细胞培养常用水和平衡盐溶液的配制方法
培养用液的配制
实验一培养用液的配制、除菌与分装【实验目的】1. 掌握常见培养用液的配制方法。
2. 掌握常用的灭菌方法。
3. 了解每种培养用液的作用。
【实验原理】常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和EDTA溶液。
PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和EDTA。
培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。
鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM 和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。
胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。
EDTA 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。
细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS 和EDTA 可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。
【试剂、材料与仪器】试剂：NaCl ；KCl；Na2HPO4；KH2PO4；EDTA；胰蛋白酶；HEPES；碳酸氢钠；MEM或PRMI-1640 培养基干粉；GPS材料：三蒸水，蒸馏水瓶，精密天平，药匙，称量纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH 试纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，消毒纱布，酒精喷壶，已高压灭菌试剂瓶（500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，移液管（5 mL、10 mL），封口膜仪器：超净工作台，加液枪，4℃冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。
第1组配制PBS并高压灭菌，第2组配制胰蛋白酶溶液并过滤除菌和分装，第3组配制EDTA溶液并分装高压灭菌，第4组配制培养基，第5组过滤除菌培养基并分装。
每个实验小组需准备试剂有：胰酶50 mL；EDTA 50 mL；培养基90 mL（使用前加入10 mL血清）。
细胞培养标准操作程序(SOP)
细胞培养标准操作程序(SOP）1．目的:为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。
2．适用范围：适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3．操作规程：3。
1 培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3.1.1 1000ml培养液的配制1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。
紫外线照台30min.2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末.3、充分搅拌，按说明添加成分(如Invitrogen公司的RPMI—1640配制1000ml需加NaHCO3粉2。
0g,Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等），再充分搅拌.无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。
4、用1M(1mol/L）HCl 调PH至7。
0左右（细胞适宜在PH7。
2~7。
4生长，配制好后PH值会升高0。
2～0。
3，故配时调PH至7。
0左右）。
5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml.6、配青霉素 80万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解取0。
5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液,并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口,盖上橡皮塞,放—20℃保存备用.注意：(1）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水(或新鲜反渗水）配制。
一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。
