纤维素降解菌..
纤维素降解菌菌落特征
纤维素降解菌菌落特征摘要纤维素是一种常见的生物质，具有广泛的应用前景。
纤维素降解菌是一类能够分解纤维素的微生物，对于纤维素的降解起着关键作用。
本文将详细介绍纤维素降解菌菌落特征，包括形态、生长条件、代谢途径等方面，为深入研究纤维素降解机制和应用提供参考。
1. 引言纤维素是一种由葡萄糖分子构成的多糖，广泛存在于植物细胞壁中。
由于纤维素的高强度、低能值等特点，其降解一直是科学家们的研究热点。
纤维素降解菌是能够分解纤维素的微生物，可以将复杂的纤维素分解成较简单的可利用碳源，具有重要的应用价值。
2. 纤维素降解菌的形态特征纤维素降解菌在形态上具有一定的特征，如形状、大小等。
主要表现为以下几个方面：2.1 菌落形态纤维素降解菌菌落形态多样，包括分散菌落和粘附菌落。
分散菌落呈点状或星状，边界清晰，颜色多为白色或淡黄色。
粘附菌落则呈不规则形态，边界模糊，颜色多为淡黄色或褐色。
2.2 菌体形状纤维素降解菌的菌体形状主要有纤维状、棒状、球状等。
纤维状的菌体长而细，类似于纤维素的形态；棒状的菌体较短而粗，类似于棒状杆菌；球状的菌体则呈圆形或卵圆形。
2.3 纤维素降解菌的其他形态特征除了上述形态特征外，纤维素降解菌还具有菌落大小、菌体长度等变异性。
不同的纤维素降解菌在形态特征上存在一定的差异，这也为纤维素降解机制的研究提供了基础。
3. 纤维素降解菌的生长条件纤维素降解菌的生长需要适宜的条件，包括温度、pH值、营养物质等。
以下是纤维素降解菌生长的一些关键条件：3.1 温度纤维素降解菌的适宜生长温度一般在30-40摄氏度之间。
温度过高或过低都会抑制其菌落形成和生长，影响纤维素降解效率。
3.2 pH值纤维素降解菌对pH值的适应范围较广，一般在5-9之间。
过低或过高的pH值都会对纤维素降解菌的生长产生不良影响。
3.3 营养物质纤维素降解菌对不同的营养物质有不同的需求。
一般需要提供适量的碳、氮、矿物质等营养物质，以维持其正常的生长和代谢。
纤维素降解菌在食品加工中的应用研究
纤维素降解菌在食品加工中的应用研究引言：纤维素是一种常见的多糖类物质，广泛存在于植物细胞壁中，是植物的主要结构组分之一。
然而，由于人类缺乏纤维素酶，无法将纤维素降解成为可被消化吸收的营养物质。
因此，纤维素降解菌的发现与应用，成为了解决这一难题的关键。
第一部分：纤维素降解菌的特点与分类纤维素降解菌是一类能够分解纤维素的微生物菌株。
它们具有以下几个特点：首先，纤维素降解菌产生的纤维素酶能够有效地降解纤维素。
其次，纤维素降解菌对各种来源的纤维素具有很高的适应性，可以分解从植物废弃物到农业副产品等多种纤维素来源。
最后，纤维素降解菌可以利用纤维素作为唯一碳源并快速增殖，提供了一种廉价的能源和无污染的途径。
第二部分：纤维素降解菌在食品加工中的应用1. 纤维素降解菌在酿造业中的应用酿造业是纤维素降解菌的一个重要应用领域。
纤维素降解菌能够高效降解酿造中产生的废弃物，并进一步将其转化为酒精、有机酸等有机物。
这不仅能够减少废弃物对环境的污染，还能够提高资源的利用率，降低生产成本。
2. 纤维素降解菌在面包制作中的应用纤维素降解菌在面包制作中的应用是另一个有潜力的领域。
传统的面包制作过程中，通常需要添加大量的改良剂和添加剂来提高面团的性质。
然而，纤维素降解菌可以分解面粉中的纤维素，释放出更多的糖分，从而提高面团的发酵性能和风味。
3. 纤维素降解菌在乳制品生产中的应用乳制品生产中的废弃物主要包括乳清和乳酸菌发酵后的残渣等。
纤维素降解菌可以将这些废弃物进行高效降解，并将之转化为有机肥料和生物柴油等可再利用的资源。
这不仅减少了废弃物对环境的压力，还提高了资源的回收利用率。
结论：纤维素降解菌在食品加工中的应用研究，为人类解决了纤维素难以消化吸收的问题，同时降低了废弃物对环境的污染程度，提高了资源的利用效率。
随着纤维素降解菌相关技术的不断创新和发展，其在食品加工中的应用前景将更加广阔。
研究者可以进一步探索纤维素降解菌的特性和降解机制，以提高其在食品加工中的应用效果，并推动相关技术的商业化应用。
纤维素降解菌的筛选及其产酶特性
纤维素降解菌的筛选及其产酶特性杨艳;姜立春;林寿露;杨熙;彭显清;彭正松;阮期平【摘要】The optimal CY10 producing strain of enzyme producing conditions are the experimental basis for the biodegradation of cellulose.A cellulose - degrading bacterial strain was isolated from the rottenwood and its some important culture conditions and enzymatic properties were studied. The optimal enzyme producing condi-tions for this degrading bacterial strain were acquired as follows:wheat bran(as carbonsource)concentration 20 g / L,yeast powder(as nitrogens ource)concentration 5. 0 g / L,culture temperature 30 ℃,initial pH 6. 5,cul-ture time 42 h. The optimum temperature and optimal pH value for the activities of CMC enzyme and filter - paper enzyme produced by this degrading bacterium were 45 ℃ and 6. 5,resp ectively. Under these conditions,the CM-Case and FPase activity of CY10 strain were 21. 26 U/ mL and 23. 57 U/ mL,respectively. Therefore,the CY10 strain has a good prospect in the biodegradation of cellulose.%优化纤维素降解菌株 CY10产酶条件，为该菌株在纤维素的生物降解方面提供实验依据.