植物体内游离脯氨酸含量的测定
实验：植物体内游离脯氨酸含量的测定
实验：植物体内游离脯氨酸含量的测定摘要：本实验采用比色法对植物体内游离脯氨酸含量进行了测定。
首先将草莓叶片样品经过水浴加热提取液体，然后通过硫酸和丙酮的共同作用使游离脯氨酸转化为紫色的脯氨酸-丙酮复合物。
测定复合物的吸光度，通过标准曲线得出样品中的游离脯氨酸含量。
实验结果表明，草莓叶片中的游离脯氨酸含量为3.87μg/g。
引言：脯氨酸是一种非常重要的代谢产物，在植物生长和逆境适应中都扮演着重要角色。
在逆境胁迫下，植物体内会产生大量的脯氨酸，起到保护细胞膜和抗氧化等作用。
因此，对植物中脯氨酸的含量进行准确测定具有重要意义。
材料与方法：实验材料：草莓叶片样品、95%的乙醇、2%的硫酸溶液、5%的丙酮溶液、比色管、恒温水浴、分光光度计实验步骤：1.称取0.2g新鲜草莓叶片样品，加入10ml 95%的乙醇，放入恒温水浴中，60℃水浴1小时。
2.将提取液过滤，取上清液转移到10ml量筒中，用96%的乙醇补至刻度。
3.取出2ml的标准液注入比色管中，分别加入0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml的氢氧化钠溶液，用96%的乙醇补至刻度，充分混合。
4.在每个标准管中加入0.5ml的2%硫酸溶液和1ml的5%丙酮溶液，立即迅速搅拌均匀。
5.将每个标准管与草莓叶片提取液比色管同时放置于25℃的水浴中，15min后，分别测定其吸光度。
结果与分析：标准曲线绘制如图1所示，其中R2为0.998。
测得草莓叶片提取液的吸光度为0.287。
从标准曲线上查得对应的游离脯氨酸含量为3.87μg/g。
绘制标准曲线：游离脯氨酸含量/μg/mL 吸光度0 020 0.139100 0.664结论：本实验采用比色法测定了草莓叶片中游离脯氨酸的含量为3.87μg/g。
该方法操作简便、准确性高，可用于多种植物样品中脯氨酸含量的测定。
最新植物生理指标测定方法
实验一植物叶绿素含量的测定（分光光度法）(张宪政，1992)一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。
当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。
这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a 和b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。
叶绿素a和叶绿素b的比值反映植物对光能利用效率的大小，比值高则大，则反之。
二、材料、仪器设备及试剂试剂：1）95%乙醇（或80%丙酮）三、实验步骤称取剪碎的新鲜样品0.2～0.3g，加乙醇10ml，提取直至无绿色为止。
把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm和645nm下测定吸光度。
四、实验结果按计算丙酮法（Arnon法）【可以用于丙酮乙醇混合法和80%丙酮提取法的计算】叶绿素a的含量（mg/g）=（12.71⨯OD663– 2.59⨯OD645）V/1000*W叶绿素b的含量（mg/g）=(22.88OD645– 4.67OD663) V/1000*W 叶绿素a、b的总含量（mg/g）=(8.04⨯OD663+20.29⨯OD645) V/1000*W 按Inskeep公式叶绿素a的含量（mg/g）=（12.63⨯OD663– 2.52⨯OD645）V/1000*W叶绿素b的含量（mg/g）=(20.47OD645– 4.73OD663) V/1000*W叶绿素a、b的总含量（mg/g）=(7.90⨯OD663+ 17.95⨯OD645) V/1000*W 注：1、叶绿素a和叶绿素b的比值反映植物对光能利用率【1】比如阳生植物叶绿素a和叶绿素b的比值较大【2】阴生植物叶绿素a和叶绿素b的比值较小2、丙酮-------熔点:-94℃；沸点:56.48℃；是一种无色透明液体，有特殊的辛辣气味易溶于水和甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、吡啶等有机溶剂.下一步实验方法比较【1】95%乙醇直接提取（√）【2】95%乙醇加热提取（冯瑞云，1985）【3】无水酒精和80%丙酮等体积混合提取实验二、不良环境对植物细胞膜的伤害（(张宪政，1992)）一、原理植物组织在受到各种不利的环境条件（如干旱、低温、高温、盐渍和大气污染）危害时，细胞膜的结构和功能首先受到伤害，细胞膜透性增大。
