各种酶活性测定方法
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。
此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。
因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。
2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。
反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。
每个处理设3 个重复。
（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。
用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。
取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 20mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法有多种。
以下列举了常见的几种方法：
1. 酶动力学法：通过测定酶催化底物转化为产物的速率，来确定酶活性。
常用的酶动力学方法有初始速率法、双重倒数法、利用酶反应速率与底物浓度的关系等。
2. 比色法：利用酶与底物反应后产生的色素变化进行酶活性测定。
例如，过氧化物酶活性可通过测量其催化产生的有色产物浓度的变化来确定。
3. 荧光法：利用酶与底物反应后产生的荧光变化进行酶活性测定。
荧光法的灵敏度高，操作简便。
例如，酯酶活性可通过测量底物转化为产物后产生的荧光强度的变化来确定。
4. 放射性同位素法：将放射性同位素标记在底物上，通过测量酶催化底物与同位素的结合来确定酶活性。
例如，放射性同位素法可用于测定DNA聚合酶活性。
5. 电化学法：利用酶与底物反应后产生的电流变化进行酶活性测定。
常用的电化学方法包括循环伏安法和电化学阻抗法。
例如，葡萄糖氧化酶活性可通过测量产生的电流与葡萄糖浓度之间的关系来确定。
值得注意的是，不同酶具有不同的理化性质和催化机制，因此需要根据具体酶的
特性选择适合的测定方法。
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。
此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。
因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。
2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。
反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。
每个处理设3 个重复。
（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。
用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。
取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 220mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。
酶活性测定方法
酶活性测定1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠）0.2mol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(pH: 9.6)——buffer0.2mol/L NaOH测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min；(3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
计算：每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.704 (Eu)2、酸性磷酸酶(Acid phosphatase)试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠）0.2mol/L HAc/Ac缓冲溶液(pH: 4.8)——buffer0.2mol/L NaOH测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min；(3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
计算：每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。
[(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.719 (Eu)3、a-葡萄糖甘酶(a-glucosidase)试剂：0.1% p-nitrophenyl a-D glucopyranoside（p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷）0.2mol/L Tris-HCl (pH: 7.6)测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷及Tris-HCl 37°C 孵化30 min；(2) 1mL污泥样品+1mL 0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷+2mL Tris-HCl 37°C孵化60 min；(3) 沸水加热3min 终止反应；(4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。
酶活性测定方法
一、过氧化物酶（POD）活性的测定POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。
测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。
然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。
在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。
以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。
△470 ×V TPOD活性=0.01×t×Vs×W式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）t----反应的时间（min）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）W----样品鲜重（g）二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。
酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。
PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。
混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。
PPO活性= O D×V T0.01×t×0.5g×V s= O D×V T0.005OD——反应时间内吸光值的变化；V T ----提取酶液的总体积（ml）Vs ----测定时取用酶液体积（ml）T———反应时间(min)；三、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性的测定参照张志良等(1990)人的方法并稍作改动。
植物五种酶活性检测方法
欢迎阅读选择茶树不同品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同的时间点(0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h)取样，每个样品重复三次，测定PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。