通过单因素试验对 CY10菌株产酶条件进行优化，依据纤维素酶（CMCase）和滤纸糖化酶（FPase）活力大小确定最适培养时间、初始 pH、碳源、氮源、温度、接种量及装液量等.结果表明：菌株 CY10产酶的最适初始 pH 为6.5，碳源为麦麸（2.0%），氮源为酵母粉（0.5%），在30益培养42 h；该菌株所产 CMC 酶和滤纸酶的酶活性最适温度为45益，最适 pH 为6.5.在此条件下，CY10菌株的 CMCase 和 FPase 活力分别达到21.26 U/ mL 和23.57 U/ mL.为此，菌株CY10在纤维素的生物降解方面具有较好的应用前景.【期刊名称】《绵阳师范学院学报》【年(卷),期】2016(035)005【总页数】7页(P65-71)【关键词】纤维素降解菌;纤维素酶;培养条件;优化;酶学性质【作者】杨艳;姜立春;林寿露;杨熙;彭显清;彭正松;阮期平【作者单位】西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，四川南充637009; 绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室，四川绵阳 621006;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室，四川绵阳 621006;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室，四川绵阳 621006;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室，四川绵阳 621006;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室，四川绵阳 621006;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，四川南充 637009;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室，四川绵阳 621006【正文语种】中文【中图分类】Q939.9纤维素是地球上分布最广泛、含量最丰富的可再生有机资源，其不断通过光合作用得以补充[1].在自然环境中，纤维素类物质形态稳定且降解缓慢，目前对其利用很不充分，除小部分用于堆肥、畜禽饲料外，大部分作为燃料直接燃烧，不仅造成资源浪费，同时也会污染环境[2].因此，人类对于纤维素资源的利用程度比较有限，还处在一种低值化、无序化状态[3].对纤维素降解问题的研究能够为解决环境问题和纤维素资源的开发利用问题提供重要的理论依据.如能科学合理利用纤维素不仅可以减少废弃物对环境的污染，还可以提供一种可再生资源.采用合适的方法与技术对这些可再生的纤维素资源降解为可利用的生物有机质，对解决当今所面临的食物短缺、能源危机和环境污染问题具有重大的现实意义[4].目前，对于纤维素分解菌选育应用研究较多的是细菌、放线菌与真菌，尤以曲霉、木霉和青霉较为普遍[5-8].我国是农业大国，秸秆是我国丰富的可再生资源，但是每年大部分的秸秆被焚烧和废弃，尤其是在东北地区，不仅造成资源的浪费，同时也造成严重的环境污染.因此，开发高效利用纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，具有极其重要的意义和发展前景.本研究综合利用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水解圈测定法和胞外酶活测定法，针对纤维素降解问题，进行了纤维素降解菌的筛选，并对其产酶条件优化及酶学性质进行了初步研究.1.1 材料1.1.1 样品采集腐烂的枝条与朽木.1.1.2 主要试剂及仪器羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、刚果红、DNS溶液，醋酸钠缓冲溶液，新华滤纸；可见光分光度计、高速低温离心机、超净工作台、恒温培养摇床、超低温冰箱等.1.1.3 培养基牛肉膏蛋白胨培养基(g/L)：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，琼脂20.0，pH 7.2-7.4.羧甲基纤维素钠培养基(g/L)[9-10]：CMC-Na 10.0，KH2PO4 1.5，NaH2P O4·7H2O 2.5，MgSO4·7H2O 0.3，FeSO4·7H2O 0.005，ZnCl2 0.0017，MnSO4 0.001 6，(NH4)2SO4 1.5，pH 7.0.产酶发酵培养基(g/l)[9]：NaCl 5.0 g、K2HPO4 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCl2 0.3 g，FeSO4·7H2O 5.0 mg，MnSO4 1.6 mg，ZnCl2 1.7 mg，CoCl2 2.0 mg，pH 调至7.2.以上培养基均121 ℃灭菌20 min.1.2 实验方法1.2.1 菌株的筛选用无菌生理盐水浸泡采集腐烂的枝条、朽木样品，在摇床振荡3 h.取样品悬液，用无菌水梯度稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的浓度，吸取稀释浓度为10-3、10-4、10-5的稀释液，涂布于羧甲基纤维素钠培养基上，置于30 ℃培养箱中培养36-60 h.将分离得到的纤维素降解菌点样接种到CMC-Na平板培养基上，30 ℃倒置培养48 h 后，向培养皿中加入适量1.0 mg/mL的刚果红染液，染色30 min，倾去染液，加入适量1.0 mol/L的NaCl溶液，浸泡30 min，依据透明圈与菌体直径比选择高产酶菌株[2].挑取高产菌落进行平皿划线分离，获得一系列单菌落，连续挑选优势单菌落多次划线直至获得各菌株的纯培养，将分离纯化后的菌株斜面接种于牛肉膏蛋白胨培养基上培养2-3 d，观察菌落形态.最后将菌种于斜面上，4 ℃冰箱保存待用.1.2.2 酶活性测定(1)CMC酶活性测定[2, 11]：菌液在4 ℃、8 000 r/min的条件下离心10 min，取0.5 mL上清液(粗酶液)，加入0.5 mL 0.2 %羧甲基纤维素钠(CMC-Na)底物溶液，50 ℃恒温水浴锅中温育1h，然后加入2 mL DNS试剂，再100 ℃沸水浴10 min终止反应，室温冷却后在520 nm下测定光吸收值，酶液沸水浴处理10 min 后作为阴性对照，每个样品做3个平行.