（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌,干净即可.3。
细胞培养液配方
双抗(0.2ml)
RPMI-1640培养基 (180ml)
胎牛血清 (20ml)
双抗 （2ml）
溶液各组分终浓度为90%RPMI-1640培养基 +10%胎牛血清+1%双抗（200mM L-谷氨酰胺、10mg/ml链霉素和10000U青霉素）
三 细胞冻存液配方：(20ml)
RPMI-1640培养基 (14ml)
胎牛血清 (4ml)
细胞培养常用溶液配方
一PBS配方：
方法一 1×PBS(Phosphate-Buffered Sallines)
Na2HPO4、Na2HPO4•7H2O、Na2HPO4•12H2O中任选其一。
方法二 母液的配制：
0.2M Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于1000ml水
0.2M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H0.2M PB，加水稀释至1000ml即可。
0.02MPBS（PH=7.4）：取100ml 0.2 M PB，加水稀释至1000ml即可。
若需要NaCl的话，加入NaCl至0.9%（g/100ml）即可。
细胞培养常用溶液配方
二 细胞培养液配方：（200ml）
各种浓度PBS(pH=7.4)的配制：
先配0.2M PBS(pH=7.4，100ml)：取19ml 0.2mol/L的NaH2PO4，81ml 0.2mol/L的Na2HPO4,即可。
然后只需将0.2M PB (pH=7.4)按相应比例适当稀释即可，如：
0.1MPBS（PH=7.4）：取500ml 0.2M PB，加水稀释至1000ml即可。
细胞培养用营养液及溶液配制方法
细胞培养用营养液及溶液配制方法
1.平衡盐溶液
1.1汉氏液(Hank’s液）
10倍浓缩液每1000ml中含
甲液氯化钠80g
氯化钾 4.0g
氯化钙 1.4g
硫酸镁（7个结晶水） 2.0g
乙液磷酸氢二钠（12个结晶水） 1.52g
磷酸二氢钾0.6g
葡萄糖10g
1%酚红溶液16ml
将甲液与乙液中的各种试剂按顺序分别溶于注射用水450ml中，然后将乙液缓缓加入甲液中，边加边搅拌。
补注射用水至1000ml，用滤纸过滤后，加入氯仿2ml，置2~8℃保存。
使用时，用注射用水稀释10倍，经116℃灭菌15min。
使用前，以7.5%NaHCO3溶液调PH之至7.2~7.4。
1.2依氏液(Earle’s液）
10倍浓缩液每1000ml中含
氯化钠68.5g
氯化钾 4.0g
氯化钙 2.0g
硫酸镁（7个结晶水） 2.0g
磷酸氢二钠（1个结晶水） 1.4g
葡萄糖10g
1%酚红溶液20ml
其中，氯化钙应单独用注射用水100ml溶解，其他试剂按顺序溶解后，加入氯化钙溶液，然后补足注射用水1000ml。
用滤纸过滤后，加入氯仿2.0ml，置2~8℃保存。
使用时，用注射用水稀释10倍，经116℃灭菌15min。
使用前，以7.5%NaHCO3溶液调PH之至7.2~7.4。
1.2依氏液(Earle’s液）。
实验三动物细胞培养用液的配制
实验三动物细胞培养用液的配制实验三动物细胞培养用液配制一、实验目的1.了解细胞培养常用培养液和试剂配制的基本方法。
2.初步掌握高压灭菌和抽滤灭菌的方法。
.二、器材与试剂：RPMI-1640干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素.蒸馏水、电子天平、PH计、磁力搅拌器、5.6%的NaHCO3三、实验原理动物细胞培养常用液有平衡盐溶液、培养基(天然和合成)及消化液等。
配制这些常用液有严格的要求：(1)使用高纯化的三蒸水。
(2)按照用液的配方计算所需各成分的用量，然后准确量取，并按规定顺序溶于三蒸水中。
(3)保证各组分完全溶解。
(4)进行pH值测试和调整。
(5)消毒分装小瓶，抽样做无菌实验，保证用液无菌。
四、具体步骤：1、酚红（0.1%）配法：称酚红2g，先用数滴5.6%的NaHCO3溶液溶解，再加进该5.6% NaHCO3溶液使最终体积为100mL，瓶装保存，备用。
2、Hanks平衡盐溶液。
（Hanks液是常见的平衡盐溶液（BSS）之一。
D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。
）1.按表称取Hanks、D-Hanks试剂。
表13-2 D-Hanks试剂的配制成份Hanks D-HanksCaCl20.140 －KCl 0.400 0.400KH2PO40.060 －MgCl2·6H2O 0.100 －MgSO4·7H2O 0.100 －NaCl 8.000 8.000NaHCO30.350 0.350Na2HPO4·12H2O －0.132Na2HPO4·7H2O 0.090 －D-葡萄糖 1.000 1.000酚红（0.1%）1mL 1mL2.依次加入上述试剂至800mL蒸馏水中，溶解后定容至1000mL。