1、多酚化酶（Polyphenoloxidase ，PPO ）活性的测定适量茶鲜叶（3g ）,料液比1:2，加入内含5%PVP （w/v ）经遇冷的pH 为7.2的柠檬酸-，取上取 1.2ml （（37℃恒合液。
0.01为2离心20min 取酶提取液0.2ml ，加入由硼酸钠缓冲液配制的0.1mol/LL-苯丙氨酸，2.8ml 蒸馏水，摇匀，在40℃水浴上反应30min ，冰浴中终止反应，测定OD290值，以相同体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为对照。
PAL 的酶活性以每小时在290nm 处吸光度变化0.01OD 为一个活力单位。
3、脂氧合酶(linoleate:oxygenoxidoreductase ，LOX )活性的测定取0.2g新鲜样品，加7ml经4℃预冷的1mol/L（pH7.6）的tris-HCL缓冲液冰浴上研磨。
4℃、12000r/min离心25min,上层清液即为LOX酶提取液。
Lox酶活性单位以每分钟在234nm处吸光度变化0.01OD作为一个活力单位。
4、过氧化物酶（PDA）的活性测定（愈创木酚法）取0.5克剪碎叶片于预冷研钵中，加入5ml的提取介质0.05mol/LPH7.8的磷酸缓冲液（含1%PVP[取2-3ml5分ΔA470积（ml，5取（含1%PVP12h。
1000r/min离心20min,得到酶初提液。
取200mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml30%的H2O2（原液）摇匀即可。
取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）。
（测定30s读数一次，5分钟）。
酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。
酶活性的检测方法
DNS 还原糖 显色反应
比色法
蔗糖转化酶的活性检测： 光谱学检测
蛋白酶活性的检测：
BBA - Proteins and Proteomics, 1864 (1), 2016, 130-142
酶活性的检测方法
（二） HPLC检测法
植酸酶的活性检测方法： （植酸酶催化的脱磷酸反应的探针）
Soil Biology & Biochemistry 41 (2009) 192-200
酶活性的检测方法
酶活性的检测方法
（五） 耦合反应法（可耦合脱氢酶反应） 脱氢酶以NADH/NADPH为辅酶
NADH/NADPH的转换可耦 合340nm吸光度变化：
酶活性的检测方法
葡萄糖激酶的活性检测：
3.反应条件应有利于指定反应方向的进行，可以移除生成 物，或接上耦合反应。
二、酶活性的检测方法
直接测定生成物
耦合反应法 （可耦合脱氢酶反应）
光谱学检测法 HPLC检测法 化学测定法 电极检测法
酶活性检测的具体方法
（一） 光谱学检测法
• 生成物有特定的紫外或荧光吸收
木聚糖酶、纤维素酶活性检测：
木聚糖 羧甲基纤维素
主要内容
酶催化反应原理 酵素产品部分酶活性的检测
一、酶催化反应原理
把催化反应转化成可测量的模式
Juang RH (2005) EPA
测量酶催化活性应注意的事项
酶活性的检测通常是指催化活性的检测，建立活性检测步 骤时，应注意：
1.测定生成物的产生量比测定反应物的消失量），回 馈抑制酶反应。
酶活性的检测方法
（三） 化学测定法
• 如果生成物不具有光谱学特性，可以通过化学反应使之转化成 具有特定光谱吸收的物质，进而进行测定。
各种酶活性测定方法
各种酶活性测定方法第一超氧化物歧化酶SOD测定一、原理超氧物歧化酶〔superoxidedismutase,SOD〕普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶.本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑〔NBT〕在光下的还原作用来确定酶活性大小.在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收.而SOD可清除O2,从而抑制了甲腙的形成.于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高.据此可以计算出酶活性大小.二、材料、仪器设备与试剂〔一〕材料；水稻或小麦叶片〔二〕仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯〔反应试管处照度为4000Lx〕；5.试管或指形管数支.〔三〕试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液〔pH7.8〕；2. 130mmol/L 甲硫氨酸〔Met〕溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存；4. 100μmo l/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存.三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片〔视需要定,去叶脉〕0.5g于预冷的研钵中,1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml.取 1.5～2ml于1000rpm下离心20min,上清液即为SOD粗提液.2. 显色反应取5ml指形管〔要求透明度好〕4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下列加入各溶液：试剂〔酶〕用量〔ml〕终浓度〔比色时〕0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met 溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处,其它各管于4000Lx日光下反应20min〔要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长〕.3. SOD活性测定与计算至反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定其它各管的吸光度.四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD活性.SOD总活性＝<A ck－A E>×V/<A ck×0.5×W×V t>上式中,SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积〔ml〕Vt测定时样品用量〔ml〕W样鲜重〔g〕蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重. SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试剂盒法缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液1. SOD的测定方法加样顺序：〔V=3ml〕磷酸缓冲液：1.5ml L-Met: 0.3mlNBT: 0.3mlEDTA-Na2: 0.3ml 核黄素：0.3ml 酶液：0.05ml 蒸馏水：0.25ml试剂配制：<1> 0.05mol/L PBS：pH7.8<2> 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml<3> 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml<避光保存><4> 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml<5> 20umol/L核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml<避光保存>注：〔1〕对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管<2> 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值2.MDA的测定方法试剂配制：〔1〕5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml〔2〕0.5% TBA：2.5g用TCA定容至500ml方法：酶液1ml—3ml0.5%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却,10000r/min 