茚三酮比色法测定赖氨酸含量

茚三酮显色法测定氨基酸含量

❖（2）pH5.4,2M醋酸缓冲液：量取2M 86ml 醋酸钠溶液，加入14ml 2M乙酸混合而成。用pH计较正（250ml/班）
❖（3）茚三酮显色液：称取85mg茚三酮和 15mg还原茚三酮，用10ml乙二醇甲醚溶解（15ml/组）
❖ 还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g茚三酮，用12.5ml沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将 0.5g维生素C用25ml温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3次，真空干燥，置五氧化二磷真空干燥器中保存备用
• 样品同时做三份取平均数
四、结果与计算
• 氨基酸的含量(g/100ml)=X*100
——X为查标准曲线所获得每ml含量g数
• 自配样品
——X*250/称取克数（X为查标准曲线所获得每ml含量g数）
——250为稀释的倍数
• 五、讨论与分析
• 六、思考题
茚三酮是否可用于氨基酸和蛋白质的定性鉴定？
实验三茚三酮显色法测定氨基酸含量
一、实验原理
• 茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量
二、试剂与材料
❖（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3mM溶液（本实验用赖氨酸）(已配)
•（4）60%乙醇（50ml/组） •（5）样品液：每ml含0.5-50ug氨基酸（已配） •（6）分光光度计 •（7）水浴锅
三、操作方法
1、标准曲线的制作
• 分别取0， 0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1.0ml0.3mM的标准氨基酸溶液于试管中，用水补足到1ml。各加入1ml2M醋酸缓冲液；再加入1ml茚三酮显色液，充分混合后盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min后，加入3ml60%乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440）。以OD570 为纵坐标，氨酸酸样品的测定：

氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)

茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。

称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。

取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。

储成于棕色瓶中，避光保存。

0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。

茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。

亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。

茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。

氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)

茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。

称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。

取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。

储成于棕色瓶中，避光保存。

0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。

茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。

亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。

茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。

赖氨酸分析方法(比色法)

比色分析赖氨酸一、茚三酮显色液的制备1、分析纯茚三酮10g，分析纯二水氯化铜13.4g，柠檬酸盐缓冲液125ml，分析纯乙二醇甲醚375ml混合溶解后定容到1L，储存于冰箱。

2、柠檬酸盐缓冲液的制备柠檬酸10.6g和固体NaOH4.2g溶解于200ml蒸馏水并混合均匀，用盐酸调PH至1.3后，加蒸馏水定容250ml，放入冰箱。

二、标准赖氨酸溶液的制备1、取赖氨酸盐酸液标准品于105℃烘干3小时；2、制备标准溶液（1g/dl）取1g/dl-----2ml加入98ml水=20mg/dl3ml加入97ml水=30mg/dl4ml加入96ml水=40mg/dl5ml加入95ml水=50mg/dl存于冰箱里，使用期限不得超过一个月。

赖氨酸标准曲线：用标准赖氨酸溶液20、30、40、50mg/dl依次测定并绘制标准曲线，赖氨酸=（OD+0.138 ）×稀释倍数÷10000.218范围=20～50mg/dl（OD=0.298～0.952）三、样品溶液的制备1、样品溶液赖氨酸的浓度必须稀释到2020～50mg/dl之间；2、取1、制备的样品于离心机离心5分钟（转速大于2500）；3、取离心分离后的上清液进行分析；4、标准曲线和样品的测定步骤取0、20、30、40、50mg/ml溶液各1ml并且分别加入1.0ml茚三酮显色液于沸水中加热15分钟，冰水冷却10分钟后加8.0ml的纯水再用分光光度计于475nm处测定；取酸样品溶液的上清液1.0ml并且加入1.0ml茚三酮显色液于沸水中加热15分钟，冰水冷却10分钟后加8ml的纯水再用分光光度计于475nm处测定；然后把上面的数据记录下来。

5、根据数据得到不同的斜率值，如：LYS酸度=33.590×OD+7.3四、OD值的测定开722分光光度计，调整波长562nm预热20min；空白：调节到“T”档，在“开合”状态下分别显示0和100，反复数次，直到稳定为止；样品：调节档“A”，放入样品（0.2ml样品+5ml水），调节波长到1和0.001为准，然后测定。

