脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)
氨基酸含量测定
茚三酮比色测定氨基酸含量 一、实验原理 氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色或黄色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。生成的蓝紫色或黄色化合物颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长分别为570nm或350nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。 二、实验试剂 （1）1.2%茚三酮溶液：称取茚三酮1g于盛有35mL热水的烧杯中使其溶解，加入40mg氯化亚锡（SnCl2?H2O），搅拌过滤（作防腐剂）。滤液置冷暗处过夜，加水至50mL，摇匀备用。 （2）pH 8.04磷酸缓冲液： Ⅰ、准确称取磷酸二氢钾（KH2PO4）4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。 Ⅱ、准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀备用。 Ⅲ、取上述配好的磷酸二氢钾溶液10.0mL与190mL磷酸氢二钠溶液混合均匀即为pH8.04的磷酸缓冲溶液。 （3）氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀，准确吸取此液10.0mL于100mL容量瓶中，加水到标线，摇匀，此为200μg/mL 氨基酸标准溶液。 三、实验方法及步骤 （1）标准曲线绘制 准确吸取200μg/mL的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL （相当于0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为 4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各1mL，混合均匀，于90℃水浴上加热至显色恒定为止（该加热过程至少需要25分钟），取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置15min后，若生成蓝紫色化合物，在570nm波长下，以试剂空白为
茚三酮 显色剂
茚三酮 中文名称：苯并戊三酮，茚三酮 英文名称：Ninhydrin 分子量：160.13 CAS RN：485-47-2 熔点：251℃ 密度: 0.86 性状：本试剂近似为白色结晶,或浅黄色结晶粉末,微溶于乙醚及三氯甲烷,100℃以上变为红色。 特性反应：跟酶类或者多肽在加热状况下发生显紫色反应。 作用 茚三酮是一个有机化合物，被广泛用于检测氨、一级和二级胺，尤其是氨基酸。氨基酸与茚三酮水合物在弱酸条件下共加热时，氨基酸被氧化脱氨、脱羧，而茚三酮水合物被还原，其还原物可与氨基酸加热分解产生的氨结合，再与另一分子茚三酮缩合成为蓝紫色化合物，称为罗曼紫（Ruhemann's purple）。此化合物最大吸收峰在570nm波长处。由于此吸收峰的大小与氨基酸释放的氨量成正比，因此可作为氨基酸的定量分析方法法医学上这个反应被用于鉴定指纹。 茚三酮反应（Kaiser鉴定）也可用来在固相接肽时检验脱保护基是否已经完成，鉴定和比色法分离氨基酸以及鉴定铵离子（呈紫色）。 茚三酮与氨基酸反应生成蓝紫色化合物，但pro，羟-pro反应时呈黄色。 茚三酮用于脯氨酸含量的测定 当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸的含量的高低。在520nm 的波长下比色，从标准曲线（用脯氨酸标准溶液制得）上查出(或用回归方程计算)脯氨酸的含量。 ①茚三酮
检出物：氨基酸、胺与氨基糖类。 溶液：本品O.2g溶于乙醇l00ml中。 方法：喷后于110oC加热。 结果：呈红紫色斑点。 茚三酮对一级二级的胺显色肯定没问题的，三级胺有些可以，酰胺应该也没问题的，配制：1.5g 茚三酮 + 100mL of 正丁醇+ 3.0mL 醋酸；显色的时候板子浸湿，用纸擦一下多余液滴，再用电热枪（电吹风太弱了）吹出斑点，显色因为氨基酸的不同而显示不同的紫色黄色等等，你想检测伯胺的话，肯定没有问题的！ 配制方法：1.5g 茚三酮+ 100mL of 正丁醇+ 3.0mL 醋酸 茚三酮不是太好溶解，需要多搅拌才行。 加醋酸只是给显色提供一个微酸性的环境。 配置好的茚三酮显色剂装在棕色瓶中避光保存，是可以多次使用的。
游离氨基酸
总游离氨基酸测定（完整版） 实验原理：游离氨基酸的游离氨基可与水合茚三酮作用，产生蓝紫色的化合物二酮茚－二酮茚胺，产物的颜色深浅与游离氨基酸含量成正比，用分光光度计在570nm下测其含量。因蛋白质中的游离氨基酸也会产生同样反应，在测定前必须用蛋白质沉淀剂将其除掉. 仪器与用具：100ml容量瓶；漏斗；三角瓶研钵；刻度吸管：0.1ml×1、1ml×2、2ml×2、5ml×1;沸水浴；具塞刻度试管20ml×10;分光光度计. 一、试剂 1.水合茚三铜：称重结晶的茚三铜0.6g,装入烧杯，加入正丙醇15ml，使其溶解加入正丁醇30 ml、乙二醇60 ml、乙酸-乙酸钠缓冲液（pH=5.4）9 ml,混匀，棕色瓶冰箱保存，10天内有效。 2.乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.4）：称取化学纯乙酸钠54.4g，加入无氨蒸馏水100 ml，电炉加热至沸，使其体积减半，冷却后加冰乙酸30 ml，加蒸馏水定容至100 ml。 0.2M 醋酸：11.55ml 冰醋酸定容至1000ml。 0.2M 醋酸钠：16.4g 无水醋酸钠或27.2g 醋酸钠.3H2O溶于1000ml水中。 0.2M 醋酸6.8ml 0.2M 醋酸钠43.2ml，混匀，如果有PH计，可以测一下（基本差不多），如果高了点，可以加一点0.2M 醋酸，低了，再加一点醋酸钠，最终浓度为0.2M。如果要别的浓度，可以稀释。 3.氨基酸标准溶液：精确称取80℃烘干至恒重的亮氨酸0.0234g溶于10％异丙醇并定容至50ml。取此液5ml蒸馏水稀释到50ml，即为5μg/ml 氨基酸标液。
