氨基酸测定
食品中氨基酸的测定方法
食品中氨基酸的测定方法
《食品中氨基酸的测定方法》
嘿，你知道吗？食品中的氨基酸可是非常重要的呢！那怎么才能知道食品里都有哪些氨基酸以及它们的含量呢？这就涉及到氨基酸的测定方法啦。
有一种常见的方法是高效液相色谱法。
这就像是个超级侦探，能把各种氨基酸都准确地找出来。
它利用特殊的柱子和流动相，让氨基酸在里面乖乖地按顺序跑出来，然后我们就能清楚地看到它们啦。
还有一种方法叫氨基酸自动分析仪法。
这个呀，就好像是个智能小助手，能快速又准确地分析出氨基酸的情况。
它可以把食品中的氨基酸一个一个地分辨出来，并且告诉我们它们的具体信息。
另外呢，还有一些其他的方法，比如茚三酮比色法。
它通过一种特别的反应，让氨基酸显示出颜色来，这样我们就能根据颜色的深浅判断氨基酸的多少啦。
总之，测定食品中氨基酸的方法有很多，每种方法都有它的特点和适用情况。
这些方法就像是我们了解食品营养的钥匙，能帮助我们更好地知道食物里都有什么好东西。
所以呀，学会这些方法真的很重要呢！
我觉得这些测定方法都很神奇，它们让我们能深入了解食品的本质，对于保障我们的健康和饮食安全有着至关重要的作用。
氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)
茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。
称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。
取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。
储成于棕色瓶中，避光保存。
0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。
茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。
亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。
茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。
8第六章 氨基酸定量测定
1.原理： 强离子交换树脂－二乙烯苯树脂： 交联度大，8-12％。 树脂的结构紧密，孔隙度小，适用于分子较小的氨 基酸的分离。选用Na型的树脂。
吸附：一般在pH2.2溶解样品，由于pH比较低，氨 基酸的H＋解离被抑制，氨基酸带正电荷，可以与阳 离子交换树脂发生交换。
样品 液
分离 柱
M
Na+
pK1
COOCH2(CH2)4+NH3
+NH 3
pK2 9.0
COO CH2(CH2)4+NH3 NNH2 NH2
赖氨酸的等当电＝（ pK1＋pK2）/ 2 = 9.75
洗脱：当pH2.2，3.3，4.9等缓冲液相继流经树脂时， 随着pH逐渐升高，氨基酸失去正电荷，与树脂结合 减弱，从树脂上脱落下来。由于氨基酸的氨基不同， 因此与柱子的结合能力不同。 酸性氨基酸带的正电荷少，等电点比较低，碱性氨 基酸带的正电荷多，被置换下来的pH比较高。
吹数分钟(或置于70～80℃烘
箱中烘干)即可观察到紫红色
的氨基酸斑点，脯氨酸例外，
为黄色斑点。
用铅笔圈出氨基酸斑点，量出溶剂前沿的距离及 各斑点中心与起点之间的距离，并计算各氨基酸 的Rf值。
原点到层析点中心的距离
Rf＝ 原点到溶剂前沿的距离
标准氨基酸薄层层析色谱
氨基酸的性质与Rf之间的关系
层析的分离是基于氨基酸的非极性性质。 物质的极性越小（即非极性越大）,在有机溶剂中分 配就越多，迁移率Rf就越大；
混合样
加样
洗脱剂
分离结果
影响电离的基团：氨基、羧基、胍基、咪唑基、酚基。
洗脱顺序： 酸性氨基酸，中性氨基酸，芳香族氨基 酸，碱性氨基酸 日立832型氨基酸分析仪的洗脱顺序： 天门冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，半胱，缬，蛋， 异亮，亮，酪，苯丙，赖，氨，组，精
酸水解法测定氨基酸
酸水解法测定氨基酸
1氨基酸
氨基酸（Amino Acid）是生物中最为重要的有机物质，它不但是细胞的结构构成单元，而且还是一系列生物代谢及活性磷脂的组成成分。
氨基酸在生物体内分子运输、能量代谢以及蛋白质的构成、修饰、功能之中发挥着重要作用。
2氨基酸酸水解法
酸水解法（acid hydrolysis）是用酸（如硝酸、硫酸或盐酸）将氨基酸分解成其单体。
当氨基酸溶液的pH在2-3左右时，它的胺基和醛基都处于电离态，与酸结合而变成游离的根离子，从而形成仅盐酸可分解的混合物，这样就可以在酸��液中测定氨基酸了。
3酸水解过程
氨基酸酸水解法的处理首先用不同浓度的抗泡酸以及一定的时间孵育，或用热水或水蒸气加热，这样将氨基酸分解为单体。
然后，将水溶液中的残留物与盐酸进行混合，再用生物分析仪将氨基酸按其吸光度测定，最后，确定不同含量的氨基酸的比例关系，从而得出氨基酸的构成比例。