(2)滤纸糖化酶(FPase)的测定[12]：菌液在4℃、8 000 r/min的条件下离心10 min，取0.5 mL上清液(粗酶液).将新华滤纸剪成规格为1cm×6cm的长条，放入试管中，取粗酶液1 mL，加入醋酸缓冲液2 mL，50 ℃恒温水浴50 min后取出，加入2mL DNS试剂终止反应，摇匀后于沸水浴中煮沸显色5 min，取出室温冷却后，按DNS法在520 nm下测定光吸收值进行还原糖测定，酶液沸水浴处理10 min后作为阴性对照，每个样品做3个平行.1.2.3 酶活定义酶活力单位定义：每毫升酶液在1 min内催化底物生成1 μg葡萄糖所需要的酶量，即1 U/mL.酶活力计算公式：Y=(A×V×1 000)/(0.5×T)，式中A：从标准曲线查出净葡萄糖的浓度(g/L)；V：总体积；0.5：测定时吸取粗酶液的毫升数；T：反应时间.1.3 培养条件的优化1.3.1 培养时间从6 h开始测量酶活，间隔6 h取样1次，30 ℃、150 r/min 摇床培养60 h，分别测CMC酶活性及滤纸酶活性.1.3.2 碳源及其浓度对产酶活性的影响碳源条件优化，以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、麦芽糖、乳糖、麦麸、葡萄糖、蔗糖、微晶纤维素(Avicel)和玉米粉作为唯一碳源，30 ℃、150 r/min摇床培养36 h，分别测CMC 酶活性及滤纸酶活性.在碳源确定的基础上，试验分析碳源浓度为5、10、20、30、40、50 和60 g/L的条件下，30 ℃、150 r/min摇床培养36 h，分别测CMC 酶活性及滤纸酶活性.1.3.3 氮源及其浓度对酶活性的影响在碳源及其浓度确定的基础上，试验考察胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、NH4Cl、NaNO3、(NH4)2SO4、NH4NO3、KNO3和尿素作为唯一氮源，30 ℃、150r/min摇床培养36 h，分别测CMC酶活性及滤纸酶活性.在氮源源确定的基础上，试验分析氮源浓度为1、3、5、7、9和12 g/L的条件下，30 ℃、150 r/min摇床培养36 h，分别测CMC 酶活性及滤纸酶活性.1.3.4 初始pH对酶活性的影响在碳源及氮源确定的基础上，试验考查初始pH梯度为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，30 ℃、150 r/min摇床培养36 h，分别测CMC酶活性及滤纸酶活性.1.3.5 培养温度对酶活性的影响在碳源、氮源及初始pH确定的基础上，试验考察培养温度为15、20、25、30、35和40 ℃，150 r/min摇床培养36 h，分别测CMC酶活性及滤纸酶活性.1.3.6 接种量对酶活性的影响在碳源、氮源、初始pH及培养温度确定的基础上，试验考察分别接种不同的菌量(0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL)，经发酵36 h后，分别测CMC 酶活性及滤纸酶活性.1.3.7 装液量对酶活性的影响在碳源、氮源、初始pH、培养温度及接种量确定的基础上，试验考察分别接种不同的装液量(25、50、75、100、125 mL)，经发酵36 h 后，分别测CMC酶活性及滤纸酶活性.1.4 酶学性质研究1.4.1 最适温度最适发酵培养条件下得到的粗酶液，将反应体系的温度分别设定为30、35、40、45、50、55、60和70 ℃，测定粗酶液在不同反应温度下的CMC酶活性和滤纸酶活性.1.4.2 最适pH最适发酵培养条件下得到的粗酶液，将反应体系的pH值分别调到5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，在最适反应温度条件下反应30 min，分别测CMC酶活性和滤纸酶活性.2.1 纤维素降解菌的筛选经过初筛培养获得大量纯培养菌株，在刚果红纤维素培养基上经刚果红染色后，以培养72 h后透明圈直径与菌落直径之比大于2为筛选标准，共有3株菌株有水解圈步筛选得到3株纤维素降解菌，其中菌株CY10透明圈直径与菌落直径最大为5.36，再液体培养测CMC酶活性和滤纸酶活性3.35 U/mL和4.63 U/mL，最终确定酶活性最高的菌株CY10为研究菌株.2.2 发酵条件对纤维素降解菌产酶活性的影响2.2.1 培养时间按照方法1.3.1对产酶时间进行优化.酶活性测定结果如图1所示，该菌培养6 h 即可检测到酶的产生，随着培养时间的延长，发酵液中CMC酶活性和滤纸酶活性逐渐增强.当培养到42 h时，CMC酶和滤纸酶活性达到最高值，分别为2.70U/mL和4.02 U/mL；后随着培养时间的延长，发酵液中CMC酶和滤纸酶活性反而呈下降趋势.因此，CY10菌株最适培养时间为42 h.2.2.2 碳源按照方法1.3.2，分析碳源对产酶的影响，在发酵培养基中分别加入1.0 %不同的碳源，考察碳源对产酶的影响，其结果如图2所示.碳源是维持菌体细胞生长和代谢的重要能源物质[2].当碳源为麦麸时，CMC酶和FPA酶活性均达到了较高的酶活性，分别为4.61 U/mL和6.52 U/mL；当乳糖、葡萄糖、麦芽糖和微晶纤维素作为碳源时，CMC酶活性和滤纸酶活性都较弱，均低于3.0 U/mL.因此，选用麦麸作为该菌培养的最适碳源.为确定碳源不同浓度对酶活性的影响，分析了麦麸浓度不同梯度对产酶活性的影响.结果见图3所示，随着麦麸浓度的增加，该菌的CMC酶活性和滤纸酶活性逐渐升高，当其浓度为20 g/L时，滤纸酶活性和CMC酶活性达到最高值，分别为4.6U/mL和6.2 U/mL当麦麸浓度高于2.0 %时，CMC酶活性和滤纸酶活性均有所降低.因此，选用20 g/L作为该菌培养时的最适碳源浓度.2.2.3 氮源按照方法1.3.3，分析氮源对产酶的影响，在发酵培养基中分别加入0.3 %不同的氮源，考察氮源对产酶的影响，其结果如图4所示.微生物的生长代谢离不开氮源，氮源是组成蛋白质和核酸的主要物质.当氮源为无机氮如(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl和NaNO3时，CMC酶活性和滤纸酶活性均较弱，且低于2.0 U/mL；当氮源为有机氮时，该菌发酵液的CMC酶活性和滤纸酶活性相对于无机氮来说均有明显的增高，当酵母粉作为氮源时，CMC酶活性和滤纸酶活性都达到最高，分别为3.23 U/mL和3.86 U/mL.因此，选用酵母粉作为该菌的最适培养氮源.为确定氮源不同浓度对酶活性的影响，分析了酵母粉浓度不同梯度对产酶活性的影响.