得了新的活力。

2.1基本原理

2.1.1光的基本原理

2.1电磁表谱表

光谱名称波长范围跃迁类型分析方法

X射线0.1-10nm K和L层电子X射线光谱法

紫外10-380nm 10-20中层电子，200-380价电子紫外光度法

可见380-780nm 380-780价电子比色及可见光度法

红外0.78-1000μm 分子振动红外光谱法

微波0.1-100cm 微波光谱法

无线电波1-1000m 核磁共振光谱法

2.1.2溶液颜色与光吸收的关系

物质呈现的颜色与光有密切的关系，不同波长的可见光可使眼睛感觉到不同颜色。

具有同一种波长的光，称为单色光。含有多种波长的光为复合光。当将某两种颜色的光按适当强度比例混合时，可以形成白光，这两种色光就称为互补色。

2.2光的吸收定律

2.2.1透光度和吸光度

设入射光强度为I 0，吸收光强度为I a ,透射光强度为 I t ，反射光强度为I r ，则 I 0= I a + I t + I r

由于反射光强度基本相同，其影响可相互抵消，上式可简化为： I 0= I a + I t

透光度：透光度为透过光的强度It 与入射光强度I0之比，用T 表示： T= It/I0 吸光度: 为透光度倒数的对数，用A 表示， A=lg1/T=lgI0/It 2.2.2朗伯-比尔定律

朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即

A= κ cl

式中比例常数κ与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。c 为吸光物质浓度，l 为透光液层厚度。

朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。 2.2.3吸光系数

当l 以cm ，c 以g/L 为单位，κ称为吸光系数，用 a 表示。A= a cl a 的单位为L/(g.cm)

当l 以cm ，c 以mol/L 为单位，κ称为摩尔吸光系数，用 ε表示。 ε的单位为L/mol.cm ，它表示物质的浓度为1mol/L

，液层厚度为1cm 时，溶液的吸光度。

比吸光系数是指百分含量为1%， l 为1cm 时的吸光度值，用 表示。 2.2.4偏离朗伯-比耳定律的因素 （1）入射光为非单色光 （2）溶液的不均性。

实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发射等，均可吸光质点的吸光特性变化大。

（3）光程的不一致性。

光源不是点光源，比色皿光径长度不一致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光径不一致，从而与定律偏离。

2.3紫外-可见分光光度计 2.

3.1主要部件的性能与作用

入射光 I 透射光 I %

11cm E

基本结构:

① 光源

在整个紫外光区或可见光区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。

可见光区常用的光源是钨灯或碘钨灯，波长范围是350-1000 nm 。 在紫外区常为氢灯或氘灯，发射的连续波长范围是180-360 nm 。 ②单色器

单色器是将光源辐射的复合光分成单色光的光学装置。它是分光光度计的心脏部分。单色器一般由狭缝、色散元件及透镜系统组成。关键是色散元件，最常见的色散元件是棱镜和光栅。

狭缝：将单色器的散射光切割成单色光。直接关系到仪器的分辨 率。狭缝越小，光的单色性越好。分为入射狭缝和出射狭缝。

棱镜:玻璃350～3200 nm ，石英185～4000 nm 。

光栅:波长范围宽，色散均匀，分辨性能好，使用方便。

1.入射狭缝

2.准直透镜

3.棱镜

4.聚焦棱镜

5.出射狭缝

③吸收池

吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。 吸收池的种类很多，其光径可在0.1~10cm 之间，其中以1cm 光径吸收池最为常用。

5

光源 单色器 样品池 检测器 显示器

④检测器

检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。

⑤信号显示系统

常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。

2.3.2紫外-可见分光光度计的类型

分光光度计按仪器使用波长分类：

①真空紫外分光光度计（0.1-200 nm）；

②可见分光光度计（350-700 nm）；

③紫外-可见分光光度计（190-1100 nm）；

④紫外-可见-红外分光光度计（190-2500 nm）；

如果按仪器使用的光学系统分类：

①单光束分光光度计；

②双光束分光光度计

③双波长分光光度计

④动力学分光光度计

单波长单光束分光光度计

经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。其简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。

目前国内广泛采用721型分光光度计。具有结构简单、价格低廉、操作方便、维修也比较容易，适用于常规分析。

单波长单光束分光光度计还有国产751型、XG-125型、英国SP500型和伯克曼DU-8型等。

单波长双光束分光光度计

经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。

单波长双光束分光光度计有国产710型、730型、740型、日立UV-340型等就属于这种类型。

双波长分光光度计

由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长（λ1和λ2）的单色光；通过折波器以一定的频率交替通过同一样品池，然后由检测器交替接收信号，最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值ΔA。无需参比池。△A就是扣除了背景吸收的吸光度。

双波长分光光度计的优点：是可以在有背景干忧或共存组分吸收干忧的情况下对某组分进行定量测定。

国产WFZ800-5型、岛津UV-260型、UV-265型等都是双波长分光光度计。

动力学分光光度计

解决在光化学反应、辐射化学反应和酶催化反应中，能量转化、酶的降解、生物合成等的反应变化。其特点：时间辨别、快速扫描、测定生物化学瞬间产物的吸收光谱和随时间变化值。