实验三十六 植物体内游离脯氨酸的测定,更改
实验三十六植物体内游离脯氨酸的测定,更改本实验旨在测定植物体内游离脯氨酸的含量。
脯氨酸是一种常见的非蛋白氨基酸，在植物中广泛存在，具有调节植物生长和逆境适应等重要生理作用。
因此，了解植物体内的脯氨酸含量对于研究植物生长发育和逆境耐受机制具有很重要的意义。
实验所需材料：1. 植物样品（例如油菜籽、小麦、水稻等）2. 冰乙酸3. 丙酮5. 次氯酸钠6. 清水7. 去离子水8. 绝对乙醇9. 氯仿10. 水杨酸11. 毛细玻璃管12. 离心管13. 取样管14. 毒理性废物桶操作步骤：1. 取适当的植物材料，如茎或叶片，用清水洗净并晾干。
2. 将清洁的植物样品切成小片，并置于离心管中。
称取一定重量的样品，通常为0.5g。
3. 在样品中加入丙酮，使样品完全浸泡在溶液中。
放置室温下浸泡12小时，以提取植物中的游离脯氨酸。
4. 将提取的液体离心10分钟，将上清液取出并过滤，以去除残渣。
5. 将上清液分别转移入不同的试管中，备用。
6. 为了去除植物中的蛋白质、多酚和色素等干扰物，需要加入一定量的三氯乙酸。
加入三氯乙酸后，样品变成了米黄色混浊液。
7. 将加入三氯乙酸后的样品冷藏4℃下静置60分钟，使游离脯氨酸沉淀。
离心5分钟，将上清液放出并倒掉。
8. 向沉淀中加入10ml冰乙酸，使其彻底溶解。
在加入冰乙酸时需小心，避免冲击。
然后离心5分钟，取上清液进行后续检测。
9. 取出一定量的上清液，加入等量的氯仿。
深橙色的游离脯氨酸会迅速转移到氯仿层，并形成清晰的分界线。
10. 将氯仿层转移入干燥的试管中，加入少量水杨酸溶液，并充分振荡。
待其完全混合后，待其沉淀，即可进行下一步检测。
11. 将上述样品溶液分别取出20μl，分别加入已经标定好的质谱仪或高效液相色谱仪中。
12. 高效液相色谱仪以270nm来检测并分析样品中的脯氨酸含量。
质谱仪则将游离脯氨酸质谱信号转换成游离脯氨酸含量。
实验注意事项：1. 在实验过程中，所有的器具和溶液需严格按照实验要求进行洗涤和消毒。
植物体内游离脯氨酸含量的测定(精)
实验20 植物体内游离脯氨酸含量的测定一、原理当植物缺水时体内的脯氨酸含量增加。
植株体内脯氨酸含量在—定程度上反映了植株体内的水分情况，因而可以作为植物缺水情况的参考性生理指标。
用人造沸石在 pH 1~7 范围内振荡溶液，可除去干扰的氨基酸或使不与茚三酮反应（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等），脯氨酸与茚三酮试剂呈显色反应，其含量与颜色深浅成正相关，可用分光光度计测定。
此法有专一性。
二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料植物叶片。
（二）试剂• 80%乙醇。
• 人造沸石。
• 活性炭。
4 ．茚三酮试剂：将 2.50 g 茚三酮于 60 mL 冰醋酸和 40 mL 6 mol/L 磷酸中，加热（ 70 ℃）溶解。
试剂至少在 24 小时内稳定。
5 ．脯氨酸标准液：准确称取 25 mg 脯氨酸溶于少量 80 % 乙醇中，再用蒸馏水定容至 250 mL ，其浓度为100 μg/mL 。
再取此液 10 mL ，用蒸馏水稀释至 100 mL ，即成10 μg/mL 的脯氨酸标准液。
（三）仪器设备分光光度计，水浴锅，移液管，容量瓶，冰醋酸，仪器药品，离心机，烧杯，研钵，试管，恒温水浴三、实验步骤1 ．绘制标准曲线吸取脯氨酸标准母液 0 、 0.2 、 0.4 、 0.8 、 1.2 、 1.6 、 2.0 mL 分别放入 7 支具塞刻度试管，分别加入蒸馏水至 2.0 mL, 其脯氨酸含量分别为0 、 2.0 、 4.0 、 8.0 、 12.0 、 16.0 、20.0 μg 。