4.0.1%抗坏血酸：称取0.050g抗坏血酸，溶于50 ml蒸馏水中，即配即用。 5.10％乙酸 二、标准曲线制备 度为纵坐标，氨基氮ug数为横坐标，绘标准曲线 三、实验步骤： 1. 烟末0.5g于研钵中加入5 ml10%乙酸，研磨匀浆后用蒸馏水定容100 ml，用滤纸过滤到三角瓶中备用。 2. 1ml滤液加入到20ml 干燥试管中，加1 ml蒸馏水，水合茚三铜3ml, 0.1%抗坏血酸0.1ml, 加塞子密封于沸水中加热15分钟，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动使加热时形成的红色被空气逐渐氧化褪去，待呈现兰紫色时，用60％乙醇定容至20ml，摇匀于570nm波长下比色。 四. 计算： 求三重复的平均值，由标准曲线得知各样的氨基酸ug数，代入公式计算。氨基酸含量（mg/g干样）=｛氨基酸ug数×（提取液总体积/测定体积）｝/（样品g数×1000）
氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)
茚三酮比色法测定游离氨基酸含量 原理： 茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳?氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比? 磷酸缓冲液（pH.8.04）： 称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。 称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。 取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液 2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。储成于棕色瓶中，避光保存。 0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。 茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。 亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。 茚三酮标准曲线制作 溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的 氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml 亮氨酸
超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线 取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示 300 400 500 600 700 800 0.0 0.10.20.30.40.5 0.60.7吸光度 波长（nm ） 403 nm 565 nm 选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 50 0.621
氨基酸检测试剂盒(茚三酮比色法)
氨基酸(AA)检测试剂盒(茚三酮比色法) 简介： 氨基酸(Amino acid ，AA)是组成蛋白质的基本单位，也是蛋白质的分解产物。动物肝脏、肾脏是氨基酸代谢的主要器官，氨基酸(AA)检测试剂盒(茚三酮比色法)(Amino Acid Assay kit)检测原理是在弱酸条件下，氨基酸与茚三酮共热情况下，能定量的产生蓝紫色的二酮茚胺(又称Ruhemans 紫)，其吸收峰在波长570nm 处，在一定范围内颜色深浅(即吸光度)与氨基酸浓度成正比。该试剂盒主要用于检测血清、尿液、植物组织、食品、药品等中的总游离氨基酸含量。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 准备样品： ①植物样品：取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取，按植物组织：AA Lysis buffer=的比例加入AA Lysis buffer 匀浆或研磨，用去离子水稀释至，混匀，用滤纸过滤，滤液即为氨基酸粗提液，4℃保存备用。 ②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，-20℃冻存，用于氨基酸的检测。 ③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用AA Lysis buffer 进行适当匀浆，离心5min ，留取上清即为氨基酸粗提液，4℃保存备用，用于氨基酸的检测。 ④高活性样品：如果样品中含有较高浓度的氨基酸，可以使用AA Lysis buffer 进行恰当的稀释。 2、 配制茚三酮工作液: 取适量的茚三酮显色液、AAAssaybuffer ，按茚三酮显色液： AAAssaybuffer=的比例混合，即为茚三酮工作液。4℃避光密闭保存，2周有效。 3、 配制维生素C 工作液: 取出1支维生素C ，准确溶解于10ml 去离子水，混匀。4℃预 冷备用。-20℃保存1周有效。注意：该试剂盒提供的维生素C 及其配制的工作液为过 编号 名称 TC2153 100T Storage 试剂(A): 氨基酸标准(50μg/ml) 1ml 4℃ 试剂(B): AALysisbuffer 250ml RT 试剂(C): 茚三酮显色液 120ml RT 避光 试剂(D):AAAssaybuffer 10.5ml RT 试剂(E): 维生素C 2支 RT 使用说明书 1份
