2011.3.3原生质体制备和转化
原生质体转化原理
原生质体转化原理
原生质体转化原理
原生质体转化是一种生物技术，旨在将外源DNA引入宿主细胞以获得特定的遗传性状态或表观遗传变化。
原生质体转化原理是一种利用外源DNA（例如体外克隆的DNA和质粒）彻底改变宿主细胞的生理特性。
它为研究者提供了一种简便的方法来改变宿主细胞的遗传特性，同时也能够可靠地测定插入外源DNA的效果。
原生质体转化可以用于实验检测基因的功能，改变宿主细胞的生理特性以及研究各种调控机制的功能。
原生质体转化是一种简易的、可重复的、可控的、有效的技术，可以用来利用外源DNA改变宿主细胞的生理表型，插入和表达外源DNA成为宿主细胞的一部分。
原生质体转化可以被用来驱动各类基因的表达，修改受体的结构，调控蛋白质表达。
原生质体转化是一种可以用来将外源DNA进行插入的非常有效的技术，其优势在于很多具有特定功能的DNA可以被插入宿主细胞，可以较快的检测基因的功能，改变宿主细胞的生理特性以及研究各种调控机制的功能。
原生质体转化依赖于抗生素耐受性，以及抗性转录因子的表达。
这种抗生素耐受机制通过一系列复杂的交互作用使宿主细胞能够耐
受特定的抗生素，该抗生素是质粒DNA的载体，从而达到对特定DNA 序列的特异性。
另外，原生质体转化还可以依赖于转录抑制因子的表达，如亢余的转录抑制因子，以防止宿主细胞的表达被抑制，并保持外源DNA的表达稳定。
总而言之，原生质体转化是一种简便而可靠的技术，可以用来改变宿主细胞的遗传特性，实现对基因功能的检测，以及研究调控机制的功能。
生物药物综合实验----植物原生质体的制备
实验原理
植物原生质体是指包在植物细胞壁内的生活物质， 植物原生质体是指包在植物细胞壁内的生活物质， 可通过混合酶液消化细胞壁而获得。 可通过混合酶液消化细胞壁而获得 。 原生质体经适宜的培 养能合成新壁，并进行细胞分裂， 养能合成新壁 ， 并进行细胞分裂 ， 经特殊诱导可生成完整 植株。 除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是 植株。 除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞” 开展基础研究的理想材料。 开展基础研究的理想材料 。 其中酶解法分离原生质体是一 个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、 个常用的技术 ， 其原理是植物细胞壁主要由纤维素 、 半纤 维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、 维素和果胶质组成 ， 因而使用纤维素酶 、 半纤维素酶和果 胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。 胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
思考题名
1、简述植物原生质体制备的方法步骤； 简述植物原生质体制备的方法步骤； 按镜下观察绘制原生质体。 2、按镜下观察绘制原生质体。
实验结果
注意事项
1、从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作 从理论上讲， 用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中， 用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中，只有 幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以， 幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以，为了制备健康 的原生质体，一般选用根尖、茎尖、 的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期 的愈伤组织为材料， 的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的 外壁，则不能被酶降解。因此， 外壁，则不能被酶降解。因此，取材成为实验成功与否 的首要问题。 的首要问题。 2、在离心过程中一定要注意转速。 在离心过程中一定要注意转速。
实验方法
1.材料称取与质壁分离 材料称取与质壁分离 称取0.5g材料，撕去叶下表皮，先切成大块， 0.5g材料 称取0.5g材料，撕去叶下表皮，先切成大块，蒸馏水 冲洗4 加入12%甘露醇，质壁分离0.5h 12%甘露醇 0.5h， 冲洗4-5次。加入12%甘露醇，质壁分离0.5h，滤去甘露醇 将材料用镊子夹取转入放有滤纸的培养皿中， ，将材料用镊子夹取转入放有滤纸的培养皿中，吸干叶片 表面水分，将材料切成0.5cm2 0.5cm2小块备用 表面水分，将材料切成0.5cm2小块备用