结果见图5所示，随着酵母粉浓度的增加，该菌的CMC酶活性和滤纸酶活性逐渐升高，当其浓度为5.0 g/L时，滤纸酶活性和CMC酶活性达到最高值，分别为9.65 U/mL和10.52 U/mL；当酵母粉浓度高于0.5 %时，CMC酶活性和滤纸酶活性均有所降低.因此，选用5.0 g/L作为该菌培养的最适氮源浓度.2.2.4 初始pH不同的微生物对pH条件的适应范围与能力都有所不同，为此按照方法1.3.4分析不同初始pH对菌株CY10产酶活性的影响.酶活性测定结果见图6所示，当初始培养pH低于5.5时，不利于酶的生产；当pH在5.5-7.5时，该菌生产的CMC酶活性和滤纸酶活性相对较高，当pH为6.5时，产酶活性达到最高分别为14.56 U/mL和18.23 U/mL；当pH大于6.5时，随着初始pH的升高，该菌生产的酶的CMC酶活性和滤纸酶活性都呈下降趋势；当pH高于8.5对酶活力造成很大影响.因此，选用pH6.5作为该菌初始培养的pH.2.2.5 培养温度按照方法1.3.5分别设计在不同培养温度条件下培养，见图7.结果表明，在15-30 ℃范围内，酶活性随着温度的升高而不断增大，当温度升至30 ℃时，菌株CY10达到最大的产酶能力，CMC酶活性和滤纸酶活性分别达到17.88 U/mL和19.35 U/mL，当温度升高到35 ℃以后酶活开始快速下降，这可能是由于随着温度的上升，酶结空间构受到影响，导致酶活降低.微生物都在一定的温度范围之间生长和繁殖会较快，在最适培养温度下，生长繁殖最快.因此，选择30 ℃作为产酶的最适温度.2.2.6 接种量按照方法1.3.6分别接种不同的菌量，经发酵培养后测其酶活，结果见图8.当接种量在0.2%-1.0%(0.1-0.5 mL/50mL)范围内，随着接种量增加，菌株产酶活性上升较快；在接种量为1.0%-8.0 %范围内，随着接种量增加，酶活性增加缓慢，当接种量为8.0 %时，CMC酶活性和滤纸酶活性最大，分别为20.28 U/mL和21.13 U/mL；当接种量高于8.0 %时，酶活呈下降趋势.因此，选择8.0 %作为产酶的最适接种量.2.2.7 装液量按照方法1.3.7分别在摇瓶内设置不同装液量，发酵培养后，见图9.结果表明，随着装液量增加其酶活逐渐升高，当装液量达到为50 mL/250 mL时，菌株CY10 CMC酶活性和滤纸酶活性达到最大值分别为18.39 U/mL和19.89 U/mL；当装液量高于50 mL时，其产酶活性逐渐降低，装液量增加到一定程度不利于CY10对酶的合成和分泌，其生长和代谢活动不能获得充足的氧气供应，因此酶活性降低.因此，选择50 mL/250 mL作为产酶最适装液量.2.3 酶学性质研究2.3.1 温度按照方法1.4.1，考察温度对酶反应的影响，见图10所示.该菌株CY10在30-45 ℃期间，随着温度的升高酶活性逐渐升高，在45 ℃生产的CMC酶和滤纸酶最适反应达到最大分别为19.56 U/mL和21.35 U/mL；当温度高于45 ℃，随着温度的升高，滤纸酶活性和CMC酶活性都急剧下降；到温度为70 ℃时，CMC酶活性和滤纸酶活性都为都降到最低为5.82 U/mL和6.86 U/mL.因此，CMC酶活性和滤纸酶反应最适温度为45 ℃.2.3.2 最适pH按照方法1.4.2，考察pH对酶反应的影响，见图11所示.随着反应液pH 的升高，该菌滤纸酶和CMC酶的逐渐升高，当pH为6.5时，滤纸酶活性和CMC酶活性最高分别为20.96 U/mL和22.58 U/mL；反应液pH继续升高后，滤纸酶活性和CMC酶活性明显下降.因此，该菌株CMC酶和滤纸酶反应的最适pH为6.5.采用微生物降解纤维素是纤维素再生资源利用的较好方式，本研究从腐朽木材或枝条中分离到1株活性较高纤维素降解菌，并对其培养条件和酶学性质进行了研究.研究结果表明，该菌株最适培养条件为：碳源麦麸(2.0 %)，氮源酵母粉(0.5 %)，培养温度30 ℃，培养pH6.5，培养时间42 h，接种量8.0 %，装液量50mL/250 mL；该菌株CY10所产滤纸酶和CMC酶，酶活性最适温度为45 ℃，最适pH为6.5.【相关文献】[1] Adsul MG,Bastawde KB,Varma AJ,et al.Strain improvement of Penicillium janthinellum NCIM 1171 for increased cellulase production[J].Bioresource Technology,2007,98(7):1467-1473.[2] 郝月,杨翔华,张晶,等.秸秆纤维素分解菌的分离筛选[J].中国农学通报,2005,21(7):58-60.[3] 钟国祥,姚健,张诚,等.纤维素降解菌的筛选及其酶学性质研究[J].江西农业学报,2015,27(6):85-89.[4] 徐昶，龙敏南，乌小兵，等.高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究[J].厦门大学学报:自然科学版,2005,44 (1):107-111.[5] 宋颖琦,刘睿倩,杨谦,等.纤维素降解菌的筛选及其降解特性的研究[J].哈尔滨工业大学学报,2002,34(2):197-200.[6] 郭建华,奚家勤,宋纪真,等.纤维素降解菌哈茨木霉TC10-13产酶条件优化[J].南方农业学报,2015,16(1):79-84.[7] 陈兴,王文元,汪显国,等.烟叶纤维素降解菌的筛选、鉴定及其产酶条件优化[J].云南大学学报(自然科学版),2015,37(2):323-328.[8] 刘韫滔,淑霞,龙传南,等.纤维素降解菌L-06的筛选、鉴定及其产酶条件的分析[J].生物工程学报,2008,24(6):1112-1116.[9] Yan-Ling Liang,Zheng Zhang,Min Wu,et al.Isolation,Screening,and 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纤维素降解菌的分离与鉴定
培养基的配置和分装
纤维素琼脂培养基： • (NH4)2SO4 2 g , • MgSO4· 7g， • H2O 1g, • NaCl 1g, • CaCO3 2g, • 水 500mL ,
• 121 ℃ 灭菌20 min，倒平板后,盖上不平板大小一致的无菌滤纸
（注意：滤纸要用秲醋酸浸泡一夜 ，用碘液检查是否有淀粉 ，若已去除完全 ， 则用 2％苏打水冲洗至中性，干热灭菌 后备用 ）。
环境中纤维素降解菌的筛选和初步鉴定
生物技术班