游离氨基酸的测定实验报告
游离氨基酸的测定实验方案 （茚三酮比色法） 一、实验目的 茚三酮比色法测定发酵液中游离氨基酸含量，利用氨基酸含量这个参数，控制发酵过程。 二、实验原理 游离氨基酸的游离氨基可与水合茚三酮作用，产生蓝紫色的化台物二酮茚一二酮茚胺，产物的颜色深浅与游离氨基酸含量成正比，用分光光度计在570nm 下测其含量。因蛋白质中的游离氨基酸也会产生同样反应，在测定前必须用蛋白质沉淀剂将其除掉。 三、实验材料 发酵液样品； 实验试剂：水合茚三酮；氨基酸标准液；0.1%抗坏血酸 实验仪器：100ml容量瓶；漏斗；三角瓶；研钵；移液器；枪头；沸水浴；具塞刻度试管20 ml×10；分光光度计 四、实验方法 1.溶液配制 （1）水合茚三酮称取0.6g重结晶的茚三酮放烧杯中，加入15ml 正丙醇、30ml正丁醇、60ml乙二醇及9 ml PH4.54的醋酸盐缓冲液混匀，棕色瓶中冰箱内保存，10天内有效。 （2）氨基酸标准液称取80℃烘干的亮氨酸23.4mg，以10%的异丙醇溶解定溶至50ml（含氮为50ug/ ml），取此液5ml，用水定容至50 ml，此为含氮量5ug/ ml工作液。 （3）0.1%抗坏血酸称取0.1g抗坏血酸定容100 ml，随用随配。
2.标准曲线绘制 取6支20ml 试管，按下表加剂： 试剂 管号 1 2 3 4 5 6 亮氨酸标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 无氨蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 水合茚三酮(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 抗坏血酸(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 氨基氮量（ug/管 ） 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 将各管溶液混合均匀，封口，在沸水中加热15min ，取出后立即用冷水摇 动冷却，用60%乙醇定容至20 ml ，摇匀。 λ=570nm 处测定吸 光度 0 0.025 0.055 0.099 0.146 0.186 以吸光度为纵坐标，氨基氨ug 数为横坐标，绘标准曲线如图： 茚三酮比色法测定游离氨基氮标准曲线 y = 0.0382x - 0.0103 R 2 = 0.9882 -0.05 00.05 0.10.15 0.20123456 氨基氮（ug） 吸光度A 3.样品中游离氨基酸的测定 取20ml 试管，取待测液1ml ，加蒸馏水l ml ，水合茚三酮3.0 ml ，坏血酸0.1ml ，混匀，封口。沸水浴加热1 5分钟，冷水中摇动冷却，用 60%乙醇定溶至20ml ，摇匀，于570mn 测定吸光度。
中药有效成分的提取方法包括
中药有效成分的提取方法包括： 1.溶剂提取法：选择一个适当的溶剂将中药里面的有效成分提取出来。 （1）常用提取溶剂：石油醚、正己烷、环己烷、苯、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇、水。（极性小→极性大） （2）提取溶剂的特殊性质：石油醚：是混合型的物质；氯仿：比重大于水；乙醚：沸点很低；正丁醇：沸点大于水。 ①亲脂型溶剂与亲水型溶剂：石油醚、正己烷、环己烷、苯、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇与水混合之后会分层，称为亲脂型溶剂；丙酮、乙醇、甲醇与水混合之后不分层，称为亲水型溶剂。 ②不同溶剂的符号 （3）选择溶剂：不同成分因为分子结构的差异，所表现出的极性不一样，在提取不同级性成分的时候，对溶剂的要求也不一样。 1）物质极性大小原则： ①含C越多，极性越小；含O越多，极性越大。 ②在含O的化合物中，极性的大小与含O的官能团有关：含O官能团所表现出的极性越大，此化合物的极性越大。 ③与存在状态有关：游离型极性小；解离型（结合型）极性大。 2）选择溶剂原则：相似相溶医学教|育网搜集整理。 （4）提取方法： 1）浸渍法：不用加热，适用于热不稳定化学成分，或含有大量淀粉、树胶、果胶、黏液质的成分提取。缺点：效率低、时间长。 2）渗漉法：不用加热，缺点：溶剂消耗量大、时间长 3）煎煮法：使用溶剂为水，适用于热稳定的药材的提取。缺点：不是用于含有挥发性或淀粉较多的成分的提取；不能使用有机溶剂提取。 4）回流提取法与连续回流提取法：使用溶剂为有机溶剂。 回流提取法有机溶剂消耗量大；连续回流提取法溶剂消耗量少，节省了溶剂，缺点：加热时间长，对热不稳定的成分在使用此法时要十分小心。 5）超声波提取法：提取效率高；对有效成分结构破坏比较小。 6）超临界流体萃取法：CO2萃取。特点： ①不残留有机溶剂，萃取速度快、收率高，工艺流程简单、操作方便。 ②无传统溶剂法提取的易燃易爆危险；减少环境污染，无公害；产品是纯天然的。 ③因萃取温度低，适用于对热不稳定物质的提取。 ④萃取介质的溶解特性容易改变，在一定温度下只需改变其压力。 ⑤可加入夹带剂，改变萃取介质的极性来提取极性物质。 ⑥适于极性较大和分子量较大物质的萃取。 ⑦萃取介质可以循环利用，成本低。 ⑧可与其他色谱技术连用及IR、MS联用，高效快速的分析中药及其制剂中的有效成分。 2.非溶剂提取法 （1）水蒸气提取法：适用于具有挥发性的、能随水蒸气蒸馏而不被破坏，且难溶或不溶于水的成分的提取。 （2）升华法：具有升华性质的成分提取。 提取方法：溶剂法、水蒸气蒸馏法、升华法。溶剂法最为常用。