茚三酮显色法测定赖氨酸含量

味精的第二大氨基酸品种。
■ L-赖氨酸的化学名称为L-2,6-二氨基己酸或α，ε-二氨基己酸，属于单斜晶系，熔点为263℃，比旋光度是 +21°，难溶于醇和醚，易溶于水，等电点为9.59。游离的 L-赖氨酸具有很强的呈盐性，极易吸收空气的CO2生成碳酸盐，故一般商品是以L-赖氨酸盐酸盐的形式存在。L-赖氨酸盐酸盐的化学组成为C6H15O2N2Cl或C6H14O2N2·HCl，其相对分子量为182.64，化学性质稳定，为无色晶体，几乎无味，易溶于水，难溶于醇和醚，在25℃的水中溶解度为 793g/L。
一、茚三酮显色法测定赖氨酸含量
பைடு நூலகம்3.操作步骤
（1）绘制标准曲线准确吸取已配好的标准浓度系列的亮氨酸溶液各0.5mL,
分别放入5支试管中，每种浓度做3个重复。再取一支试管加入0.5mL蒸馏水做空白对照。向每支试管中各加入0.5mL的4 ％碳酸钠溶液和2mL茚三酮试剂（头一天配好的），混匀，在80℃恒温水浴上保温30min。取出后，立即放入冷水浴中冷却3min，然后向每管内加入5mL的95％乙醇，摇匀，在分光光度计上500nm波长处进行比色，以空白做对照，读取吸光度。以吸光度值为纵坐标，亮氨酸浓度为横坐标，绘出标准曲线，并求出曲线的斜率。
10mL8％的甲酸，最后加水到100mL ■ 茚三酮试剂：称取1lg茚三酮和1g氯化镉(CdCl2)，加入25mL
上述缓冲溶液和75mL乙二醇，室温下放置一天，第二天使用。若出现沉淀，则过滤后使用。注意该溶液不能现用现配，一定要配制好后第二天使用，也不宜放置过久 ■ 4％和2％无水碳酸钠溶液：各50mL ■ 标准亮氨酸溶液：准确称取25mg亮氨酸，加数滴稀盐酸，待溶解后定容至50mL，该溶液亮氨酸浓度为500μg／mL。准确吸取上述母液1、3、5、7、9mL，分别稀释至25mL，待用 ■ 722型分光光度计、水浴锅

氨基酸含量的测定（茚三酮比色法）

氨基酸含量的测定（茚三酮比色法）原理凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。

氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。

第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。

仪器药品721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥研钵容量瓶移液管烧杯试管架试管0.2mol/L柠檬酸缓冲液，pH5.0（见附表2）80%乙醇10mmol/L KCN：称取0.1638gKCN溶于蒸馏水中，稀释至250ml备用（注意：KCN剧毒！）KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液*：称取1.25g重结晶茚三酮溶于25ml 经重蒸馏的乙二醇甲醚中使成5%溶液。

将2.5ml10mmol/L KCN溶液用乙二醇甲醚溶液稀释至125ml充分混合。

然后将125mlKCN—乙二醇甲醚溶与25ml茚三酮－乙二醇甲醚溶液相混合，置试剂瓶待用，正常情况下应为浅黄色。

标准氨基酸溶液：称取亮氨酸20mg溶于10ml蒸馏水中，则得浓度为200μg/ml的母液。

上述所有试剂必须放在草酸保护的干燥器中，以免被空气中的NH3所污染。

乙二醇甲醚(CH3OCH2CH2OH, methyl cellusolve)的处理：将5g硫酸亚铁加在500g乙二醇甲醚中，振摇1─2小时。

过滤除去硫酸亚铁（若滤液混浊没有关系），再在蒸馏瓶中蒸馏，收集沸点121─125℃部分，此时应为透明无色液体。

KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液配制后必须隔夜才能应用。

配制后1星期内稳定，若超过1星期则灵敏度降低，不宜作定量。

茚三酮重结晶：即使AR级的茚三酮，由于保管不当，常带微红色，配成溶液后也带红色，影响比色测定，故需重结晶一次方可应用。

5g茚三酮溶于15ml热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻摇动，若溶液太稠不易操作，可酌量加水5─10ml，30分钟后用滤纸过滤，滤液放冰箱中过液，次晨即见微黄色结晶出现，过滤，再以1ml冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色试剂瓶中保存。