4氨基酸酸水解法的优点
氨基酸酸水解法相对于其他测定氨基酸方法，它有几个优点。
首先，氨基酸能容易降解、更容易侦测。
其次，由于它使用了非常高浓
度的HCl，因此氨基酸的分解反应是很快的，结果也非常准确。
再者，它是一种比较简便的方法，它利用实验室常用仪器如吸光度仪、pH仪甚至可以使用色谱装置等来简化测定过程，操作轻松易行。
5综上所述
氨基酸是生命的基础物质，具有重要的生理功能和生物活性，但是由于其分子结构的复杂性，在生物分析过程中，对其分子结构的体系性理解和定量分析是一项艰巨且重要的任务。
氨基酸酸水解法明显比其他测定氨基酸的方法有着更高的灵敏度和准确度，操作简单、实时性强等优点，可广泛的应用于生物领域，是一种价值更高的技术。
氨基酸的测定方法
食物中氨基酸的测定方法测定食物中的胱氨酸使用过甲酸氧化-氨基酸自动分析仪法，测定色氨酸使用荧光分光光度法，测定其它氨基酸使用氨基酸自动分析仪法。
一、氨基酸自动分析仪法1.原理食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。
一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，缬，蛋，异亮，亮，酪，苯丙，组，赖和精氨酸等16种氨基酸，其最低检出限为10pmol。
2.适用范围GB/T14965-1994食物中氨基酸的测定方法。
本法适用于食物中的16种氨基酸的测定。
其最低检出限为10pmol。
本方法不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定3.仪器和设备3.1真空泵3.2恒温干燥箱3.3水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30ml。
用去离子水冲洗干净并烘干。
3.4真空干燥器（温度可调节）3.5氨基酸自动分析仪。
4.试剂全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。
4.1浓盐酸：优级纯4.26mol/L盐酸：浓盐酸与水1：1混合而成。
4.3苯酚：需重蒸馏。
4.4混合氨基酸标准液（仪器制造公司出售）：0.0025mol/L4.5缓冲液：4.5.1 pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠（Na3C6H5O7.2H2O）和16.5ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.24.5.2 pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节至pH至3.3。
4.5.3 pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9ml浓盐酸加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。
4.5.4 pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠（优级纯）加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。
氨基酸的测定
甲醛滴定法 （以测定氨杞精口服液中的氨基酸含量为例）
计算： 氨基酸态氮=〔 c×（V2-V1）
×0.014×100） 〕/W×100 V1——用中性红为指示剂
时，碱液所消耗的体积 V2——用百里酚酞乙醇液
为指示剂时标液消耗量
应用： 氨杞精口服液是由天然原料提
取的氨基酸粉(含20多种氨基酸)， 加上构祀子、黄精煎煮液配制而 成的口服液。其中氨基酸为主要 有效成份， 采用甲醛滴定法测定 氨基酸的总量做为质量控制方法， 操作简便 。
仪器 附磁力搅拌器的酸度计;25mL酸式 滴定管; 10mL胖肚吸管。
双语例句
电位滴定法 （以测定酱油中的氨基酸含量为例）
操作方法：
（1）样品处理：先测出待测酱油的比重，然后吸取酱油5.00mL于
100mL容量瓶中,加水定容。吸取定容液20.00mL于250mL烧杯中,
加水60mL，放入磁力转子，开动磁力搅拌器使转速适当。用
个别氨基酸的定量测定
a)赖氨酸 b)色氨酸 c)苯丙氨酸 d)酪氨酸 e)脯氨酸 f)羟脯氨酸 g)胱氨酸 h)谷氨酸
氨基酸的分离及测定
a)薄层色谱法 b)氨基酸自动分析仪法 c)气相色谱法 d)高效液相色谱法
茚三酮法 （以测定蜂蜜及果葡糖浆中的氨基酸含量为例）
反应原理
氨基酸在一定pH条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可 比色(570nm)定量。 注意：茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深 红色，使用前要进行纯化,方法如下：