茚三酮比色法测定游离氨基氮
游离氨基酸的测定——茚三酮比色法标准曲线绘制 1. 实验原理 游离氨基酸的游离氨基可与水合茚三酮作用，产生蓝紫色的化台物二酮茚一二酮茚胺，产物的颜色深浅与游离氨基酸含量成正比，用分光光度计在570nm 下测其含量。因蛋白质中的游离氨基酸也会产生同样反应，在测定前必须用蛋白质沉淀剂将其除掉。 2. 仪器与用具 100ml容量瓶；漏斗；三角瓶；研钵；刻度吸管：0.1ml×1、1ml×2、2ml×2、5ml×l；沸水浴；具塞刻度试管20 ml×10；分光光度计 3. 试剂 3.1.1 水合茚三酮称取0.6g重结晶的茚三酮放烧杯中，加入15ml 正丙醇、30ml正丁醇、60ml乙二醇及9 ml PH 4.54的醋酸盐缓冲液混匀，棕色瓶中冰箱内保存，10天内有效。 3.1.2 氨基酸标准液称取80℃烘干的亮氨酸23.4mg，以10%的异丙醇溶解定溶至50ml （含氮为50ug/ ml），取此液5ml，用水定容至50 ml，此为含氮量5ug/ ml工作液。 3.1.3 0.1%抗坏血酸称取0.1g抗坏血酸定容100 ml，随用随配 4. 实验方法 取6支20ml试管，按下表加剂： 管号 试剂 1 2 3 4 5 6 亮氨酸标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 无氨蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 水合茚三酮(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 抗坏血酸(ml) 0.10.10.10.10.10.1氨基氮量（ug/管）0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 将各管溶液混合均匀，封口，在沸水中加热15min，取出后立即用冷水摇 动冷却，用60%乙醇定容至20 ml，摇匀。 0 0.025 0.055 0.099 0.146 0.186 λ=570nm处测定吸 光度
各种显色剂及配制方法和显色原理
各种显色剂及配制方法 1、碘： 广谱显色剂：不饱和或者芳香族化合物 配制方法 ：在100ml 广口瓶中，放入一张滤纸，少许碘粒。或者在瓶中，加入10g 碘粒，30g 硅胶 例如反应： Bu +CCl 3COCl Zn(Cu) 2、紫外灯： 含共厄基团的化合物，芳香化合物 HCO 3H +OH OCHO H SO O 3. 稀硫酸 糖类 4、氯化铁： 苯酚类化合物 配制方法 ：1% FeCl3 + 50% 乙醇水溶液. 苯酚会和氯化铁发生显色反应，原理如下用Ar-OH 表示苯酚,反应如下: 6Ar-OH + FeCl3 → [Fe(OAr)6]3- + 6H+ + 3Cl- 其中,[Fe(OAr)6]3-为紫色. OH F Br 2OH F Br CS 2 O F Br Me SO 5、桑色素(羟基黄酮) ： 广谱, 有荧光活性 配制方法 ：0.1% 桑色素+甲醇 6、茚三酮 ：一般显蓝色或紫色(脯氨酸、羟基脯氨酸生成黄色） 与半胱氨酸紫红色然后无色。 氨基酸 配制方法 ：1.5g 茚三酮 + 100mL of 正丁醇+ 3.0mL 醋酸
Q ：如何判断化合物B 的存在？ NH 2O OH (Boc)2O O OH A B 7、二硝基苯肼(DNP) ： 醛和酮 配制方法：12g 二硝基苯肼+ 60mL 浓硫酸 + 80mL 水 + 200mL 乙醇 NO 2 NHNH 2 NO 2 R 2 R 1 O NO 2 NHN 2R 12 8、香草醛(香兰素)： 广谱(甾体类)
配制方法 ：15g 香草醛 + 250mL 乙醇 +2.5mL 浓硫酸 HO O H O 香草醛 9、高锰酸钾： 含还原性基团化合物，比如羟基，氨基，醛 配制方法 ：1.5g KMnO4 + 10g K2CO3 + 1.25mL 10% NaOH + 200mL 水. 使用期 3个月 10、溴甲酚绿： 羧酸，pKa<=5.0 配制方法 ：在100ml 乙醇中，加入 0.04g 溴甲酚绿，缓慢滴加0.1M 的NaOH 水 溶液，刚好出现蓝色即至。 溴甲酚绿 溴甲酚绿是非水滴定中常用的酸碱指示剂（溶于无水乙醇中配制），在pH=3.8时呈黄色，pH=5.4时呈蓝绿色，pH=4.5时开始有颜色的明显变化 11、钼酸铈： 广谱 配制方法 ：235 mL 水 + 12 g 钼酸氨 + 0.5 g 钼酸铈氨 + 15 mL 浓硫酸 12、茴香醛(对甲氧基苯甲醛)1： 广谱 配制方法 ：135 乙醇 + 5 mL 浓硫酸 + 1.5 mL of 冰醋酸 + 3.7 mL 茴香醛，剧烈搅拌，使混合均匀. 13、茴香醛(对甲氧基苯甲醛)2： 萜烯，桉树脑(cineoles), withanolides, 出油柑碱(acronycine) 配制方法 ：茴香醛:HClO4:丙酮:水 (1:10:20:80) 14、磷钼酸(PMA)： 广谱 配制方法 ：10 g of 磷钼酸+100 mL 乙醇