3.高压灭菌，10磅10min。
注意事项1.BSS的pH值应确定为7.2左右。
与含有其他成分的液2.如配制的Hanks液高压灭菌后液体变混，则可将100mL的CaCl2体分别装瓶高压灭菌之后，再在无菌条件下配制，定容。
实验室常用溶液配方
实验室常用溶液配方常用溶液配方（细胞培养）PBS配制一、PBS配方配1L 25倍PBSNaCl 200gNa2HPO4-2H2O 36g 最难溶最后加或Na2HPO4-12H2O 72.4g NaH2PO4-2H2O 6.5g 或NaH2PO4 5g搅拌，1000ml定容，调PH值至7.2—7.4（细胞培养）1倍PBS配方NaCl 8.0gKCl 0.2gNa2HPO4 1.44g 或者Na2HPO4-12H2O 3.57gKH2PO4 0.24g加水定容至1L，调PH值7.2-7.4（细胞培养）10倍PBS配方NaCl 80gKCl 2gNa2HPO4 14.4g 或者Na2HPO4-12H2O 35.7gKH2PO4 2.4g（组化用）PBS配方配1L 10 倍PBSNaHPO4 10.9g 或Na2HPO4-12H2O 27.50gNaCl 90gNaH2PO4 3.2g 或NaH2PO4-2H2O 4.16g搅拌，1000ml定容，调PH至7.2，分装，常温保存配1倍PBS（0.01PBS）1.取50ml 10倍PBS，倒入容量瓶2.定容至500ml，摇匀，分装二、胰酶的配制：0.25%胰酶1倍PBS 1000ml胰酶粉（trypsin）2.5gEDTA 0.4g搅拌后4摄氏度过夜，然后用NaOH调PH值至7.2-7.4；用0.22um滤器（绿色滤器）过滤分装保存。
三、培养基配制L-DMEM配制1L培养液：L-DMEM 10gNaHCO3 2.2g双抗1%（11ml）胎牛血清110ml注：国产胎牛血清需要56℃，30min灭活加完混合后，用0.22um的滤器过滤除菌，4摄氏度保存。
低糖冻存液的保存冻存液：L—DMEM：血清：DMSO=6：3：1注：（DMSO要缓慢加入，以防散热不均，下面要垫上冰块，助散热。
配好后用0.22微米滤器过滤，分装，4℃保存1640培养液配制1L体系：1640干粉10.3g/LNaHCO3 2g双抗1%100倍谷氨酰胺10mlβ-巯基乙醇3.5 uL胎牛血清10%（灭活）0.22微米滤器过滤，4℃保存。
平衡盐溶液配置方法 外科学
平衡盐溶液配置方法外科学
平衡盐溶液在外科学中有着重要的应用，它们通常用于清洁和
冲洗伤口以及保持伤口的湿润，促进愈合。
平衡盐溶液的配置方法
如下：
1. 常见的平衡盐溶液配方是生理盐水，也称为0.9%氯化钠溶液。
配方为每升水中含有氯化钠9克，这是最常见的平衡盐溶液配
方之一。
2. 另一种常见的平衡盐溶液是Ringer液，它包括氯化钠、乳
酸钠和钙氯化物等成分，用于维持细胞外液的渗透压和电解质平衡。
3. 林格液（Lactated Ringer's Solution）是另一种常用的平衡盐溶液，含有氯化钠、乳酸钠、钾氯化物和钙氯化物，适用于手术、创伤和烧伤患者。
4. 在配置平衡盐溶液时，需要严格按照配方比例将相应成分加
入适量的水中，并确保充分溶解。
在外科学中，配置平衡盐溶液需要严格遵循无菌操作规范，以
确保溶液的纯净度和安全性。
此外，根据患者的具体情况和需要，
医生可能会调整平衡盐溶液的配方和浓度，以达到最佳的治疗效果。
在使用平衡盐溶液时，医护人员需要注意其保存和使用方法，避免
污染和交叉感染的发生。
总的来说，平衡盐溶液在外科学中扮演着重要的角色，正确的
配置和应用对于患者的治疗和康复至关重要。
医护人员需要严格遵
循相关的操作规范，确保平衡盐溶液的质量和安全性，以提供最佳
的医疗护理。
CELL-培养用液
品质最高
4、鉴定内容：
血清质量高低取决于： 血清质量高低取决于：
取材对象 :用于制备血清的动物要健 康无病，并在指定的出生天数之内； 康无病，并在指定的出生天数之内； 严格按照操作规程进行， 取材过程 :严格按照操作规程进行， 并进行严格的质量鉴定。 并进行严格的质量鉴定。 理化性质：蛋白含量越低越好; 1）理化性质：蛋白含量越低越好; 2）微生物检测主要是检测支原体和 病毒; 病毒; 3）促生长效果。 促生长效果。
含有鼠尾胶原的培养基
在鼠尾胶原中生长的PC-12 细胞 在鼠尾胶原中生长的
（三）合成培养基
合成培养基又称为基本培养基； 合成培养基又称为基本培养基； 加入血清后叫做完全培养基。 加入血清后叫做完全培养基。 液体培养基 干粉培养基
基本培养基的组分
最初的199培养基共有60种物质; 低限量基础培养基（minimum essential media, MEM) 含有20多种物质(分四大类): 无机盐,氨基酸,维生素,碳水化合物. 酚红,一种PH指示剂. 常用培养基RPMI1640,EMEM等都是30多种成分, 添加了非必需氨基酸和维生素.