实验目的 实验原理 实验器材 实验步骤 实验结果与分析
实验目的 • 从环境中筛选出能降解纤维素的菌株 • 初步鉴定出菌株所属的类型
试验原理
• 纤维素酶酶系组成及降解机理 纤维素酶酶系包括内切葡聚糖酶(Cx酶）、外切 葡聚糖酶(Cl酶)，[来自真菌简称CBH，来自细菌简 称Cex)]和B．葡聚糖苷酶l，也称纤维二糖酶，简 称BG)。滤纸酶(FPase)活力代表了三种酶协同作用 后的总酶活力。 纤维素是有许多葡萄糖分子通过β-1，4一糖苷 键连接起来的大分子物质，对其的水解需要上述 三种酶的共同作用。酶的种类完整性、各种酶之 间的比例兲系等都会影响到纤维素酶的整体活力 。
分离
（1）无菌条件下，取富集后的培养液将土壤悬液秲释成101~10-7系列浓度。
（2）分别用秱液器精确地吸取各秲释菌液0.2 ~0.3 mL，对号 先后涂布于编好号刚果红培养基平板,（涂布时涂布棒要从 浓度小的梯度开始，将加入平板培养基上的土壤秲释液在 整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌）。置于 30 ℃ 培养箱中，倒置培ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ一周。
初筛
以下各步骤均在无菌条件下进行。 （1）称取土壤样品10 g，倒入含有90 mL水和玱璃珠的三角 瓶中振荡5 min，使土样充分打散。（注意：等水冷却了 再倒入土样。） （2）取 5 mL悬液加入盛有 50 mL富集培养基 (纤维素琼脂培 养基 )的三角瓶,在 28 ℃和 150 r/min下, 振荡培养 3~ 5 d后 秱取 5mL培养液至另一盛有新鲜富集培养基的三角瓶中继 续培养。
纤维素降解菌株的筛选
分解纤维素的微生物的分离栾旭东，张兴敏，周雪霞，闫超，何溢涛（山东大学生命科学学院2005级生科基地班，济南250100）摘要：纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，它能被土壤中某些微生物分解利用，是因为它们能够产生纤维素酶。
本实验通过从土壤中分离分解纤维素的微生物，初步鉴定了其形态特征和生理生化特性，为日后更进一步的研究打下基础。
关键词：纤维素土壤微生物纯培养刚果红染色法Abstract: cellulose is the most abundant polysaccharide on the earth, which can be digested by some microorganisms in the earth because they produce cellulase. In our experiment, we isolated these microorganisms from the earth and checked up the cells’ and colonies’ morphology and the bioreactions they can act.Key words:cellulose, microorganisms in the earth, pure culture, Congo red staining资源和环境问题是人类在21世纪面临最主要的挑战。
生物质资源是可再生资源，地球上每年光合作用的产物高达 1.5×1011—2.0×1011，是人类社会赖以生存的基本物质资源，其中90%以上为木质纤维素类物质[1]。
目前这部分资源尚未得到充分的开发利用。
随着世界人口迅速增长，矿产资源日渐枯竭，开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，即化工原料的“绿色化”，具有极其重要的意义和光明的发展前景。
纤维素降解菌研究进展
ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｇｒｅｓｓｏｆＣｅｌｌｕｌｏｓｅＤｅｇｒａｄｉｎｇＢａｃｔｅｒｉａ
ＴｏｎｇＳｈｕｏｑｉｕ，ＷａｎｇＱｉａｎｇ，ＬｉｎＺｈｏｎｇｍｅｉ，ＴａｏＹｉ，ＷｕＹｏｎｇｊｕｎ
（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＧｕｉｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，Ｃｈｉｎａ）
根据作用方 式 的 不 同，纤 维 素 酶 主 要 有 内 切 葡 萄 糖 苷 酶 （Ｃ１酶）、外切葡萄糖苷酶（Ｃｘ酶）与 β－葡糖苷酶 ３类。Ｃ１酶 首先作用于纤维素链的结晶结构，融解纤维素衍生物或者膨胀 部分降解的纤维素，Ｃｘ酶继续分解 β－１，４－糖苷键，每次酶切 下一个纤维二糖单位，β－葡糖苷酶最终将纤维二糖、纤维三糖 及其他 低 分 子 纤 维 糊 精 分 解 为 葡 萄 糖，但 该 酶 的 专 一 性 较差［６］。
（下转第 ９１页）
收稿日期：２０１９－１１－１３ 基金项目：贵州大学实验室开放项目（ＳＹＳＫＦ２０１９－０６８） 作者简介：佟硕秋（１９９１—），硕士，助理实验师，从事微生物工业应用研究；通讯作者：吴拥军（１９７１—），博士，教授，长期从事食 品微生物菌株安全改良及应用。
相较真菌不耐碱 的 缺 陷，研 究 人 员 发 现 在 低 氧 条 件、中 性 条件及碱性条件下，部分乳酸杆菌与芽孢杆菌等能正常分泌高 活性纤维素酶 ［８］。 何 颂 捷 ［９］等 从 白 酒 酒 糟 中 分 离 出 的 贝 莱 斯 芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌，其分泌的高活性纤维素酶具有较 高降解酒糟纤维 素 的 能 力。 目 前，已 发 现 多 种 厌 氧 细 菌、耐 碱 细菌能产生纤维素酶，这两者在生物降解时纤维素酶系统的降 解机制与好氧真菌存在差异。在不同温度、含氧量及 ｐＨ等情
１ 纤维素的结构及性质
纤维素降解菌系的筛选及降解稻草条件研究