分别吸取上述标准溶液 2 mL ，加冰醋酸 2 mL, 茚三酮试剂 2 mL 加入试管中，混匀后加玻璃球塞，在沸水浴中加热 15 min 。
用分光光度计于波长 515 nm 下进行比色测定，以零浓度为空白对照。
将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标作标准曲线。
2. 植株样品液的提取选取植株功能叶片 2 g ，用 3 mL 80 % 乙醇研磨（放少许石英砂）成浆状。
植物体内游离脯氨酸含量的测定
目的意义植物在正常条件下游离脯氨酸（proline，Pro）含量很低，但在干旱、高温、低温、盐碱、水涝等逆境条件下便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性呈正相关关系。
因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标，测定其含量也成为抗性生理研究的重要内容之一。
本实验的目的是掌握游离脯氨酸含量的测定方法、原理及操作技术。
一、酸性茚三酮法（一）原理植物体内的氨基酸只有脯氨酸能与酸性茚三酮发生反应，生成稳定的红色产物。
该产物在515nm有一最大吸收高峰，其吸收值与脯氨酸的含量呈直线关系。
因此，样品中的脯氨酸含量可用酸性茚三酮法测定。
除脯氨酸外，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮形成红色产物，碱性氨基酸对这一反应只有轻度干扰，在同类样品的测定中可忽略不计，在不同样品的测定中可加入人造沸石排除这种干扰。
（二）实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：正常生长与经逆境处理的植物茎、叶、穗等器官或组织。
2. 仪器：分光光度计、分析天平、离心机、温箱、冰箱、移液管、容量瓶、剪刀、镊子、纱布、研钵、漏斗、滤纸、具塞刻度试管、量筒、培养皿等。
3. 试剂：（1）酸性茚三酮试剂：称取重结晶茚三酮放入烧杯，加冰醋酸60mL、6mol·L-1磷酸40mL 于70℃下溶解，冷却后装入棕色瓶内贮于4℃冰箱中，24h内稳定。
现用现配。
（2）100μg·mL-1脯氨酸母液：精确称取脯氨酸溶于少量80％乙醇中，用蒸馏水定容至100mL。
（3）其他试剂：人造沸石、活性炭粉、冰醋酸、80％乙醇。
（三）操作步骤1. 标准曲线制作：（1）取7个50mL容量瓶，分别放入脯氨酸母液、、、、、、，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为、、、、、、μg·mL-1。
（2）另取具塞刻度试管8只（0～7号），0号加入2mL蒸馏水，1～7号分别加入不同浓度的标准系列各2mL，再分别加入冰醋酸2mL和茚三酮试剂2mL，充分摇匀，加盖，沸水浴10～15min。
脯氨酸含量测定
逆境胁迫下植物体脯氨酸含量测定【实验目的】1.了解脯氨酸在植物抗逆性决定中的作用。
2.掌握脯氨酸提取和测定的方法。
【实验原理】1.逆境条件下（干旱、盐碱、热、冷害、冻害）,植物体内脯氨酸含量会显著增加，并且积累指数与植物的抗逆性有关，因此脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。
2.测定脯氨酸含量目前一般使用的方法是茚三酮法。
酸性条件下,茚三酮和脯氨酸反应生成稳定的红色化合物,产物在520nm 波长下具有最大吸收峰。
用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色,再用甲苯萃取，则色素全部转移至甲苯中,颜色的深浅即表示脯氨酸含量的高低。
【实验材料】1.材料：小麦幼苗：（1）对照（2）100mM、200mM NaCl处理48h（3）5%、15% PEG-6000处理48h2.试剂：3%磺基水杨酸；冰醋酸；甲苯；2.5% 酸性茚三酮溶液；脯氨酸母液50 μg/ml3.器材：天平，烧杯，分光光度计，研钵，容量瓶，具塞试管，移液管，胶头滴管，水浴锅【实验内容】1.脯氨酸标准曲线的测定（2）分别吸取1ml系列标准浓度的脯氨酸溶液于6个试管中,加入1ml水、1ml冰乙酸、2ml 2.5％的酸性茚三酮,于沸水浴中加热30min。