结论
1)采用茚三酮显色法测定的 蜂蜜及果葡糖浆的氨基酸含 量在0~150 μg/mL范围，该 法具有线性好、准确性及精 密度高等特点。
2)蜂蜜与果葡糖浆混合物中 的氨基酸含量和果葡糖浆掺 入量呈良好的负线性关系。 采用茚三酮显色法测定蜂蜜 样品的氨基酸含量，可以快 速判断蜂蜜中是否掺入了果 葡糖浆。
氨基酸测定方法
氨基酸测定方法一、引言氨基酸是构成蛋白质的基本单位，因此对于蛋白质的研究和分析，氨基酸的测定是非常重要的。
目前，常用的氨基酸测定方法主要有色氨酸法、二硫化物法、硫酸铜法、乙醇胺法、二甲基乙二胺法等。
本文将从样品处理、试剂配制、实验步骤和数据处理等方面详细介绍氨基酸测定方法。
二、样品处理1. 样品收集：选择适当的组织或液体样品进行采集，如血清、尿液等。
2. 样品预处理：根据不同样品特点进行预处理，如尿液中可加入少量硝酸使其变为无色透明状态。
3. 样品保存：在低温条件下保存样品以避免其蛋白质降解。
三、试剂配制1. 氢氧化钠溶液：取固体氢氧化钠加入去离子水中搅拌至完全溶解。
2. 硫代乙酰胺溶液：取固体硫代乙酰胺加入去离子水中搅拌至完全溶解。
3. 氨基酸标准溶液：将各种氨基酸按照一定比例加入去离子水中，调节pH值至7.0左右。
4. 还原剂：取固体羟肟酸钠加入去离子水中搅拌至完全溶解。
四、实验步骤1. 样品处理：取适量的样品加入硫代乙酰胺溶液中，混合均匀后放置于60℃恒温水浴中反应20分钟。
2. 加入还原剂：将还原剂加入反应体系中，混合均匀后再次放置于60℃恒温水浴中反应20分钟。
3. 加入氢氧化钠溶液：将氢氧化钠溶液加入反应体系中，混合均匀后放置于60℃恒温水浴中反应30分钟。
4. 加入试剂：取适量的氨基酸标准溶液和待测样品分别加入反应体系中，混合均匀后放置于室温下静置10分钟。
5. 测定吸光度：使用分光光度计在570nm波长下测定反应体系的吸光度值。
五、数据处理1. 绘制标准曲线：将不同浓度的氨基酸标准溶液分别测定吸光度值，绘制标准曲线。
2. 计算待测样品中氨基酸含量：根据待测样品的吸光度值和标准曲线计算其中氨基酸含量。
3. 数据统计分析：对实验数据进行统计分析，如平均值、方差等。
六、注意事项1. 实验过程中要注意卫生和安全，避免试剂进入眼睛和口腔。
2. 样品处理时要避免过度稀释或过度浓缩，以保证实验结果的准确性。
测定氨基酸,磺基水杨酸的方法
测定氨基酸,磺基水杨酸的方法
测定氨基酸的方法主要有以下几种：
1. 布鲁斯试剂法：使用布鲁斯试剂与氨基酸发生反应，生成紫色或蓝色络合物，通过比色法或光度法来测定氨基酸的含量。
2. 紫外光谱法：氨基酸在紫外光下有特征性的吸收峰，通过测量吸收峰的强度来确定氨基酸的浓度。
3. 核磁共振法：使用核磁共振仪器对氨基酸样品进行分析，通过观察氨基酸在不同磁场下的共振信号来确定其结构和浓度。
磺基水杨酸的测定方法主要有以下几种：
1. UV-Vis光谱法：磺基水杨酸在紫外光下有特征性的吸收峰，通过测量吸收峰的强度来确定其浓度。
2. 氯化亚砜法：磺基水杨酸与氯化亚砜反应生成产物，通过测量产物浓度来确定磺基水杨酸的浓度。
3. 离子色谱法：使用离子色谱仪对磺基水杨酸进行分析，通过观察峰的面积或高度来确定其浓度。
请注意，以上方法仅为常用的测定方法之一，具体使用哪种方法还要根据实际情况来确定。
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茚三酮显色法测定氨基酸的含量一．原理：凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
二．仪器：721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。
三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3 mmol/L 溶液（2）pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。
用pH 检查校正。
（3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇。
（5）样品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸。
茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。
加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。
次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。
还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g 茚三酮，用12.5mL 沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。