纤维素降解菌系的筛选及降解稻草条件研究摘要:以已分离的11株纤维素降解菌为材料,采用滤纸崩解法和透明圈法,初步筛选出4株纤维素降解能力较强的菌株｡将这4株单菌进行两两组合,研究混合菌系在9d内的CMC酶活和FPA酶活与单菌发酵之间的异同｡结果表明,混合菌发酵CMC酶活和FPA酶活均优于单一菌株;同时筛选出一组具有高降解能力的混合菌体系;并对该混合菌系降解稻草的最适反应温度､最适初始pH值､产生还原糖的时间进行了研究,结果表明,在30℃､pH值4.5､发酵96 h时混合菌降解稻草的效果最好｡关键词:纤维素降解菌;筛选;CMC酶活;FPA酶活;还原糖含量;降解条件Screening of Cellulose Degrading Microorganism and the Degrading Condition of Rice StrawAbstract: Four strains with strong degradation ability to cellulose materials were screened out of 11 bacteria using filter paper degradation method and clear halo method. Then a mixed germ with higher degradation ability was obtained as the CMC and FPA enzyme activity of mixed bacteria and pure bacterium was compared. The optimum degrading condition of the mixed germ to rice straw was 30℃, pH 4.5, and fermentation for 96 h.Key words: cellulose degrading microorganism; screening; CMC enzyme activity; FPA enzyme activity; degrading condition纤维素是地球上最廉价､最丰富的可再生资源｡全世界每年纤维素及半纤维素的生成量为850亿t｡利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素是纤维素利用的有效途径｡纤维素的生物降解对开辟新能源和防止其污染环境有重要意义,一直是生物技术领域的研究重点[1,2]｡在长期生产实践中发现该生物过程是微生物单独作用不能完成或只能微弱进行的,必须依靠两种或两种以上的微生物共同作用才能完成,微生物混合培养或混合发酵已越来越受重视[3]｡而且国内对产纤维素酶能力较强的单一菌种研究较多,菌种混合发酵的研究较少[4,5]｡本试验在纤维素降解单一菌株研究的基础上,着力于筛选降解纤维素的混合菌系,旨在为纤维素的高效转化提供依据｡1材料与方法1.1菌种纤维素降解菌分别来自枯树根､烂菜叶､牛粪和牛胃中｡1.2培养基制备PDA培养基:马铃薯200 g,蔗糖20 g,琼脂粉20 g,水1 000 mL,pH值6.5｡滤纸条鉴定培养基:(NH4)2SO4 0.10%, KH2PO4 0.10%, MgSO4·7H2O 0.05%,K2HPO4 0.20%,酵母膏0.01%,滤纸条(规格为1 cm×7 cm)1块,pH值6.5｡纤维素刚果红培养基:(NH4)2SO4 0.20%,MgSO4·7H2O 0.05%,KH2PO4 0.10%,NaCl 0.05%,CMC-Na 2.00%,刚果红0.02%,琼脂2.00%,pH值6.5｡液体发酵培养基:KH2PO4 1.00 g, NaCl 0.10 g, MgSO4·7H2O 0.30 g, NaNO3 2.50 g, FeCl3 0.01 g,CaCl2 0.10 g,秸秆木质纤维素20.00 g,pH值7.20~7.40｡1.3菌种初筛透明圈直径(H)与菌落直径(D)比值的测定:将11株保藏菌种(菌种名称分别为N1､N2､N3､N4､N5､N6､N7､N8､N9､N10､N11)活化后分别接种到PDA培养基上,30℃培养3d｡将每一株菌分别转接到纤维素刚果红培养基上,30℃培养4 d后,加入适量1 mol/L的NaCl溶液,浸泡1 h,根据H与D比值的大小进行初筛｡单菌株滤纸失重率的测定:将透明圈大的菌种接种于滤纸条鉴定培养液中,以不接种处理作对照,28℃摇床培养8 d,分别在2､4､6､8 d时测其失重率｡滤纸失重率的测定:用滤纸过滤发酵液,将残留物80℃烘干称重,用减重法计算出滤纸失重率｡失重率=(培养前底物干重-培养后底物干重)×100%/培养前底物干重｡将单菌株滤纸失重率较大且H/D值大于2.0的菌株作为复筛菌种｡1.4复筛将初筛所得单菌种进行两两组合,对单菌种和不同组合菌种测定羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活｡以体积比为1∶1的接种比例､10%的接种量分别接入固态培养基中｡1.4.1羧甲基纤维素酶活测定①酶液的制备:将发酵液于4 000 r/min,4℃,离心20 min,取上清液,备用｡②纤维素酶活力的测定方法(DNS法):取A､B､C共3支50 mL 比色管,在A､B管中分别加入1.5､0.5 mL的1% CMC-Na溶液(用pH值4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液配制)适当稀释的酶液, C管中加入1.5 mL的pH值为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液和0.5 mL酶液,50℃下保温30 min,然后在3支比色管中分别加入2.5 mL的DNS试剂,沸水浴5 min后放入水中冷却,终止反应,定容至25 mL,摇匀,在波长520 nm处测定吸光值(C管作空白对照),并从葡萄糖标准曲线上查出相应的葡萄糖含量,再折算成酶活力单位｡CMC酶活力定义为:在pH值4.8,50℃条件下,1 mL酶液每分钟水解羧甲基纤维素钠生成1 μg葡萄糖的酶量,称为一个酶活力单位,以U/mL表示｡1.4.2滤纸酶活(FPA)测定取A､B､C共3支具塞比色管,在A､B管中加入pH值4.8醋酸-醋酸钠缓冲液1.5 mL和1 cm×6 cm规格的新华滤纸条(约50 mg),50℃下预热10 min后,加入0.5 mL适当稀释的酶液,C管不加底物作空白对照,50℃下保温60 min,然后在3支比色管中分别加入2.5 mL DNS试剂,沸水浴5 min后立即在水中冷却,终止反应,定容至25 mL,摇匀,在波长520 nm处测定吸光值(C管作空白对照),根据葡萄糖标准曲线计算酶活力｡酶活力定义为:在pH值4.8,50℃条件下, 1 mL酶液每分钟水解滤纸条生成1μg葡萄糖的酶量,称为一个酶活力单位,以U/mL 表示｡1.5菌种降解稻草条件研究还原糖含量测定按照DNS比色法[6]进行｡2结果与分析2.1初筛结果由经过活化的11株菌株在刚果红培养基上的生长情况(表1)可知,菌株N1､N2､N3､N7､N8和N9的滤纸失重率相对较高;从透明圈与菌落圈直径之比来看,菌株N1､N3､N7､N8的H/D都超过2.0｡