离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值3.POD的测定方法试剂配制：〔1〕0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液A<0.2mmol/L的HAc溶液>—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中〔2〕0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中〔临用前配制〕〔3〕0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml〔临用前配制〕方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml 0.25%愈创木酚溶液—xml酶液〔5min值为500-800即可〕—0.1ml 0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min4.CAT的测定方法试剂配制：<1> 50mmol/L的PBS〔pH7.0〕 <2> 0.3% H2O2—1ml H2O2定容至100ml方法：<1>以不加H2O2的50mmol/L的PBS〔pH7.0〕为空白把A240调零<2>50ul酶液—3ml 50mmol/L的PBS〔pH7.0〕—0.2ml 0.3% H2O2—迅速颠倒混匀,开始计时—1min后在240nm下比色,1次/1min<连续读取5min>.20XX06月22日星期二 19:331 叶绿素含量测定：80％的丙酮液的配制：4L丙酮+ 1L蒸馏水.称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管〔做三个重复〕,加入25ml浓度为80％的丙酮液,放在黑暗处浸提大约36小时后取出,稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm 下测定光密度,以80％的丙酮液为空白.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35～36〕也可用95%乙醇溶液,在665、649、470nm处有最大吸收峰649Cx.c=<1000D470-2.05Ca-114Cb>/2452 抗氧化酶活性的定：〔2.5g样〕0.05mol/L磷酸缓冲溶液<PBS>〔pH=7.8〕溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285g NaH2PO4·2H2O, 定容到4L.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P134〕. 取低温保存的鲜样,称2g左右的叶片〔或根〕放在50ml的离心管,加入20ml浓度为0.05mol/L 磷酸缓冲溶液〔pH=7.8〕〔最好是较冷的磷酸缓冲溶液,防止研磨时温度过高使酶失活〕,研磨〔用磨碎机磨〕,8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟,上清液为粗酶液.2.1丙二醛〔MDA〕的测定：20％三氯乙酸〔TCA〕溶液的配制：称200g三氯乙酸,用蒸馏水定容到1000ml.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124〕；0.5% 硫代巴比妥酸〔TBA〕溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸〔TBA〕,用20％三氯乙酸〔TCA〕溶液溶解并定容到1000ml.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124〕〔先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解〕；0.5ml酶液〔对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液〕〔做三个重复〕+ 3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min――冷却〔至少30min〕――比色〔OD600、OD532、OD450〕.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124〕2.2超氧化物歧化酶〔SOD〕的测定：NBT<400ml>混合反应液:392mlPBS<Ph=7.8>,+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液〔100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素〕.〔另配〕100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na测试时：取3ml反应液+0.05ml<根>或0.02 ml<叶>粗酶液,于光照培养箱中6-10分钟,OD650下测定吸光度.2.3过氧化物酶〔POD〕的测定：0.05mol/L磷酸缓冲溶液<PBS>〔pH=7.0〕溶液的配制：10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975g NaH2PO4·2H2O,定容到1000ml.0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS>定容到250ml.0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS>定容到250ml.2ml 0.3%H2O2溶液+ 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液+ 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS> + 0.02ml？？〔原来为0.01〕酶液〔根加0.05ml酶液〕〔对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液〕〔做三个重复〕,记录470nm处OD降低速度.将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121〕比色时加酶液,混合后即刻计时.2.4 脯氨酸的测定标准曲线的制作：编号1234567标准脯氨酸的量〔ml〕00.10.20.40.60.81.0H2O〔ml〕1.00.90.80.60.40.20冰乙酸〔ml〕2222222显色液〔ml〕3333333脯氨酸含量〔µl〕012468100.5ml酶液〔对照用0.5ml 80％乙醇代替〕〔做三个重复〕+ 1ml冰乙酸+ 1.5ml显色液―――混匀,沸水浴15min,冷却后测OD520.2.5可溶性蛋白的测定〔参考赵志杰,史国安,董新纯编的《植物生理学实验指导》〕牛血清白蛋白：配成100µg/ml和1000µg/ml.90％乙醇：90ml乙醇+ 10ml蒸馏水.？？？85％〔W/V〕磷酸：170ml磷酸+ 30ml蒸馏水.考马斯亮蓝G-250:称0.2g考马斯亮蓝G-250溶于100ml 90％乙醇中,加入85％〔W/V〕磷酸200ml,用蒸馏水定容到2L.常温下可保存一个月.标准曲线的制作：配制0～100µg/ml血清白蛋白血液管号123456100µg/ml牛血清白蛋白<ml>00.20.40.60.81.0蒸馏水量<ml>1.00.80.60.40.20蛋白质含量〔ml〕00.020.040.060.080.10配制0～1000µg/ml血清白蛋白血液管号789101112100µg/ml牛血清白蛋白<ml>00.20.40.60.81.0蒸馏水量<ml>1.00.80.60.40.20蛋白质含量〔ml〕00.20.40.60.81.00.1ml 酶液〔做三个重复〕+ 5ml考马斯亮蓝G-250―――混匀,放置2min后在595nm下比色.2.6过氧化氢酶〔CAT〕的测定：0.3%H2O2溶液的配制：吸5ml 30%H2O2,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液<PBS>定容到500ml.1 ml 0.3%H2O2溶液+ 1.9ml H2O + 0.1 ml 酶液,测定240nm处OD降低速度.