将0.5g 维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。
滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。
四、操作步骤1．标准曲线的制作分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL。
各加入1mL pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液；再加入1mL 茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。
放置5min 后，加入3mL60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。
（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。
以OD570nm 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。
1234560.3 mmol 标准氨基酸溶液00.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.80.60.40.22mol/L醋酸缓冲液111111茚三酮显色液111111OD570混匀，盖住试管口后在100°水浴加热15min，然后用自来水冷却。
放置5min 后，加入3ml 60%的乙醇稀释，充分摇匀。
2．氨基酸样品的测定取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液1mL 和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。
放置5min 后，加3mL 60％乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min 内稳定）。
将样品测定的OD570nm 与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。
4.1光度分析法β-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质，其颜色深浅主要与β-氨基丙酸的浓度有关。
因此可利用此显色反应采用比色法定量测量β-氨基丙酸。
我在实验中发现很多因素如浓度、pH值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响。
如忽视这些因素会使实验产生很大的误差。
就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究。
4.1.1试剂的配制：缓冲液的配制：配制pH= 6.00的NaAc－HAc缓冲溶液β-氨基丙酸标准溶液的配制：用电子天平准确称取1.020 gβ-氨基丙酸(生化纯)，溶于250ml pH=6.00缓冲溶液中，得到C = 4.080 g/L标准溶液。
茚三酮试剂的配制：称取0.5g茚三酮溶于100ml蒸馏水中，得到5g/L的茚三酮水溶液。
4.1.2标准曲线的确定分别准确移取0.30ml、0.40ml、0.50ml、0.60ml、0.70ml、0.80ml、0.90ml、1.00ml标准液于8个比色管中，用pH=6.00的缓冲溶液稀释到5.00ml再加入1ml茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热10min。
冷却到室温，用7230型分光光度计在569nm下测其吸光度。
以吸光度和浓度作一个标准曲线。
4.1.3样品的测定稀释待测液于0.24mg/ml—0.73mg/ml,调pH值到6.00，以相同的反应条件，测其吸光值并与上面的标准曲线对照查出稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为β-氨基丙酸的浓度。
4.1.4 标准曲线的测定结果β-氨基丙酸浓度在0.24mg/ml—0.73mg/ml范围内与茚三酮水溶液反应，颜色表现出由浅蓝到深蓝的递增变化。
用茚三酮比色法测得的一组数据得到的标准曲线如图1：4.1.5样品的测定分析将待测的一批稀释50倍，母液稀释的程度可以根据以与标准溶液在相同的反应条件下反应，再观察样品的显色程度而确定。
取稀释后的产物液1ml,用pH=6.00的缓冲液稀释到5ml再加入1ml茚三酮水溶液，在沸水中加热10min,4.1.6 浓度对显色反应的影响:实验表明，β-氨基丙酸与茚三酮水溶液在表3所注的条件反应的最低浓度为0.24mg/ml，随着β-氨基丙酸的浓度变大显色逐渐变深。