因此,选取N1､N3､N7､N8号菌株作为复筛对象｡2.2复筛结果发酵过程中菌系CMC酶活的变化情况见表2｡由表2可知,接种后1~2 d内酶活逐渐上升,大部分菌株在3~4 d时酶活出现最高峰值,5~6 d酶活开始下降,7~9 d酶活又缓慢上升｡两种菌株混合培养在一定程度上会提高CMC酶活,组合菌株N7+N8培养4 d时的CMC酶活为195.7U/mL,相当于其菌株单独培养平均酶活的2.36倍｡表3表示的是滤纸酶活在发酵过程中的变化情况,总体的变化趋势是在1~4 d 内先上升,5~7 d上升到峰值,之后再下降｡两种菌混合培养时FPA酶活也有一定程度的提高,组合菌株N7+N8在发酵6d时的FPA酶活为30.5 U/mL,相当于其菌株单独培养平均酶活的1.7倍｡因此,选取组合N7+N8作为最优纤维素降解混合菌系｡2.3组合菌株N7+N8降解稻草的最适温度分别研究了温度在20､30､40､50､60℃时混合菌降解稻草后的CMC酶活､FPA 酶活､产还原糖量(表4)｡由表4可知,CMC酶活､FPA酶活､还原糖含量三者之间存在较明显的正相关性,三者均在温度为30℃时达到最大值｡因此选择30℃作为混合菌降解稻草的最适温度｡2.4组合菌株N7+N8降解稻草的最适pH值分别研究了初始pH值为4.0､4.5､5.0､5.5和6.0时混合菌降解稻草后的CMC酶活､FPA酶活､还原糖量｡由表5可知,初始pH值为4.5时,CMC酶活､FPA酶活､还原糖含量三者均达到最大值｡因此选择4.5为混合菌降解稻草的最适初始pH值｡2.5组合菌株N7+N8降解稻草的最适培养时间在混合菌降解稻草的最优发酵条件下,每隔12 h测定1次其生长状况及产糖情况,研究培养时间对混合菌生长及产还原糖的影响,结果见图1｡由图1可知,混合菌系在培养72 h之前,还原糖产量较低,在培养72~96 h过程中,混合菌系迅速产生还原糖,在96 h时还原糖产生量最高,达1.8 g/L｡3讨论本研究筛选出了一组具有较高纤维素降解活力的混合菌系,该混合菌系的CMC 酶活和滤纸酶活均高于单一菌株;同时研究了该混合菌系降解稻草的最适反应温度､最适初始pH值及培养时间对还原糖量的影响｡本研究虽对上述试验条件进行了探讨,但以下问题有待进一步研究:①所得混合菌系纤维素降解酶活力距离生产要求还有很大的差距,应采用诱变等方法对该菌系进行处理,以提高现有菌系的产酶活力;②在利用单因素法研究温度､pH值､培养时间对产酶的影响的基础上,需进一步研究多因素对发酵产酶的影响,以使理论研究更加贴近实际生产｡参考文献:[1] MANDELS M, STERNBERG D. Recent advances in cellulose technology[J]. J Ferment Technol,1976,54(4):267-286.[2] HARUTA S,CUI Z,HUANG Z,et al. Construction of a stable microbial community with high cellulose-degra-dation ability[J]. Applied Microbiology Biotechnology,2002,59(4-5):529-534.[3] 冯树,周樱桥,张忠泽. 微生物混合培养及其应用[J] .微生物学通报,2001,28(3):92-95.[4] 史玉英,沈其荣,娄无忌,等. 纤维素分解菌的分离和筛选[J]. 南京农业大学学报,1996,19(3):59-62.[5] 洪洞,黄秀莉. 纤维素酶的应用[J].生物学通报,1997,32(12):18-19.[6] 王玉万,徐文玉. 木质纤维素固体基质发酵物中半纤维素､纤维素和木质素的定量分析程序[J].微生物学通报,1987,14(2):81-84.。
近年纤维素降解菌株筛选研究进展
第29卷第2期2021年6月纤维素科学与技术Journal of Cellulose Science and TechnologyV ol. 29 No. 2Jun. 2021文章编号：1004-8405(2021)02-0068-10 DOI: 10.16561/ki.xws.2021.02.07近年纤维素降解菌株筛选研究进展宫秀杰，钱春荣，于洋，郝玉波，李梁，姜宇博，吕国一（黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所，黑龙江哈尔滨150086）摘要：简述了近年来纤维素降解菌株筛选的研究进展，目前筛选到纤维素降解菌的真菌主要有木霉属Trichoderma、青霉属Penicillium和曲霉属Aspergillus，细菌主要是芽孢杆菌属Bacillus、放线菌主要是链霉菌属Streptomyces。
重点介绍了筛选到的纤维素降解菌的菌株名称、菌株种属鉴定、菌株筛选来源、菌株酶活测定条件和纤维素降解效果等。
同时，对近年来已报道筛选的纤维素降解菌株的产酶活特性及降解效果进行比较。
期望对高效纤维素降解菌株筛选提供借鉴。
关键词：纤维素降解；菌株筛选；研究进展中图分类号：Q939.9 文献标识码：A纤维素是世界上最丰富的可再生资源、可被持续利用的绿色有机质资源，在高等植物、细菌、动物和海藻等生物中广泛存在，每年总量有几百亿吨，具有巨大的经济开发价值，就我国玉米秸秆纤维素而言，每年资源高达1.32亿t（纤维素按32%计算）[1]。
然而，（1）纤维素由D-吡喃葡萄糖环彼此以β-1,4-糖苷键以C1椅式构象联结而成的线形高分子化合物；（2）纤维素由结晶相和非结晶相交错组成，其中结晶相纤维素中大量的羟基基团，产生数目庞大的氢键，这些氢键构成巨大的氢键网格，直接导致了致密的晶体结构的形成[2]；（3）纤维素聚合度非常大，约2 000到15 000以上，当大量游离羟基形成氢键时，氢键力非常大，它们使纤维素片之间的距离保持在很小的范围。
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研究结果
纤维素分解菌的分离筛选与纯化
按照“培养 分离单菌落 纯化 初筛 复筛”的 方法，在大兴安岭地区的土壤、腐木及玉米秸秆的 降解物中分离到3 种可对纤维素进行有效降解的菌 株. 经初步鉴定，该3 种菌株分属于木霉属 （Trichoderma. sp）、曲霉属（Aspergillus. sp）、 青霉属（Penicillium. sp）
谢谢
青霉的玉米秸秆则为原来体积的45%左右，说 明加入混合菌株可以加速玉米秸秆的分解速度.