将每分钟OD 减少0.01定义为1个活力单位.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121〕2.7 抗坏血酸〔ASA〕的测定：〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P125〕5％三氯乙酸〔TCA〕溶液的配制：25g三氯乙酸,用蒸馏水定容到500ml.10％三氯乙酸〔TCA〕溶液的配制：25g三氯乙酸,用蒸馏水定容到250ml.150mmol/L NaH2PO4〔pH 7.4〕溶液的配制：100ml.44％H3PO4溶液的配制：250ml.4％2,2-二联吡啶溶液的配制：250ml.3％FeCl3溶液的配制：100ml.首先标制作准曲线.粗酶液的提取：取低温保存的鲜样,称0.5g左右的叶片〔或根〕放在50ml的离心管,加入15m 5％三氯乙酸〔TCA〕溶液〔最好是较冷的三氯乙酸〔TCA〕溶液,防止研磨时温度过高使酶失活〕,研磨〔用磨碎机磨〕,15000r/min的冷冻离心机下离心10分钟,上清液为粗酶液,用于抗坏血酸〔ASA〕含量的测定.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125～126〕测定：0.2ml 粗酶液+ 0.2ml 150mmol/L NaH2PO4〔pH 7.4〕溶液+ 0.2ml H2O,混匀〔振荡〕,至少30秒后,再依次分别加入：0.4 ml 10％三氯乙酸〔TCA〕溶液+ 0.4 ml 44％H3PO4溶液+ 0.4 ml 4％2,2-二联吡啶溶液+ 0.2ml 3％FeCl3溶液,混合后在37℃水浴中保温60min,测定OD525处的值.〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125～126〕2.8 谷胱甘肽的测定：4g新鲜材料+ 2ml 0.3mol/L醋酸汞+ 2ml 30％醋酸钠后研磨匀浆,转移到离心管中,以蒸馏水冲洗残渣,并以玻璃棒搅拌,净置10min,使之充分沉淀,离心后弃去上清液,沉淀以水〔每次10ml〕在摇动情况下冲洗2次.向沉淀中加入10ml 1mol/L盐酸以溶解其中的谷胱甘肽,以玻璃棒搅拌5min后加入1ml 20％的碘化钾溶液,混匀,离心.上清液转入供滴定用的100ml玻璃管中,沉淀在搅动情况下以10ml水冲洗.离心后溶液与第一次离心液合并.向得到的溶液中加入0.5ml淀粉液,用1mmol/L KIO3滴定,直至出现不消失的蓝色为止.1ml 1 mmol/L 的KIO3相当于0.307mg谷胱甘肽.〔参考《现代植物生理学实验指南》,中国科学院##植物生理研究所编〕.2.9天冬酰胺合成酶〔AS〕的测定：2.10 天冬酰胺转氨酶〔AspAT〕的测定：3 硝酸还原酶<NR>的测定采用离体法：〔1g样〕〔参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27～29〕亚硝酸钠标准溶液〔1µg/ml〕：称NaNO2 0.9857g ,定容到1000ml,再吸5ml定容到1000ml.0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液：30.0905g Na2HPO4·12H2O + 2.4965g NaH2PO4·2H2O,加蒸馏水定容到1000ml.3mol/L HCl：125ml浓盐酸加蒸馏水定容到500ml.1％磺胺溶液：5.0g磺胺溶于500ml 3mol/L HCl中.0.2％a-萘胺溶液：1.0g a-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml,贮于棕色瓶中.0.1mol/L KNO3溶液：5.055g KNO3溶于500mln 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液.0.025mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液：Na2HPO4·12H2O 8.8640g + NaH2PO4·2H2O 0.0570g,加蒸馏水定容到1L.提取缓冲液：1.211g半胱氨酸+ 0.372g EDTA,溶于1L 0.025 mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液. 2mg/ml NADH 溶液：0.5g NADH溶于250ml 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液〔临用前配制〕. 首先标制作准曲线:取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂,即配成0～2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液.摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min,然后在540nm波长下比色.以亚硝态氮〔μg〕为横坐标〔x〕,光密度值为纵坐标〔y〕绘标准曲线或建立回归方程.各试剂加入顺序管号1234567亚硝酸钠标准液<ml>00.20.40.81.21.62.0蒸馏水<ml>2.01.81.61.20.80.401％磺胺溶液<ml>44444440.2%α-萘胺<ml>4444444每管含NO2- <μg>00.20.40.81.21.62.01g 材料+15ml提取缓冲液后研磨匀浆,转移到离心管中于4℃、4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液,用于硝酸还原酶<NR>的测定.0.4ml+1.2ml 0.1mol/L KNO3溶液+ 0.4mlNADH溶液后混匀〔对照不加NADH溶液,而以0.4ml 0.1mol/L pH 7.5磷酸缓冲液代替〕,在25℃水浴中保温30min.保温结束后立即加入1ml 磺胺溶液终止酶反应,再加1ml 0.2％a-萘胺溶液,显色反应15min后于4000r/min下离心5min,取上清液在540nm下比色测定吸光度.根据回归方程计算.。
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各种酶活性测定方法第一超氧化物歧化酶SOD测定一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD 可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。
（三）试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100μmo l/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA －Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。
三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。
取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。
3. SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。
四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD 活性。
SOD总活性＝(A ck－A E)×V/(A ck×0.5×W×V t)上式中，SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重。