原生质体制备的方法
原生质体制备的方法嘿，朋友们！今天咱就来唠唠原生质体制备的那些事儿。
你想想看啊，原生质体就像是一个小小的神秘世界，等着我们去探索和解锁呢！要制备它呀，就好像是一场精心策划的冒险。
咱先得选好材料，这就好比是要踏上征途得先选好一匹好马呀！不同的材料就像是不同性格的马，各有各的特点和脾气。
选对了，后面的路就好走多啦。
然后呢，就是处理环节啦。
这可得小心翼翼的，就跟雕刻一件艺术品似的，不能太用力也不能太轻了。
得掌握好那个度，不然可就前功尽弃喽！你说要是不小心给弄砸了，那得多懊恼呀！接着就是酶解啦。
这酶就像是一把神奇的钥匙，能打开原生质体这个神秘世界的大门。
可要选对酶哦，不然门打不开，咱不就白忙活啦！在这个过程中，时间和温度都很关键呢，就好像煮汤一样，火候得把握好。
等酶解完了，就得过滤啦。
这就好像是把沙子和金子分开，要把我们想要的原生质体给筛选出来。
这一步也不能马虎呀，得仔仔细细的。
然后呢，就是洗涤啦。
把那些杂质都洗掉，让原生质体干干净净的。
这就像是给宝贝洗澡一样，得温柔点，可别把它弄疼了。
最后呀，就是培养啦。
给原生质体创造一个舒适的环境，让它能好好地生长发育。
这就像是给小树苗找了个好地方种下去，得精心呵护着。
哎呀呀，制备原生质体可不是一件容易的事儿呀，但只要咱一步一步认真去做，就一定能成功！你说是不是？这过程虽然有点麻烦，但当你看到那一个个可爱的原生质体的时候，你就会觉得一切都值得啦！就像你辛苦种的花终于开了一样，那种喜悦呀，真的是没法形容！所以呀，别害怕困难，大胆去尝试吧！让我们一起在原生质体制备的世界里畅游，去发现更多的惊喜和奥秘！。
红曲霉原生质体的制备、再生及其遗传转化系统
收稿日期 ! 修回日期 ! ! & & $ & ’ ! %" ! & & $ & ( ! $ 作者简介 ! 周礼红 ! $ 女$ 贵州人 $ 江南大学在读博士 $ 研究方向 # 真菌分子生物学 &+ # ) * " ’%" , . / 0 0 1 2 1 3 4 # #"5 . 1 3 3 6 7 3 -6 7 8 通讯作者 ! 诸葛 ! 健 &9 # # : 0 % ( , ’ ) & , ’ % % ( ( $ !’ + , . / 0 / . 8 2 1 4 3 = . / 0 6 7 3 : "1 ; <
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原生质体转化法
原生质体转化法原生质体转化法是以原生质体为受体的转基因方法的总称。
该方法包含两个重要的部分：原生质体的分离与再生和外源DNA 转化。
根据外源DNA 转化方法的不同可分为PEG介导转化法、电击法、脂质体介导转化法、显微注射法和农杆菌介导法等原生质体转化法。
原生质体的分离是原生质体转化法的核心步骤。
历史上原生质体的分离经历了以下三个重要阶段：（1）1892年，Klercker采用机械法进行了植物原生质体的分离。
（2）1960 年，Cocking 使用疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁，获得大量有活力的裸细胞（原生质体）。
（3）1968年，Takebe首次使用商品酶（离析酶和纤维素酶）消化掉了烟草叶肉细胞细胞壁，释放出原生质体。
自此，植物原生质体变成了一个热门的研究领域。
原生质体作为转化受体具有以下优点：（1）无细胞壁的原生质体的细胞全能性较普通细胞更好。
（2）原生质体是单细胞系统，没有或较少受周围细胞和微环境的影响。
（3）原生质体再生的植株也是由单细胞发育而来，性状易纯化且遗传稳定。
所以向原生质体导入外源基因比向其他外植体导入外源基因有更大的优势，成为遗传转化中一种良好的受体。
由于基因枪技术的不断发展，向植物体直接导入外源基因已不再像以前那么困难，所以原生质体转化法的应用日趋减少，但在特定条件下，如转移细胞器及DNA 大片段时仍有一定的应用价值。
一、基本原理植物细胞壁由中胶层（主要成分果胶质）、初生壁（主要成分纤维素和半纤维素）和次生壁（主要成分纤维素，一般也含有木质素）三部分组成，利用果胶酶和纤维素酶消化植物细胞壁，释放出原生质体。
以原生质体为转基因受体，采用转基因方法，如PEG介导转化法通过改变质膜透性，促进外源DNA 进入已分离的植物原生质体，然后经过转化原生质体组织培养获得转化植株。
二、转化方法主要包括植物原生质体的分离和外源基因转化两个重要部分。
地衣芽孢杆菌原生质体的制备、再生及转化研究
ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，Ｂ．１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ３０３ Ｗａｓ ｓｅｒｖｅｄ ａｓ ａ ｈｏｓｔ ｓｔｒａｉｎ，ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ Ｗａｓ
ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ，ｐｒｅｌｉｍｉａｒｉａｒｉｌｙ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ丑ｌｉｃｈｅｎｉｆｏ，．珑捃３０３，ａｎｄ ｌａｉｄ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ
关键词：地衣芽孢杆菌，原生质体，制备，再生，转化
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｂａｃｉｔｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｏｒ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｊｔｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，ａｎｄ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｆｉｅｌｄｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｆｏｏｄ，ｆｅｅｄ，ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．们１ｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ Ｂ．１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｗｉｄｅ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｃａｎ ｎｏｔ ｍｅｅｔ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｎｅｅｄ，ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉＳ ｎｅｅｄｅｄ．Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ａｌｉｅｎ ＤＮＡ ｉｎｔｏ丑 ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｉｓ ｔｈｅ ｐｒｅｍｉｓｅ ａｎｄ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｔｏ ｈｏｓｔ，
ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ丑ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ．ｉｔ’Ｓ ｎｅｅｄ ｔｏ ｃａｒｒｙ ｏｎ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏ ｉｔｓ
拟南芥原生质体的制备及转化
拟南芥原生质体制备转化操作流程主要试剂1. 纤维素酶解液：试剂15ml酶液体系1．1-1.5﹪Cellulase R10 (YaKult Honsha)0.225g干粉2．0.2-0.4﹪Mecerozyme R10 (YaKult Honsha)0.045g干粉3．0.4M mannitol1.09g干粉4．20mM KCl1 ml 0.3 M KCl母液5．20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液6．加入10ml 水7．55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂8．10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl29．5 mM β-Mercaptoethanol（可选用）1ml 75mM β-Mercaptoethanol母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪BSA，1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存）11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。