配制干粉培养基的注意事项： 配制干粉培养基的注意事项：
（1）认真阅读说明书,看清未添加的成分; （2）谷氨酰胺,NaHCO3在培养基完全溶解后才能添加; （3）若干粉培养基中含有谷氨酰胺，最好在一周内用 完，用不完的储存于-20℃；不含谷氨酰胺的需要按 比例，现用现加; （4）如果是开放式培养，按照要求加NaHCO3 ； 如果是密闭式培养，则用NaHCO3调整PH值.
教学目的: 教学目的 1、掌握细胞培养对水的要求。 、掌握细胞培养对水的要求。 2、了解常用的平衡盐溶液的配制及使用 、 方法。 方法。 3、了解细胞培养常用液有那些。 、了解细胞培养常用液有那些。 4、了解常用的培养液的种类。 、了解常用的培养液的种类。
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细胞培养常用水和平衡盐溶液的配制方法关键词：细胞培养基ATCC 北纳细胞网
一、水
水是细胞赖以生存的主要环境，营养物质和代谢产物都必须溶解在水中，才能为细胞吸收和排泄。
而且，水溶液对维持细胞形态、进行生物化学反应、温度传导、调节渗透压和酸碱度的平衡都有着重要作用。
体外培养细胞对水的质量很敏感，要求很高。
水的纯度不够，即使混杂有一些含量极微的有害元素，有时也会对细胞产生不利的影响，甚至引起细胞中毒死亡。
因此．配制培养液的水必须经过纯化。
细胞培养实验室需要纯净的水，常可分为离子交换水和蒸馏水两种。
前者由于仍然带有非离子物质和有机物，在组织培养中很少使用。
组织培养必须使用玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水；二次蒸馏水或外购的金属蒸馏器制的蒸馏水只能用于清洗器皿。
蒸馏水的储存对保持水的质量有很大影响；周围环境和空气能使水污染或改变其pH，所以储存水的容器要尽量减少启开的次数，避免和外界过多接触，存放时间不宜太长，一般不要超过两周，最好现制现用。
二、平衡盐溶液(balanced salt solution，BSS)
1．BSS种类：BSS是从Ringer生理盐水发展起来的，主要由无机盐和葡萄糖组成。
BSS中的无机离子不仅是细胞生命所需成分，而且在维持渗透压、缓冲
和调节溶液的酸碱度方面，起着重要作用。
BSS中含少量的酚红，作为溶液酸碱度变化的指示剂；溶液变酸时呈黄色．变碱时呈紫红色，中性时呈桃红色，借此易于观察到培养液pH的变化。
表2—8是几种常用BSS中的组成成分的比较。
Hanks液和Earle 液是配制各种培养液最常用的基础溶液，它们的主要区别在于缓冲系统不同。
Hanks液缓冲能力较弱，需利用空气平衡；Earle 液含有高浓度的NaHCO3，缓冲能力较强，需用5％CO2平衡。
钙、镁离子是细胞膜的重要组成成分，它们有促使细胞凝聚作用。
因而配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时．宜采用钙、镁离子含量低的Dulbecco液和无钙镁离子的D-Hanks液或PBS液。
2．BSS 的配制方法：配制BSS 时主要应避免钙、镁离子的沉淀，下面以Hanks 液为例说明其配制方法。
(1)按成分表准确称量试剂。
许多试剂是含有水分的水化物，与不含水分试剂的称量不同．应加以换算。
(2)将CaCl2先溶解在100ml水中。
(3)其他成分依次溶解于750 ml水中(注意应待前一种试剂完全溶解后，再溶解下一种成分)。
(4)用数滴5．6％NaHCO3 溶液溶解酚红。
(5)将(2)缓慢倒人(3)中，并不时搅动，防止出现沉淀：
(6)将(4)加入(5)中。
(7)将(6)移人答量瓶中，三蒸水定容至1000ml。
(8)分装瓶中，8磅10min 高压蒸气灭菌，4℃冰箱内保存。
按上述方法也可配制成10×浓度的储存液，在储存液内加少许三氯甲烷(2~3ml)防腐；三氯甲烷在高压灭菌时可挥发掉，不影响使用；加三氯甲烷后要用力混匀，在室温或4℃储存。
用时按比例稀释，滤纸过滤后分装入瓶中，包装高压灭菌后，于无菌条件下，换上无菌胶塞，置冰箱中保存备用。
如液体出现浑浊或沉淀时，应重新配制。
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