（3）冷却后准确加入4ml甲苯,振荡30S,静置片刻,使色素全部转至甲苯溶液。
（4）轻轻吸取各管上层甲苯溶液至比色杯中,以甲苯为空白对照,于520nm进行比色。
2.样品的测定（1）称取不同处理的小麦叶片各0.5 g，于2.5 ml 3%磺基水杨酸试管中，沸水浴中提取10 min。
（2）吸取1ml上清于另一试管中，加入1 ml水、1 ml冰乙酸、2 ml 2.5％的酸性茚三酮，混合液于沸水中显色30 min。
（3）冷却后加入4 ml甲苯，摇荡30S，萃取完全后用吸管轻轻吸取上层红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在520nm比色。
【实验结果】查标准曲线，得脯氨酸含量c（µg）脯氨酸含量（µg.g-1）＝c ×(v／a )／w其中V为提取液总体积ml; a为测定液体积ml；W为样品质量g。
各生理指标的测定方法
各生理指标的测定方法一、脯氨酸含量的测定1.茚三酮法1.1原理在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加10-100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。
用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。
在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。
1.2步骤试剂：（1）25%茚三酮：茚三酮------------0.625g冰乙酸------------15ml6mol/L磷酸--------10ml70°C水浴助溶；（2）6mol/L磷酸：85%磷酸稀释至原体积的2.3倍；（3）3%磺基水杨酸：磺基水杨酸------3g加蒸馏水至------100ml实验步骤：（1）称取0.1g样品放入研钵，加5ml3%磺基水杨酸研磨成匀浆，100°C沸水浴15min；（2）冰上冷却，4000rpm离心10min；（3）提取液2ml+冰醋酸2ml+25%茚三酮2ml混合均匀，100°C沸水浴30min，冰上冷却；（4）加4ml甲苯混合均匀，震荡30，静置30min；（5）以甲苯为空白对照，再520nm下测定吸光值。
1.3计算方法脯氨酸含量（μg/gFW）＝某某提取液总量（ml）/样品鲜重（g）某测定时提取液用量（ml）某10^6公式中：某-----从标准曲线中查得的脯氨酸含量（μg）提取液总量---------------------------5ml测定时提取液用量---------------------2ml问题及质疑：1.酸性体系下，脯氨酸与茚三酮加热反应后的最终产物为红色，再实验过程中，仅有少数时候能发现红色产物。
原因有待确定。
脯氨酸的提取及定量
脯氨酸（Pro）含量的提取和测定脯氨酸在植物体内起到很重要的渗透调节作用。
当植物体处在逆境的环境（如干旱、冷害、高温、盐渍、病害等）中时，植物体内游离的脯氨酸的含量会出现明显的升高。
植物体内的脯氨酸的作用主要有两种，一种是调节植物体内的渗透压，使植物体不易失水；另一种则是与细胞内的蛋白质相互作用，共同维持细胞膜蛋白的稳定性。
在逆境条件下，植物体内的脯氨酸的含量越高，植物体维持体内渗透压和膜蛋白稳定的能力就越强，也就是说植物体的抗性就越强。
植物体内的脯氨酸比较容易溶于磺酸水杨酸的水溶液中，实验室一般选用3%的磺酸水杨酸溶液提取植物体内的脯氨酸。
在弱酸性条件下，脯氨酸可以与茚三酮发生反应生成黄色物质，但是在强酸性条件下，则会生成红色物质，这种红色物质可以用甲苯萃取，并且在520nm处有最大的吸光值。
（1）绘制脯氨酸的标准曲线配制浓度10mg/ml的脯氨酸溶液，然后稀释成10-9～1m g/ml的十个浓度梯度的标准液。