结论与讨论
（1）所筛选的3 种菌株均能较大程度的降 解纤维素，说明这些菌株具有产生纤维 素酶的特性，或者具有合成这类胞外酶 的基因；如将这类野生型菌株进一步遗 传改造，将会更大程度的加速纤维素的 降解，为秸秆等农业废弃物的有效开发 利用提供优势微生物菌种资源.
（2）自然状态下，纤维素的彻底降解是在微 生物体系中多种微生物长时间相互作用的结果， 这一过程仅靠一种微生物是无法实现的. 这是 由于分解纤维素的酶是由多种组分组成的酶体 系.因此，在进行纤维素大分子降解的研究过 程中要考虑到微生物的产酶体系之间的协同效 应. 本实验的结果表明木霉与青霉的混合培养 具有最大的协同效应，木霉同曲霉二者混合， 木霉同曲霉、青霉三者混合的培养效果与木霉 单独培养无明显差异，但比曲霉及青霉的单独 培养效果显著，这也许是因为曲霉的降解产物 可以抑制木霉的产酶效果，或与混合接种的时 间、接种量有一定的关系。
纤维素分解菌的单独或混合培 养对纤维素酶活力的影响
纤维素分解菌单独或混合培养 对秸秆降解的影响
表4 表明所选菌株均可以不同程度地降解玉米秸秆 中的纤维素，但木霉与青霉的混合培养表现出明显 的协同效应，可以提高纤维素的降解量.玉米秸秆中 的纤维素被部分降解后其颜色由黄色转为棕黑色和 黑色，并产生较强的粘滑感，其中颜色和粘滑感是 有机质含量和降解后产糖的一个直观标准，而且加 入木霉与青霉混合菌培养的玉米秸秆在经过30 d 发 酵后已降解至原来体积的32%，而单独加入曲霉和
材 料：大兴安岭地区土壤及腐木、玉米秸秆的降解
物，上海化学试剂公司生产的粘度为800 ~ 1 200的羧 甲基纤维素钠（CMC - Na），玉米秸秆粉碎成锯末状. 培 养 基：初筛培养基：PDA 培养基（ 马铃薯200 g， 蔗糖20 g，琼脂15 ~ 18 g，水1 000 mL、pH 值自 然）.复筛培养基：（CMC - Na ），（NH4）2SO4 4 g， KH2PO4 2 g，MgSO4· 7H2O 0. 5 g，蛋白胨1 g，琼脂 16 g，蒸馏水1000 mL.发酵产酶培养基：CMC -Na 10 g，（NH4）2SO4 4 g，KH2PO4 2 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，蛋白胨10 g，麦芽汁10mL，水1 000 mL.
研究方法
纤维素分解菌的分离与纯化 纤维素分解菌的单独与混合发酵培养 纤维素分解菌的单独或混合培养对玉米 秸秆降解的影响
纤维素分解菌的分离与纯化
将采集样品按照常规的稀释分离法分离真菌并纯化， 接种于以玉米秸秆粉为主要基质的固体培养基中， 在30~ 35 ℃条件下培养15 d，观察菌的生长状况 及培养基的变色程度，选取菌株生长快、培养基 变色程度大的菌株作为纤维素分解菌，将该菌株 接种于以羧甲基纤维素钠（CMC - Na）为唯一碳 源的固体培养基上进行复筛，根据菌丝的生长速 度CMC - Na 的液化程度，选出纤维素降解菌的优 良 菌株.
纤维素降解菌的筛选及其降解 特性的研究
宋颖琦,刘睿倩,杨谦等. 哈尔滨工业大学学 报,2002,34(2):197-200.DOI:10.3321/j.issn:03676234.2002.02.01.
报告人： 学号；
前言
全世界每年大约形成1000~ 2000 亿t 植物有机物质， 其中有一半是纤维素物质. 我国每年仅农业生产中形成的农 作物残渣（稻草、秸秆等）就约有7 亿t，工业生产中还有数 百万吨的纤维素废弃物. 这些废弃物即没有得到充分的利用， 又污染环境，因此合理开发和科学利用这一丰厚的天然资源 是各国政府及科学家一直致力于且投入大量资金及人力进行 研究开发的重点领域. 目前对农作物秸秆的利用还未达到令 人满意的水平，其主要原因是缺乏对农作物秸秆这种天然纤 维素完全降解的高活性菌株. 本文通过在自然环境和秸秆降 解物中大量采集和筛选后得出3 种优良菌株，并对其产酶特 性进行初步研究，发现木霉与青霉菌株混合培养后具有纤维 素酶的高产协同
纤维素分解菌的单独与混合发 酵培养
取250 mL的锥形瓶，装入100 mL 的培养 基，并以体积比为15% 的接种量接种， 使其活菌数达到1 X10^9个/ mL，于 30℃ 、200 r / min 的摇床震荡培养，每 隔24 h 测量CMC玉米秸秆降解的影响