2.3.3紫外-可见分光光度计主要技术指标

①波长范围：表示仪器能测定的波长范围。波长范围越大，仪器越好，这与仪器使用的灯有关。

②波长精度：表示仪器单色器波长误差程度。波长误差越小，仪器精度越高，这与仪器使用的单色器有关。

③杂散光：表示单色光的纯度，这与制作单色器的材料和加工工艺有关。

④光度的测量精度：表示仪器每次测定显示读数的精确度，即仪器能准确读小数点后几位。位数越多，仪器精度越高，这与仪器使用的检测系统有关。

⑤光度测量的重现性：每次A读数的重现性，这与仪器使用的检测器的质量有关。

⑥分辨率：表示仪器分辨吸收光谱微细结构的能力，即指仪器对于紧密相邻的峰可分辨的最小波长间距，这是衡量仪器性能的一个综合指标。

2.3.4分光光度计的校正和检验

①波长校正

②吸光度校正

③杂散光的检验

④稳定性的检验

2.4分析条件的选择

2.4.1仪器测量条件的选择

2.4.1.1适宜的吸光度范围

由朗伯-比尔定律可知：

A=lg1/T=εcl

微分后得：

dlgT=0.4343dT/T= -εl d c

或0.4343ΔT/T= -εlΔc

代入朗伯-比尔定律有：

Δc/c=0.4343ΔT/TlgT

要使测定的相对误差Δc/c最小，求导取极小得出：

lgT=-0.4343=A

即当A=0.4343时，吸光度测量误差最小。

最适宜的测量范围为0.2~0.8之间。

2.4.1.2入射光波长的选择

通常是根据被测组分的吸收光谱，选择最强吸收带的最大吸收波长为入射波长。当最强吸收峰的峰形

比较尖锐时，往往选用吸收稍低，峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测定。

2.4.1.3狭缝宽度的选择

为了选择合适的狭缝宽度，应以减少狭缝宽度时试样的吸光度不再增加为准。一般来说，狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度的十分之一。

2.4.2显色反应条件的选择

在光度分析中，将试样中被测组分转变为有色化合物的反应叫显色反应。能与被测组分生成有色物质的试剂称为显色剂。对多种物质进行测定，常利用显色反应将被测组分转变为在一定波长范围有吸收的物质。常见的显色反应有络合反应，配位反应、氧化还原反应等。

这些显色反应，必须满足以下条件：

①反应的生成物必须在紫外-可见光区有较强的吸光能力，即摩尔吸光系数较大；

②反应有较高的选择性，即被测组分生成的化合物吸收曲线应与共存物质的吸收光谱有明显的差别；

③反应生成的产物有足够的稳定性，以保证测量过程中溶液的吸光度不变；

④反应生成物的组成恒定。

2.4.2.1显色剂用量（M+R→MR）

在实际选用时，一般通过实验来确定：待测组分的浓度和其他条件不变，分别加入不同量的显色剂，分别测定它们的吸光度，以吸光度为纵坐标，显色剂用量为横坐标作图。在对应于吸光度恒定时对应的显色剂浓度区间内确定显色剂的用量。

2.4.2.2显色时间和反应温度

不同的显色反应的速度不同，而且反应温度对反应的速度以及反应产物等均有影响。因此，需要根据反应性质选择合适的显色时间和反应温度。

2.4.2.3反应体系的酸度

酸度对吸光光度分析的影响很复杂，它可以影响配合反应的进行程度，改变金属离子的存在形式和显色剂的颜色，为了选择合适的PH，必须综合考虑各方面的影响，适宜的酸度要由实验来确定。

2.4.2.4采用适当的手段消除干扰物质的干扰

分离物与干扰物的分离：通过前处理，使分析物与干扰物相互分离，然后进行分析，常用的分离方法有：萃取法、离子交换法、电解法、色谱法等。

加入掩蔽剂：在被测液中加入与干扰物质产生稳定的无色络合物的试剂，使干扰物不与显色剂作用。

选择适当的波长：一般选择λmax为入射光波长。如果λmax处有共存组分干扰时，应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。