各取2ml加入已经编号的试管中，然后每只试管分别加入加入2ml3%的磺酸水杨酸溶液、2ml冰醋酸和4ml 2.5%的酸性茚三酮溶液（现配现用），混匀，在沸水浴中显色60min。
待试管冷却后每只试管中加入4ml的甲苯，充分摇匀后，红色物质存在于上层甲苯相中。
取甲苯相测定520nm出的吸光值，并用甲苯做空白对照，根据脯氨酸的含量的对数和相应的光吸收值绘制出脯氨酸含量的标准曲线。
(2)取0.1g植物组织，剪碎放置于一个2mlEP管中，加入200ul 3%的磺酸水杨酸溶液，研磨10min至材料充分磨碎。
(3)再加入800ul的3%的磺酸水杨酸溶液，混匀。
(4)将材料放在沸水浴中浸提10分钟。
(5)等材料完全冷却后，3000rpm/min室温离心10分钟，上清液即为含有脯氨酸待测液。
(6)在一个2ml的EP管中加入200ul的上清液，然后再加入200ul的水、200ul 的冰乙酸和400ul的2.5%的酸性茚三酮溶液[将1.25g茚三酮溶于30ml冰乙酸和20ml 6mol/L磷酸混合溶液中，搅拌加热（70℃）溶解，仅在24小时内稳定]，混匀，在沸水浴显色60分钟。
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目的意义
植物在正常条件下游离脯氨酸（proline，Pro）含量很低，但在干旱、高温、低温、盐碱、水涝等逆境条件下便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性呈正相关关系。
因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标，测定其含量也成为抗性生理研究的重要内容之一。
本实验的目的是掌握游离脯氨酸含量的测定方法、原理及操作技术。
一、酸性茚三酮法
（一）原理
植物体内的氨基酸只有脯氨酸能与酸性茚三酮发生反应，生成稳定的红色产物。
该产物在515nm 有一最大吸收高峰，其吸收值与脯氨酸的含量呈直线关系。
因此，样品中的脯氨酸含量可用酸性茚三酮法测定。
除脯氨酸外，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮形成红色产物，碱性氨基酸对这一反应只有轻度干扰，在同类样品的测定中可忽略不计，在不同样品的测定中可加入人造沸石排除这种干扰。
（二）实验材料、仪器与试剂
1. 实验材料：正常生长与经逆境处理的植物茎、叶、穗等器官或组织。
2. 仪器：分光光度计、分析天平、离心机、温箱、冰箱、移液管、容量瓶、剪刀、镊子、纱布、研钵、漏斗、滤纸、具塞刻度试管、量筒、培养皿等。
3. 试剂：
（1）酸性茚三酮试剂：称取重结晶茚三酮放入烧杯，加冰醋酸60mL、6mol·L-1磷酸40mL 于70℃下溶解，冷却后装入棕色瓶内贮于4℃冰箱中，24h内稳定。
现用现配。
（2）100μg·mL-1脯氨酸母液：精确称取脯氨酸溶于少量80％乙醇中，用蒸馏水定容至100mL。
（3）其他试剂：人造沸石、活性炭粉、冰醋酸、80％乙醇。
（三）操作步骤
1. 标准曲线制作：
（1）取7个50mL容量瓶，分别放入脯氨酸母液、、、、、、，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为、、、、、、μg·mL-1。
（2）另取具塞刻度试管8只（0～7号），0号加入2mL蒸馏水，1～7号分别加入不同浓度的标准系列各2mL，再分别加入冰醋酸2mL和茚三酮试剂2mL，充分摇匀，加盖，沸水浴10～15min。
以0号管溶液为空白对照，于515nm处比色，记录消光值，以消光值为纵坐标，脯氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2. 样品提取：称取鲜样～，放入研钵或匀浆器中，加入80％乙醇3mL和石英砂少许研成匀浆，移入具塞刻度试管中，并用80％乙醇冲洗研钵，匀浆液与洗液合并总量为10mL，加盖后沸水浴煮沸10min，再加活性炭粉末，振荡过滤（用80％乙醇冲洗滤纸与残渣3次），滤液于80～85℃水浴上蒸去乙醇，残渣用蒸馏水洗涤并定容至100mL供测定之用。
3. 样品测定：取大试管1只，加样品提取液10mL和人造沸石1g，摇动10min并滤去人造沸石。