SOD、POD、CAT、MDA的测定方法-非试剂盒法缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液1. SOD的测定方法加样顺序：（V=3ml）磷酸缓冲液：1.5ml L-Met: 0.3ml NBT: 0.3mlEDTA-Na2: 0.3ml 核黄素：0.3ml 酶液：0.05ml 蒸馏水：0.25ml试剂配制：(1) 0.05mol/L PBS：pH7.8(2) 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml(3) 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml(避光保存)(4) 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml(5) 20umol/L核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml(避光保存)注：（1）对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管(2) 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值2.MDA的测定方法试剂配制：（1）5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml（2）0.5% TBA：2.5g用TCA定容至500ml方法：酶液1ml—3ml0.5%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却，10000r/min 离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值3.POD的测定方法试剂配制：（1）0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液A(0.2mmol/L的HAc溶液)—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中B(0.2mmol/L的NaAc溶液)—13.6gNaAc.3H2O（2）0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中（临用前配制）（3）0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml（临用前配制）方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml 0.25%愈创木酚溶液—xml酶液（5min值为500-800即可）—0.1ml 0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min4.CAT的测定方法试剂配制：(1) 50mmol/L的PBS（pH7.0） (2) 0.3% H2O2—1ml H2O2定容至100ml方法：(1)以不加H2O2的50mmol/L的PBS（pH7.0）为空白把A240调零(2)50ul酶液—3ml 50mmol/L的PBS（pH7.0）—0.2ml 0.3% H2O2—迅速颠倒混匀，开始计时—1min后在240nm下比色，1次/1min(连续读取5min)。
2010年06月22日星期二 19:331 叶绿素含量测定：80％的丙酮液的配制：4L丙酮+ 1L蒸馏水。
称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做三个重复），加入25ml浓度为80％的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36小时后取出，稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm 下测定光密度，以80％的丙酮液为空白。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35～36）也可用95%乙醇溶液，在665、649、470nm处有最大吸收峰Ca=13.95D665-6.8649Cb=24.96D649-7.32D665Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/2452 抗氧化酶活性的定：（2.5g样）0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285g NaH2PO4·2H2O, 定容到4L。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134）。
取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L 磷酸缓冲溶液（pH=7.8）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。
2.1丙二醛（MDA）的测定：20％三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称200g三氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）；0.5% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸（TBA）,用20％三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容到1000ml。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）（先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解）；0.5ml酶液（对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液）（做三个重复）+ 3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min――冷却（至少30min）――比色（OD600、OD532、OD450）。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P124）2.2超氧化物歧化酶（SOD）的测定：NBT(400ml)混合反应液:392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液（100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素）。
（另配）100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na测试时：取3ml反应液+0.05ml(根)或0.02 ml(叶)粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定吸光度。
2.3过氧化物酶（POD）的测定：0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.0）溶液的配制：10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975g NaH2PO4·2H2O,定容到1000ml。
0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。
0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。
2ml 0.3%H2O2溶液+ 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液+ 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS) + 0.02ml？？（原来为0.01）酶液（根加0.05ml酶液）（对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液）（做三个重复），记录470nm处OD降低速度。
将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121）比色时加酶液，混合后即刻计时。
2.4 脯氨酸的测定标准曲线的制作：编号1234567标准脯氨酸的量（ml）0.10.20.40.60.81.0H2O（ml）1.00.90.80.60.40.2冰乙酸（ml）2222222显色液（ml）3333333脯氨酸含量（µl）12468100.5ml酶液（对照用0.5ml 80％乙醇代替）（做三个重复）+ 1ml冰乙酸+ 1.5ml显色液―――混匀，沸水浴15min，冷却后测OD520。
2.5可溶性蛋白的测定（参考赵志杰，史国安，董新纯编的《植物生理学实验指导》）牛血清白蛋白：配成100µg/ml和1000µg/ml。