各种显色剂及其配制方法
各种显色剂及其配制方法 来源:有机化学网作者:synthesis 碘： 不饱和或者芳香族化合物 配制方法 在100ml广口瓶中，放入一张滤纸，少许碘粒。 或者在瓶中，加入10g碘粒，30g硅胶 紫外灯 含共厄基团的化合物，芳香化合物 硫酸铈： 生物碱 配制方法 10%硫酸铈(IV)+15%硫酸的水溶液 氯化铁 苯酚类化合物 配制方法 1% FeCl3 + 50% 乙醇水溶液. 桑色素(羟基黄酮) 广谱, 有荧光活性 配制方法 0.1% 桑色素+甲醇 茚三酮 氨基酸 配制方法 1.5g 茚三酮+ 100mL of 正丁醇+ 3.0mL 醋酸 二硝基苯肼(DNP) 醛和酮 配制方法 12g二硝基苯肼+ 60mL 浓硫酸+ 80mL 水+ 200mL 乙醇 香草醛(香兰素) 广谱 配制方法 15g 香草醛+ 250mL 乙醇+2.5mL 浓硫酸 高锰酸钾 含还原性基团化合物，比如羟基，氨基，醛 配制方法 1.5g KMnO4 + 10g K2CO3 + 1.25mL 10% NaOH + 200mL 水. 使用期3个月 溴甲酚绿 羧酸，pKa<=5.0 配制方法 在100ml乙醇中，加入0.04g溴甲酚绿，缓慢滴加0.1M 的NaOH水溶液，刚好出现蓝色即至。 钼酸铈 广谱 配制方法 235 mL 水+ 12 g 钼酸氨+ 0.5 g 钼酸铈氨+ 15 mL 浓硫酸 茴香醛(对甲氧基苯甲醛)1 广谱 配制方法 135 乙醇+ 5 mL 浓硫酸+ 1.5 mL of 冰醋酸+ 3.7 mL 茴香醛，剧烈搅拌，使混合均匀. 茴香醛(对甲氧基苯甲醛)2 萜烯，桉树脑(cineoles), withanolides, 出油柑碱(acronycine) 配制方法 茴香醛:HClO4:丙酮:水(1:10:20:80) 磷钼酸(PMA) 广谱 配制方法 10 g of 磷钼酸+100 mL 乙醇 茚三酮适合含氮的（仲、伯）氮化合物。碘能使大多数化合物显色，尤其是含氮化合物（有些酰胺是不灵敏的）。浓硫酸或者乙醇-硫酸靠炭化发黑显色，电炉加热也是此原理。 高锰酸钾和磷钼酸铵是无机物溶液显色剂。以上是通用
茚三酮法测氨基酸
茚三酮法测氨基酸 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT
茚三酮显色法测定氨基酸的含量 一．原理：凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。 二．仪器：721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。 三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成L 溶液 （2），2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。用pH 检查校正。 （3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解
（4）60％乙醇。 （5）样品液：每毫升含～50μg 氨基酸。 茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～ 25mL 热蒸馏水中，加入活性炭，轻轻搅拌。加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。 还原型茚三酮按下法制备：称取茚三酮，用沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。 乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。 四、操作步骤 1．标准曲线的制作 分别取L 的标准氨基酸溶液0，，，，，于试管中，用水补足至1mL。各加入1mL ，2mol/L 醋酸缓冲液；再加入1mL 茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min 后，加入 3mL60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。 以OD570nm 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。
茚三酮比色法测定赖氨酸含量
茚三酮比色法测定赖氨酸含量 一. 目的 了解赖氨酸总含量的测定方法。 掌握用比色法测定谷物类样品中赖氨酸含量。 二. 原理 蛋白质中的赖氨酸残基上具有一个游离的e-NH2，它与茚三酮起颜色反应呈蓝紫色，在波长570nm处其颜色的深浅在一定范围内与赖氨酸残基的含量成线性关系。 亮氨酸与赖氨酸的碳原子数目相同，它仅有的一个氨基（a-NH2）相当于蛋白质中赖氨酸残基上的e-NH2，因而可以用亮氨酸标准液制作标准曲线来测定蛋白质中赖氨酸的含量。但计算浓度时必须乘上两种氨基酸的分子量之比（赖氨酸与亮氨酸分子量之比为1.11:1）。 式中W：样品质量 C ：样品中游离氨基酸的量，各种作物种子中游离氨基酸的含量大约是：玉米：0.01%，高粱：0.04%，水稻：0.01%，小麦：0.05% X ：从标准曲线查得的赖氨酸的质量 三. 实验材料及设备 1. 材料 玉米粉 2. 仪器 分光光度计分析天平恒温水浴 3. 器材 刻度试管：25mL×11 移液管：1mL×1 2mL×2 20mL×1 烧杯：250mL×2 50mL×1 滴管：2 洗耳球：2 滤纸：f11cm 研钵、漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1