当浓度大于0.73mg/ml时，所显颜色过深或生成紫色化合物影响其吸光度。
当β-氨基丙酸的浓度在0.24mg/m—0.73mg/ml时，颜色变化明显而且稳定，因此，我选定此浓度范围作为测定范围。
得到的数据如表4：4.1.7 pH值对显色反应的影响[8]以1.5mg/ ml的标准溶液5ml，加入1ml茚三酮水溶液在沸水中加热10min,观察到的颜色变化如表5：显色反应随着pH值得不同，颜色有着明显的变化。
当pH值小于3.42时几乎无色，而在pH 值在3.78—7.44时颜色变化明显。
pH值为6.00，加热不到二分钟即显色；pH值为9.05，加入茚三酮溶液后不加热30s左右即显红棕色；茚三酮水溶液在强碱的条件下带有明显的淡黄色。
因此pH值为6.00左右最好。
故我选定pH值为6.00。
此时显色明显无干扰且稳定。
4.1.8温度和反应时间的影响：实验表明：温度和反应时间对此显色反应的影响很大。
温度太低，反应太慢导致显色时间长，而且显色效果不好。
而温度过高，反应时间长对此反应影响也很大，会生成紫色化合物影响其吸光度。
在显色反应中，反应时间主要根据具体的颜色变化而定。
一般来说，β-氨基丙酸浓度在0.24mg/ml—0.73mg/ml时，在沸水中加热10min即可，时间太短，反映不完全颜色梯度不明显。
时间过长，溶液挥发严重也影响其吸光度。
故我把反应时间定在10min左右。
4.1.9其他因素的影响不同溶剂的茚三酮溶液对显色反应也有一些影响。
为了区别它们对显色反应的影响，我做了如下实验：分别称取0.2002g茚三酮三份，分别溶于乙醇、水、丙酮各100ml中，可以观察到：丙酮溶解茚三酮的速度最快，乙醇次之。
移取β-氨基丙酸标准溶液(4.080g/l)1ml三份,用pH值为6.00的NaAc－HAc缓冲溶液稀释到5ml再依次加入1ml茚三酮水溶液、乙醇溶液以及丙酮溶液，在沸水中加热。
实验表明：在加热2min时，乙醇溶液开始显色；丙酮溶液的显红棕色；水溶液无色。
在加热6min时，丙酮溶液的颜色加深；水溶液显浅蓝色；乙醇溶液的所显颜色最深。
乙醇易挥发，在加热的条件下挥发更严重。
基于这一点的考虑，我采用茚三酮水溶液。
而茚三酮的用量对此显色反应的影响不大，可以选择5ml的被测液与1ml(5g/l)的茚三酮水溶液反应。
测定时，最好选择标样与待测液在同一水浴。
这样可以减少误差提高测定的准确度。
另外，当被测液中含有其他的氨基酸或是含氨基的化合物也可以与茚三酮发生显色反应，影响测定结果。
总之，茚三酮比色法作为一种β-氨基丙酸的定量检测方法具有操作简单、成本低的优点。
只要控制好反应条件就能得到较好的测量结果。
三．茚三酮比色法：1原理：氨基酸在一定pH范围内，能与茚三酮生成兰紫色化合物。
可以用比色法定量测定。
2试剂：（1）磷酸缓冲液（pH.8.04）制备方法如下：称磷酸二氢钾4.5350g。
定容500ml称NAH2PO4·12H2O 11.9380g分别溶解定容500ml取磷酸二氢钾10ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液（2）2%茚三酮溶液：称茚三酮1g→溶于35ml热水→加入40mg氯化亚锡（SnCl2·H2O）搅拌过滤（作防腐剂）→于冷暗处过夜→定容50ml①氨基酸标液称干燥氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g→溶解定容100ml→摇匀→吸10ml于另外100ml容量瓶定容100ml，即得200Ug/ml标液3操作方法：（1）绘制标准曲线：取7个25ml容量瓶，吸取标液0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0ml于7个25ml容量瓶，加水补充至容积为4ml，然后加茚三酮和缓冲液各1ml，于水浴加热15分钟，冷却后定容25ml，静置15分钟，在570nm下测消光值，绘制标准曲线。
（2）样品测定：取样品5.00~10.0g（液体样5-10ml）→于烧杯中→加50ml水和活性碳约5g→加热过滤→用30—40ml热水洗涤活性炭→吸澄清样液1~4ml→加茚三酮和缓冲液各1ml水浴加热15分钟，冷却定容，静置15分钟于570nm下测定消光值，按下式计算氨基酸含量。
氨基酸含量（毫克/100克）=C/（W×1000）×100C——从标准曲线上查得得氨基酸的量（Ug）W——测定得样品溶液相当于样品的量（g）注意事项：茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深红色，使用前要进行纯化，方法如下：取10g茚三酮容于40ml热水中，加一克活性炭，摇匀静置30分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过滤，即出现兰色结晶，过滤，用2ml冷水洗涤结晶，置干燥皿中干燥，装瓶备用。
茚三酮显色法测定氨基酸含量。