2.4.3参比溶液的选择

测定试样溶液的吸光度，需先用参比溶液调节透光度（吸光度为0）为100%，以消除其它成分及吸光池和溶剂等对光的反射和吸收带来的测定误差。

参比溶液的选择视分析体系而定，具体有：

①溶剂参比试样简单、共存其它成分对测定波长吸收弱，只考虑消除溶剂与吸收池等因素；

②试样参比如果试样基体溶液在测定波长有吸收，而显色剂不与试样基体显色时，可按与显色反

应相同的条件处理试样，只是不加入显色剂。

③试剂参比如果显色剂或其它试剂在测定波长有吸收，按显色反应相同的条件，不加入试样，同样加入试剂和溶剂作为参比溶液。

④平行操作参比用不含被测组分的试样，在相同的条件下与被测试样同时进行处理，由此得到平行操作参比溶液。

2.5 测定方法

2.5.1单组分定量方法

单组分是指样品溶液中含有一种组分，或者是在混合物溶液中待测组分的吸收峰与其他共有物质的吸收峰无重叠。其定量方法包括校准曲线法、标准对比法和吸收系数法。

1 标准曲线法

方法：配制一系列不同含量的标准溶液，选用适宜的参比，在相同的条件下，测定系列标准溶液的吸光度，作A-c曲线，即标准曲线，也可用最小二乘数处理，得线性回归方程。

在相同条件下测定未知试样的吸光度，从标准曲线上就可以找到与之对应的未知试样的浓度。

2 标准对比法

即将待测溶液与某一标样溶液，在相同的条件下，测定各自的吸光度，建立朗伯-比尔定律，解方程求出未知样浓度与含量。

具体实验步骤：

（1）标准溶液的配制

（2）供试样品溶液的配制

（3）最大波长的确定（波长扫描）

（4）标准曲线的绘制

（5）供试样品含量测定

2.6仪器的使用操作及维护

2.6.1仪器的操作规程

2.6.1.1准备工作

①打开光度计主机电源（预热20-30 min）。

②开启计算机电源。

③双击[UV-Probe]图标，即启动UV-2450的控制程序。

④单击[连接]键，进入光度计自检，自检过程中切勿开启样品室门。自检完毕后，单击[确定]键进入检测界面。

2.6.1.2 测定

①光谱扫描

参数和显示的设置、空白基线校正、供试品测量、光谱测定、数据处理。

②光度测定

参数和显示的设置、空白基线校正、标准品测量、

供试品测量。

③动力学测定

参数和显示的设置、空白基线校正、供试品测量。

④仪器使用完毕，取出样品室内吸收池，退出UV-Probe软件系统。

⑤关闭计算机。

⑥关闭光度计电源。

⑦按要求做好仪器使用登记。

2.6.2仪器的维护

2.6.2.1温度和湿度，室温保持在15～35℃，相对湿度宜控制在45%～80%。防尘、防震、防电磁干扰，仪器周围不应有强磁场。不要暴露在阳光直射的地方，不要放在有腐蚀性气体或在UV波长范围内有吸收的有机和无机气体的环境内。

2.6.2.2如果开机后钨灯和氘灯不亮，应首先检查保险丝。若断了应更换新的保险丝。注意更换保险丝时，关闭电源开关并切断电源。

2.6.2.3为了防止光电管疲劳，不测定时必须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命。

2.6.2.4光度计灯源寿命有限，若长时间不测量，应通过UVProbe软件断开连接（点击“Disconnect”），然后关闭光度计电源。

2.6.2.5仪器自检和扫描的过程中，不要打开样品室盖。

2.6.2.6软件不会自动保存数据，所有的数据要保存都必须点击“Save”或者“Save As”进行另存。否则数据会丢失。

2.6.2.7样品室的出射和入射石英窗不应有污染，不要用手触摸样品室中透光窗面，若不小心接触过，要用无水乙醇擦拭。

2.6.2.8.比色皿的使用方法

①拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。

②清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。如比色皿被有机物沾污，可用盐酸-乙醇混合洗涤液（1∶2）浸泡片刻，再用水冲洗。不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色皿，以免损坏。也不能用毛刷清洗比色皿，以免损伤它的透光面。每次做完实验时，应立即洗净比色皿，用干净绸布或擦镜纸擦干，晾干后，放入吸收池盒中，防尘保存。

③比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干，避免硬的物品把透光面划伤，以保护透光面。

④测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。

⑤吸收池装盛样品以池体的4/5为度，使用挥发性溶液时应加盖。

2.6.2.9注意软件的正常交流，防止计算机病毒感染。

2.6.2.10在停止工作期间，主机样品室内应放入袋装硅胶干燥剂。用防尘罩罩住整个仪器。

2.6.3操作规程问题处理：

2.6.

3.1仪器不能初始化

检查光路是否受堵；关机（电脑及UV）重启；如不成功，查看说明书；

2.6.

3.2数据或谱图波动大

调零是否正确（重新调零）、参比样值是否过大（如果吸收值大于2.0，可能会出现波动大）。

2.6.

3.3基线不能平整（允许波动范围在±0.001之间）

扫描速度是否过快（改“快速”扫描为“中速”扫描或更低）、波长范围是否过窄（扩大扫描波长范围）。2.6.3.4吸收值异常

波长设置是否正确（重新调整波长，并重新调零）、测量时是否调零（如被误操作，重新调零）、比色皿是否用错（测定紫外波段时，要用石英比色皿）、样品准备是否有误（如有误，重新准备样品）。

2.6.

3.5数据不稳

预热时间不够（预热20分钟以上）；环境振动过大、光源附近空气流速大、外界强光照射等;光电管、电路等其它原因（送修）。