四. 试剂的配制 1. 柠檬酸缓冲液（0.2mol/L，pH5.6）(参见附录二) 2. 茚三酮试剂 称3g茚三酮溶于100mL 95%乙醇中，溶解后加入160mg二氯化锡，搅拌溶解后加入100mL柠檬酸缓冲液中，搅匀备用。 3. 亮氨酸标准液（50mg/mL） 准确称取5mg亮氨酸，用蒸馏水稀释定容到100mL，则得浓度为50mg/mL的标准液。 五. 操作步骤 1. 样品液的制备 (1) 取材：称取烘干、粉碎（过80目筛）的玉米粉0.3g（油料种子须经脱脂处理）。 (2) 提取：将称取的样品放入试管，准确加入20mL蒸馏水，摇匀。读取样品悬液的总体积mL，置于80℃恒温水浴中提取20min。（可间歇摇动） (3) 定容：冷却后，用蒸馏水将试管中悬液定容至（2）中悬液总体积刻度 mL,，即最终样品液总定容体积仍为20mL，摇匀。 (4) 过滤：将提取液用滤纸过滤，收集滤液作为待测样(滤纸不能用蒸馏水湿润)。 2. 标准曲线制作及样品测定 取9支刻度试管，按下表所示顺序操作。 六. 结果处理 1. 由0～6号管的数据，以亮氨酸含量(mg)为横坐标，A570为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线；
烟草中游离氨基酸的测定
烟草中游离氨基酸的测定 王娟,张华,郭国宁,李琳 (湖北中烟工业有限责任公司技术中心,湖北武汉430051) 摘要 [目的]探讨用氨基酸自动分析仪建立一种测定烟草中游离氨基酸的方法。[方法]用氨基酸分析仪法测定烟叶中的游离氨基酸并对这些游离氨基酸分别定性定量检测。[结果]氨基酸分析仪法能够分离检测烟叶中的23种游离氨基酸(除了蛋氨酸),其回收率均在78.86%~101.46%,标准偏差均在8%以内,具有较好的重现性和回收率。最优的氨基酸提取方法是:样品过60目筛,用0.005mol/L 的盐酸超声萃取30m i n 。对不同的烟叶样品进行检测,发现不同种类烟叶所含有的氨基酸具有一定的规律性。烤烟和香料烟中所含的游离氨基酸以Pro 为主,而白肋烟以Asn 为主;只有白肋烟中含有氨基酸Tau ,而烤烟和香料烟里面几乎检测不到。[结论]氨基酸分析仪法是测定烟叶中游离氨基酸较好的方法。关键词 烟草;游离氨基酸;氨基酸分析仪 中图分类号 S572 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)26-11413-04 Detectio n of Free Amino Aci ds i n Tobacco WANG Juan et al (Ch i na Tobacco H ube i Industr i a lCo .lt d .R &D Center ,W uhan ,H ube i 430051)Abstract [Objecti ve]A method establi shed f or t he de t ecti on of free a m i no ac i ds i n t obacco usi ng a m i no aci d ana l yzer was discussed .[M e t hod]The free a m i no aci ds in tobacco were de t ected using t he a m i no aci d analyzer and t hese free a m i no aci dswere detected qualitati vel y and quantit a ti ve l y resp .[R es u lt ]23ki nds of free a m i no aci ds exceptm et hioni ne i n t obacco l eaves were separated and detected by the a m i no aci d anal y z er m et hod ,t he reproduci b ilit y were bet w een 78.86%and 101.46%,and the standard dev i ati on va l uesw ere bel ow 8%.The me t h od had better reproduc i bility and recovery .The optm i u m ex traction m et hod o f a m i no aci d w as as f o ll ows :t he sa mples w ere sieved by 60m e s hes trea t m ent and treated by u l trasonic extracti on w it h 0.005mo l/L hydroch l oride for 30m i n .The contents o f a m i no aci ds i n different varie ti es of tobacco leaves s ho w ed s ome l a w after t he det ecti ng tobacco sa mples .The f ree a m i no aci d cont a i ned i n flue cured tobacco and orient a l tobacco w asma i nl y pro li ne ,while t hat i n bur l ey tobacco was ma i nl y as paragine .The tauri ne was onl y cont a i ned i n burley tobacco and itw as nearl y not detected i n fl ue cured tobacco and orient a l tobacco .