2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）PEG4000( Fluka, #81240)……………1g………………………………….4g 水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g0.8 M Mannitol…………………………..0.625ml…………………………2.5ml1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml约1.2ml3. W5 溶液（1000ml）154mM NaCl, NaCl9g125mM CaCl2, CaCl2.H2O18.4g5mM KCl, KCl0.37g2mM MES（PH 5.7），MES0.39gpH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。
里氏木霉原生质体的制备及转化
里氏木霉原生质体的制备及转化摘要本实验通过将含潮霉素B抗性标记的质粒pAN7-1转化至里氏木酶原生质体中，在含100ug/ml潮霉素B的PDA平板上筛选转化子。
并予以验证，结果表明，在1kb处有潮霉素抗性基因组，其中浓度为107个/ml的转化子效果最好。
关键词里氏木酶原生质制备转化前言纤维素是自然界提供给人类的最宝贵的财富，植物每年通过光合作用产生数千亿吨的纤维素，但目前只有一小部分用于纺织、造纸、建筑和饲料等方面。
木霉属是迄今被认为纤维素酶成分最全面，分解天然纤维素活力最高的一类菌。
在育种方面利用高能电子、紫外线、亚硝基胍处理和原生质体融合等方法，使酶的活力得到很大的提高。
本试验对里氏木霉原生质体的制备及转化进行了研究,为进一步的育种工作奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株及质粒来源里氏木霉QM9414和质粒pAN7-1由深圳大学生命科学学院S402实验室刘刚老师提供。
1.1.2试剂及培养基的配制1.1.2.1 Mandels 营养盐浓缩液配制(NH4)2SO4 14 g，尿素 3 g，KH2PO420 g，CaCl2⋅2H2O 4 g，MgSO4⋅7H2O 3 g，ddH2O 定容至1L1.1.2.2 Mandels 微量元素浓缩液配制FeSO4⋅7H2O 5 g，ZnSO4⋅7H2O 1.7 g，CoCl2⋅6H2O 23.7 g，MnSO4⋅H2O 1.6 g，ddH2O 定容至1L1.1.2.3 1 M柠檬酸缓冲液配制柠檬酸210 g，NaOH（纯度96 %）78 g，ddH2O 750 ml，冷却后定容至1L1.1.2.4 60％的PEG400050 mM CaCl2，10 mM Tris·Cl（pH 7.5），60 g PEG4000加水定容到100 ml1M CaCl25ml，1M Tris·Cl（pH 7.5）1ml，PEG4000 60g，ddH2O定容至100 ml1.1.2.5 STC山梨醇218.6g（所需浓度为1.2 M），1M Tris·Cl（pH 7.5）10ml（所需浓度为10 mM），1M CaCl2 50ml（所需浓度为50 mM），ddH2O 定容至1L1.1.2.6 PDA培养基去皮土豆200g，葡萄糖20g，琼脂(Agar) 15g，ddH2O定容至1L其中20 %土豆浸出液制作方法如下：将土豆去皮切碎，每20 g土豆加水100 ml，置电炉上煮20分钟，用纱布过滤，定容。
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菌丝培养基 葡萄糖含量为0.5%的葡萄糖-蛋白胨完全培养基。
高渗再生培养基 以1.2mol/L Sorbitol（山梨糖醇）配制的葡萄糖-蛋白胨基本固体培养基。
0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）：0.2 mol/L NaH2PO4·2H2O（约240mL） 和0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O（约60mL）混合至pH为6.0
酶解1-2h，将培养皿内破碎菌丝体和原生质体混合液用吸管吹吸数次， 用G2或G3砂芯漏斗过滤，使原生质体同菌丝体碎片分开，滤液15002000r/min离心10min，洗涤去上清，悬浮于同一高渗溶液中。再将含 有原生质体的滤液用再生培养基洗涤三次，以清除酶液，然后用保存 液悬浮。血球计数板计数，冷藏备用。
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将制备好的原生质体溶液3200r/min，4℃离心10min； 弃上清，沉淀重悬于预冷的STC溶液中，将原生质体浓度调整为 5×106 ~ 5×107个细胞/mL； 将约2~5µg质粒DNA(体积不超过10µL)与100µL米曲霉原生质体置冰上 轻轻混匀； 加入25µL PTC溶液，冰浴20min； 加入1 mL PTC溶液，室温放置15min； 最后加入2mL STC溶液，混匀。 将适量上述转化液涂布于高渗再生基本培养基上，30℃培养5~7天，所 长出的菌落即为转化成功的菌株；同时设置未加质粒而转化的原生质体 涂布平板作为阴性对照。