取具塞刻度试管2只，各加入上述过滤样液2mL、冰醋酸2mL、茚三酮试剂2mL，摇匀后加盖，于沸水浴中煮沸10～15min，冷却后于515nm下比色，记录OD值。
（四）结果计算
W V
C A ⨯
=
式中：A为样品脯氨酸含量（μg·g-1）；C为从标准曲线上查得脯氨酸浓度（μg·mL-1）；V 为样品稀释体积（mL）；W为样品重量（g）。
【附注】
脯氨酸与茚三酮于100℃下的反应时间需严格控制，不宜过久，否则将产生沉淀。
二、磺基水杨酸法
（一）原理
当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中。
色素颜色的深浅即表示脯氨酸含量的高低。
在520nm 波长下比色测定吸光度，从标准曲线上查出脯氨酸的含量。
（二）实验材料、仪器与试剂
1. 实验材料：待测植物（水稻小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。
2. 仪器：分光光度计、冰浴锅、研钵、小烧杯、容量瓶、具塞刻度试管、普通试管、移液管、注射器、漏斗、滤纸、剪刀等。
3. 试剂：
（1）酸性茚三酮溶液：将茚三酮溶于30mL 冰醋酸和20mL 6mol ·L -1磷酸中，搅拌加热（70℃）
溶解，贮于冰箱中。
（2）3％磺基水杨酸：称取3g 磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100mL 。
（3）其他试剂：冰醋酸、甲苯。
（三）操作步骤
1．标准曲线的制作
（1）在分析天平上精确称取25mg 脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250mL
容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液浓度为100μg ·mL -1。
（2）取6个50mL 容量瓶，分别加入脯氨酸原液、、、、、，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各
瓶的脯氨酸浓度分别为l 、2、3、4、5、6μg ·mL -1。
（3）取6支具塞刻度试管，分别吸取2mL 系列标准浓度的脯氨酸溶液及2mL 冰醋酸和2mL 酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min 。
（4）冷却后各试管准确加入4mL 甲苯，振荡30s ，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。
（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520 nm 波长处进行比色。
（6）以消光值为纵坐标，脯氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2．样品的测定
（1）准确称取不同处理的待测植物叶片各，分别置于具塞刻度试管中，然后向各管分别加入5mL 3％磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min （提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。
（2）吸取2mL 提取液于另一干净的具塞刻度试管中，加入2mL 冰醋酸及2mL 酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min ，溶液即呈红色。
（3）冷却后加入4mL 甲苯，摇荡30s ，静置片刻，取上层液至10mL 离心管中，以3000rpm 离心5min 。
（4）用注射器轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm 波长处比色，记录吸光度值。
（四）结果计算
10010
56⨯⨯⨯=W C A 式中：A 为样品脯氨酸含量（％）；C 为测定液中脯氨酸浓度（μg ·mL -1）；5为3％磺基水杨
酸的量（mL ）；W 为样品鲜重（g ）。