L-赖氨酸硫酸盐中氨基酸检测方法的研究

ｅｔｂｉｍｅｔｏ．ｓｎｕｆｔｐｏｕｔｎｕｔｙａｄｎｆｎ１ｓｎａｄｓｌｈｎｆ１ｉｅｓｌｅｒｄｃｄｓｎａｏａｔｄｒ．ａｓＬｙａｉｒｉａＫｅｒｓ－ｓｎｕｆｔ；ｉｈｄｉｏｏｉｔｃｍｅｈｄ；ｍｉｏａｉｎｌｚｒｙｗｏｄ：Ｌｌｉｅｓｌｅｎｎｙｒｃｌｒｙａｎｍｅｒｔｏａｎｃｄａａｙｅｉ
l赖氨酸盐酸盐与l赖氨酸硫酸盐从名称上看差别不大但实际上产品质量特点存在很大差异即使是不同厂家生产的赖氨酸硫酸盐产品标准也存在一定的差异相对于盐酸盐产品而言l赖氨酸硫酸盐为新的产品随着l赖氨酸硫酸盐产品用量的不断增加由于有些饲料企业对这些产品标准了解不够深入细致出现含量不足等质量问题导致其与供应商间产生许多质量争议或纠纷
ｔｉｒｉｌ．ｈｓａｔｅＴｗｏｄｔｃｉｎｍｅｈｄｒｏａｅｎｎｌｚｄｔｒｖｄｅｅｅｃａａｆｒｔｅｅｅｔａｃｅｅｔｏｔｏｓｗｅｅｃｍｐｒｄａｄａａｙｅｏｐｏｉｅｒｆｒｎｅｄｔｈｖｎｕｌｏ
２０１２年１０月
蚌，学院学稚』｝
ＪｕｎｌｏｅｇｕＣｌｇｏｒａｆＢｎｂｏｌｅｅ
Ｏｃ．２０１２ｔ
Ｖｏ．Ｎｏ４１１．．
第１卷第５期
Ｌ一赖氨酸硫酸盐中氨基酸检测方法的研究
和环保的特点。Ｌ赖氨酸盐酸两种检测法，比较分析Ｊ．氨酸硫酸盐含量检测技术的特点，为ＬＬ赖将一赖氨酸硫酸盐的质量标准制定提供参考。

氨基酸含量的测定-茚三酮比色法

各是什么？
实验九氨基酸含量的测定（茚三酮比色法）
1. 实验原理
凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三酮共热时，产生紫色化合物，最大吸收波长在 570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基酸含量成正比，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：
（3）通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎后的样品5g～10g或吸取液体样品5mL～10mL，置于烧杯中，加入50mL蒸馏水和5g左右的活性炭，加热煮沸，过滤。用30mL～40mL热水洗涤活性炭，收集滤液于100mL容量瓶中，加水至刻度线，摇匀备用。
6. 思考题（1）茚三酮法测定氨基酸的原理是什么？（2）试比较三种方法测定氨基酸含量的优缺点
2. 实验材料、仪器与试剂材料：酱油仪器：可见分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度试管。试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。
（3）样品测定
管号
8 9 10 11
样品溶液/mL 0 0.5 0.5 0.5
水/mL
1.6 1.1 1.1 1.1
磷酸盐缓冲液/mL 0.4 0.4 0.4 0.4
茚三酮/mL
0.4 0.4 0.4 0.4
按上表加样后混匀，按标准曲线的步骤进行实验，在相同条件下测定样品的吸光度，并在标准曲线上查（1）该法是微量法，对氨基酸的最低检出量可达0.5μg，其其灵敏度高，重现性好。（2）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，最大吸收波长在440nm处。