*再生培养基：同查氏培养基，其中含NaCl浓度为0.8mol/L
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*缓冲液：pH5.8-6.8磷酸氢二钠-柠檬酸溶液 *高渗溶液：0.6mol/L NaCl溶液 *酶溶液：蜗牛酶、纤维素酶，用0.7mol/L的NaCl配制，G6砂芯漏 斗抽滤除菌
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菌丝体培养60 h,用1. 5%溶菌酶+ 0. 5%蜗牛酶混合酶液, pH值 6. 0～6. 5,温度30～35 ℃,酶解4 h,以0. 7mol/L甘露醇为稳渗剂, 此条件下原生质体产量可达1. 68 ×107 个/ml。 PDA再生培养基, 稳渗剂为0. 5 mol/L蔗糖,双层固体培养,此条 件下原生质体再生率可达6. 05% ～6. 12%
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混合酶液：2%纤维素酶，1%蜗牛酶，5mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）用pH6.0的 含0.4 mol/L NH4Cl的0.2mol/L磷酸缓冲液配置混合酶液，经0.45µm微孔滤膜过 滤除菌，保存于4℃
PTC溶液：25%PEG8000，50mmol/L CaCl2，10mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)
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原生质体制备
培养时间 酶种类和浓度 酶解时间 酶解温度 渗透压稳定剂 22h 单一蜗牛酶，3% 2.5h 36℃ 无机盐溶液有利于 原生质体的释放，而糖 醇类不利于原生质体释 放（NaCl）
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培养基成分 高渗溶液（有机/无机） 缓冲液的pH（5.8-7.4） 酶解条件（时间/各种酶的比例） 酶液用高盐还是高渗缓冲液配 擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体 双层or单层培养基
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取培养20h的康氏木霉菌丝体悬液10mL，4000r/min离心30min 收集菌丝体，用无菌水4000r/min离心30min洗涤2次，加2.0%蜗 牛酶溶液30℃水浴酶解至原生质体形成率接近100%时停止酶解， 用0.6mol/L NaCl 5min条件下离心洗涤2次，最后将原生质体悬 于0.6mol/L NaCl溶液中。 在原生质体制备过程中每隔一定时间取酶解液制成水封片于显 微镜下观察。
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《工业微生物育种学》 施巧琴 吴松刚 *菌丝培养基： 1、葡萄糖蛋白胨培养基 2、PDA培养基（一种普遍用于酵母菌和霉菌计数培养用的培养基，被推荐 用于各类食品和饮料中酵母菌和霉菌检测和计数 ） 3、査氏培养基（用于真菌的分离鉴定，霉菌、白色念珠菌、酵母等微生物）
双层平板，再生，计算原生质体再生率。
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林艳学姐： 挑Aspergillus oryzae P5菌丝于葡萄糖-蛋白胨斜面培养基上培养6~7天，至孢子 成黄绿色 取新鲜培养的斜面7支，用20mL无菌水洗下成熟孢子于铺满玻璃珠的三角瓶中， 置摇床上150r/min振荡分散30min 经四层无菌镜头纸过滤，制成孢子浓度约为107个/mL的单孢子悬浮液 将上述制得的孢子悬浮液每1mL接种于一瓶盛有50mL菌丝培养基的三角瓶中，于 30℃静止培养23~25h 6000r/min，离心10min收集幼嫩的菌丝体 用无菌水洗涤菌丝体，4000r/min，离心5min收集菌丝体 用PBA溶液洗涤菌丝体两次，每次4000r/min，离心5min收集菌丝体
1、接种于液体培养基上培养。
2、取培养液10ml，4000r/min离心5min, 弃上清液，用Tris-HCl(pH 7.4)、 0.5mol/LEDTA、高渗缓冲液各洗涤一次。 3、用含10mmol/L巯基乙醇的高渗缓冲液稀释裂解酶液。 4、加酶液，100r/min摇床50-100min酶解。脱壁效果达70%左右即停止酶解。 5、100r/min离心三分钟，去沉淀，取上清。再2000r/min离心10min收集沉 淀原生质体。 6、高渗缓冲液洗涤2次，2000r/min离心10min收集原生质体，最终用1ml高 渗缓冲液悬浮原生质体。