[Conc l usion]The a m i no aci d ana l yzerm et hod was t he bett er me t hod for detec ti ng t he free am i no aci ds i n t obacco l eaves .K ey words Tobacco ;F ree a m i no ac i d ;Am i no ac i d analyzer 基金项目 国家烟草专卖局资助项目。 作者简介 王娟(1979-),女,湖北武汉人,硕士,工程师,从事天然植 物烟用研究。 收稿日期 2008 06 20 烟草中的氨基酸是重要的致香前体物质,在烟草调制、醇化或发酵、加工乃至燃烧过程中,游离氨基酸与还原糖之间可发生酶催化及非酶催化的棕色化反应,生成多种具有蒸煮、烤香、爆米花等不同香味特征的杂环化合物[1-2] 。某些氨基酸如苯丙氨酸还可自身分解成香味化合物(如苯甲醇、苯乙醇等)。氨基酸在烟草生长和加工(如调制、陈化、发酵、加料等)的不同阶段也会发生不同的变化,从而对烟草的品质产生较大影响。一般说来,适量的氨基酸有助于提高烟气劲头和增加丰满度。若氨基酸含量太高,烟气辛辣、味苦、刺激性强烈,这是由于在燃烧过程中氨基酸通常生成NH 3等含氮化合物,个别氨基酸还产生H CN 等危害健康的烟气成分;若氨基酸含量太低,烟气则平淡无味缺少丰满度 [3-5]。因此 对不同时期氨基酸含量及其变化情况的分析,可为卷烟配 方、烟叶加料、调制、发酵程度等提供理论指导。建立准确可靠的烟叶中游离氨基酸的分析方法,无疑是一项非常有意义且十分必要的工作。 氨基酸分析,按分离方法可分为纸色谱法、离子交换法、反相高效液相色谱法、气相色谱法等;按检测方法可分为化学分析法、电化学方法(包括电导检测、安培检测)、分光光度法(包括可见光分光光度法、紫外分光光度法和荧光分光光度法)等;按衍生反应的先后,可分为柱前衍生和柱后衍生法。目前,文献上报道较多的测定烟草中氨基酸的方法主要 是分光光度法[6]和柱前衍生反相高效液相色谱法[4,7-8] 。分光光度法只能测定烟草中游离氨基酸的总量;高效液相色谱 法虽然能够对不同种类的氨基酸定性定量,但是所测定的氨基酸的种类最多只有15~17种,且无法将H i s 和G l y 分开[4] 。笔者用氨基酸自动分析仪建立了一种测定烟草中游离氨基酸的方法,该方法能够对烟草中所含有的23种游离氨基酸分别定性定量检测。1 材料与方法1.1 试验材料 1.1.1 仪器。旋风式样品磨(60目);万分之一天平(德国赛多利斯);移液器(吉尔森);超声波(上海弘兴);试管浓缩仪(东京理化器械株式会社);氨基酸自动分析仪(德国S YKAM );0.45 m 滤膜(上海安谱)。 1.1.2 试剂。去离子水;盐酸(分析纯,上海);样品稀释液(德国SYKA M );不同p H 和离子强度的洗脱液(德国S YKAM );茚三酮溶液(德国S YKA M );混合氨基酸标准溶液(德国SYK AM )。1.2 试验方法 将烟叶置于40 下干燥2h ,粉碎过筛,混合均匀后,密封保存备用。称取1g 样品(精确至0.0001g)于100m l 磨口三角瓶中,加入50.0m l 一定浓度的盐酸溶液,塞上塞子、超声、过滤。准确移取2m l 滤液浓缩蒸干(温度不超过60 ),加入1m l 样品稀释液,摇匀。溶液经0.45 m 滤膜过滤后上机分析。用外标法测定样品溶液中各游离氨基酸的含量。其中脯氨酸在440nm 波长下检测,其他氨基酸在570n m 波长下检测。 1.3 仪器条件 分析柱温度:37 ;反应管温度:130 ;进样量:50 ;l 缓冲溶液:不同p H 值的柠檬酸锂缓冲溶液。2 结果与分析 2.1 氨基酸色谱图 图1、2分别是混合氨基酸标样以及样品溶液的氨基酸分析色谱图。用氨基酸自动分析仪分析标 安徽农业科学,Jou r n al ofAnhu iAgr.i Sc.i 2008,36(26):11413-11416责任编辑 罗芸 责任校对 李洪
茚三酮显色法测定氨基酸含量
茚三酮显色法测定氨基酸含量 一、目的 学习茚三酮显色法测定氨基酸含量的方法 二、原理 茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。 该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm 处的光密度，测定氨基酸的含量。 三、试剂与材料 （1）标准氨基酸溶液：配制成0.3mmol/L 溶液。 （2）pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。用pH 检查校正。 （3）茚三酮显色液：称取85mg 茚三酮和15mg 还原茚三酮，用10mL 乙二醇甲醚溶解。茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。 还原型茚三酮按下法制备：称取5g 茚三酮，用125mL 沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。 将5g 维生素C 用250mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。 （4）60％乙醇。 （5）样品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸。 （6）分光光度计。 （7）水浴锅。 四、操作步骤 1．标准曲线的制作 分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL。各加入1mL pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液；再加入1mL 茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min 后，加入3mL60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。 以OD570nm 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。 2．氨基酸样品的测定 取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液1mL 和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min 后，加3mL 60％乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min 内稳定）。
脯氨酸检测试剂盒(茚三酮比色法)
脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法) 简介： 脯氨酸(Proline，Pro)是一种环状的α-亚氨基酸，呈中性，等电点为6.30，水中溶解度比任何氨基酸都大，水中可溶162g左右，易潮解不易得结晶，有甜味。与茚三酮溶液共热，生成黄色化合物，一旦进入肽链后，可发生羟基化作用，从而形4-羟脯氨酸，是组成动物胶原蛋白的重要成分。羟脯氨酸也存在于多种植物蛋白质中，尤其与细胞壁的形成有关，在正常情况下脯氨酸含量较低，但在逆境下(旱、热、冷、冻、盐碱等)，常有脯氨酸的明显积累，即积累指数与植物的抗逆性有关。在临床、生物材料、工业等方面均有广泛应用。 Leagene脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)检测原理是脯氨酸游离于磺基水杨酸溶液中，前者与茚三酮共热发生反应，能产生稳定的红色产物，以分光光度计测定处吸光度，在一定范围内颜色深浅(即吸光度)与脯氨酸浓度成正比。该试剂盒主要用于测定植物组织中的游离脯氨酸含量。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、蒸馏水 2、研钵或匀浆器 3、离心管或试管 4、滤纸或纱布 5、水浴锅 6、比色杯 7、分光光度计 操作步骤(仅供参考)：编号 名称TO1113 50T Storage 试剂(A): 脯氨酸标准(100μg/ml) 1ml 4℃ 试剂(B): PRO Lysis buffer 250ml RT 试剂(C): PRO Assay buffer80ml RT 试剂(D): 茚三酮2支RT 避光使用说明书1份
1、准备样品： ①植物样品：取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取，加入PRO Lysis buffer 后匀浆或研磨，沸水浴(期间经常摇动)，混匀，用滤纸或纱布过滤，滤液即为脯氨酸提取液，4℃保存备用。 ②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，冻存，用于脯氨酸的检测。 ③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用PRO Lysis buffer进行适当匀浆，留取上清即脯氨酸提取液，4℃保存备用，用于脯氨酸的检测。 ④高活性样品：如果样品中含有较高浓度的脯氨酸，可以使用PRO Lysis buffer进行恰当的稀释。 2、配制茚三酮显色液: 取出茚三酮，准确溶解于茚三酮稀释液，加热搅拌至完全溶解，混 匀，即为茚三酮显色液。4℃避光备用，48h有效。注意：茚三酮稀释液具有一定腐蚀性，请小心操作。 3、配制系列脯氨酸标准溶液：取出脯氨酸标准(100μg/ml)恢复至室温后，以脯氨酸标准 (100μg/ml)按下表继续稀释： 加入物(ml) 1 2 3 4 5 6 脯氨酸标准(100μg/ml)0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 蒸馏水0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 脯氨酸含量(μg) 1 2 3 4 5 6 4、PRO加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注 意避免产生气泡。如果样品中的脯氨酸浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。 加入物(ml) 空白管标准管测定管 蒸馏水0.1—— 系列脯氨酸标准(1-6号管) —0.1 — 脯氨酸提取液——0.1 PRO Assay buffer 1.5 1.5 1.5 茚三酮显色液 1.5 1.5 1.5 混匀，沸水浴，溶液呈红色。 5、PRO测定：迅速冷却加入PRO萃取液，振摇30s，静置片刻，取上清液转移至新的离心管或试管，离心，取上清液备用。以空白调零，分光光度计(1cm光径比色杯)检测标准管520nm处吸光度；以PRO萃取液调零，分光光度计(1cm光径比色杯)检测测定管520nm 处吸光度。