STC溶液：1.2mol/L Sorbitol，50mmol/L CaCl2，10mmol/L TrisLogo
王金良学长： 1. 米曲霉C-2在2% G-P斜面培养6天至长出孢子，灭菌去离子水洗下孢子，经四层 擦镜纸过滤制成孢子悬液，接种于50mL 0.5%G-P菌丝全培养基，30℃静置培养 23~25h； 2. 过滤收集菌体，用无菌水与0.8M NaCl各洗涤一次； 3. 菌体置于灭菌培养皿中，加入15ml 酶解液（2%纤维素酶、1%蜗牛酶、3mM DTT）； 4. 置30℃摇床（80r/min）酶解3h左右，在显微镜下观察原生质体的释放情况； 5. 酶解完全后，四层擦镜纸过滤，除去未酶解菌丝，离心收集原生质体； 6. 用0.8M NaCl洗涤二次，0.8M NaCl-50mM CaCl2 洗涤一次； 7. 弃上清原生质体重悬于100µL 0.8M NaCl-50mM CaCl2中，血球板计数。
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1、原生质体混合、PEG助融 2、双层平板：底层10ml的固体培养基（1.2%琼脂），将样品加入 5ml融化后的半固体培养基（0.6%琼脂，预保温42℃）中，快速混合， 导入铺有底层培养基的平板上。待上层凝固后，置于恒温箱培养
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取原生质体悬液1mL与5mL上层再生培养基混匀，倾倒于下层再生 培养基平板上，待培养基凝固后于28℃培养箱中倒置培养。用下式 计算再生率： 再生率（%）=（A-B）/C×100% 式中：A为经高渗溶液稀释的原生质体在再生培养基上长出的菌落 数；B为经无菌水稀释的原生质体在再生培养基上长出的菌落数； C为显微镜下计数的原生质体数。
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取107个/mL的单孢子悬浮液 ，涂布于平板表面的玻璃纸上，培养后用 无菌镊子将培养菌丝体的玻璃纸转移并倒复在已配好的酶液内，轻轻 抖动玻璃纸，菌丝体散落在酶液中，然后去玻璃纸，酶解，定时取样 观察。 （该法收集的菌丝体会十分干净，免去了洗涤、离心等手续，减少对 菌丝的伤害和杂菌污染）
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文献汇报
2011.3.3
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培养基成分 高渗溶液（有机/无机） 缓冲液的pH（5.8-7.4） 酶解条件（时间/各种酶的比例） 酶液用高盐还是高渗缓冲液配 擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体 双层or单层培养基
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高渗缓冲液： 《微生物学实验教程》 周德庆（酵母） 蔗糖0.5mol/L, MgCl2 10mmol/L,Tris-HCl(pH 7.4) 10mmol/L
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以0.15g湿菌体用酶量1mL的比例，加入酶液，置于灭菌平板中
置33℃摇床上80r/min振荡酶解，每半小时取样，在显微镜下观察原生质体的释放 情况 待酶解完全后，加等体积1mol/L山梨醇溶液，用四层无菌镜头纸过滤，除去未酶 解的菌丝体残片，收集原生质体液 4000r/min室温离心10min，收集原生质体沉淀 去上清，沉淀用1mol/L 山梨醇溶液洗涤2次，每次4000r/min离心10min 弃上清将原生质体悬浮于5mL 1mol/L 山梨醇溶液中，-70℃冰箱冷冻保存备用
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1、将构建的pMD-pyrG质粒与100µL原生质体置冰上轻轻混匀； 加入25µL预冷PTC，冰浴30 min； 2、再加入500µL上述PTC溶液，平静混匀，室温20min； 加入预冷1mL 0.8M NaCl-50mM CaCl2 ，混匀； 3、与100mL米曲霉高渗再生培养基混合，倒平板； 30℃培养4-7天。
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原生质体再生
酶种类和浓度 酶解温度 渗透压稳定剂 单一蜗牛酶，2% 30℃ 糖﹑醇类有利于原生质 体的再生而无机盐类物 质不利于再生（蔗糖） 0.8mol/L
再生培养基中蔗糖浓度
康氏木霉原生质体制备的最适菌龄为22h，蜗牛酶浓度为2.0%，酶 解温度为30℃，酶解时间为2.5h，蜗牛酶溶液中的渗透压稳定剂为 0.6mol/L NaCl，再生培养基中的渗透压稳定剂为0.8mol/L蔗糖