茚三酮比色法与甲醛滴定法测定棉籽粕蛋白水解度的比较_刘丽红

液分别使用甲醛滴定法和茚三酮比色法进行测定。在同一条 件下重复测定试液5次，取5次结果的平均值，测定结果如图 2所示。由图中可以看出，甲醛滴定法的结果偏低。30min， 60min，90min，120min，150min，180min甲醛滴定法测得水 解度比茚三酮法平均低了37.36%。这是由于此种方法采用待 水解的蛋白质的完全水解液作为标准溶液,消除了由于蛋白 质水解液中不同的氨基酸对反应试剂的响应不同所带来的 误差。
慢慢加入 15ml 中性甲醛溶液，1 min 后用 0.05mol/L 氢氧
化钠标准溶液滴定至 pH=8.10。记录消耗氢氧化钠标准溶液
滴定的体积(V0)。
（3）吸取 10.00 ml 灭酶的水解液于烧杯中，加 5 滴
30%过氧化氢。将烧杯置于电磁搅拌器上，电极插入烧杯内
试样中适当位置。开动电磁搅拌器，先用 0.1 mol/L 氢氧化
式中：A：查表得蛋白质的毫克数； W：称取的样品所含蛋白质量（g）； V1：水解液的总体积（ml）； V2：显色时所用稀释液的体积（ml）。
2 结果分析 2.1 茚三酮比色法完全水解液标准曲线
按照 1.6.2 绘制棉籽粕蛋白完全水解液标准曲线如图 1。由图 1 可以看出，蛋白质量浓度与吸光度值呈线性关系， 线性方程为 y = 0.012x－0.0057，相关性 R2=0.9995。其横 坐标为反应体系中的蛋白质质量浓度，纵坐标为相应吸光 度。
刘丽红：茚三酮比色法与甲醛滴定法测定棉籽粕蛋白水解度的比较
161
（2）0.1 mol/L NaOH 溶液：用小烧杯称取约 0.4g 的 NaOH，用少量蒸馏水溶解后，并定容至 100ml 容量瓶中，转 入试剂瓶中，待用；
（3）37％的中性甲醛溶液(pH =8.10)：用量筒量取 200 ml 甲醛溶液于 400 ml 烧杯中，置于电磁搅拌器上，边搅拌 边用 0.05mol/L 氢氧化钠溶液调至 pH=8.10；
化学工程与装备
2012 年 第 11 期
116600
刘丽红：茚三C酮he比mi色ca法l 与En甲gi醛ne滴er定in法g 测& 定Eq棉ui籽pm粕en蛋t 白水解度的比较
2012 年 11 月
分
析 测
茚三酮比色法与甲醛滴定法测定
试
棉籽粕蛋白水解度的比较
刘丽红，雷清华
（福建船政交通职业学院，福建 福州 350007） 刘丽红：茚三酮比色法与甲醛滴定法测定棉籽粕蛋白水解度的比较
（假定酶解配料的棉籽蛋白与水的比例为 M:V）
DH % = (V 1 − V 0) ×V × C ×14.01× 6.25 ×100 1000 × M × pro
式中：V1 为 1 ml 水解液消耗的 NaOH 溶液体积(ml)；
V0 为 1 ml 空白液消耗的 NaOH 溶液体积(ml)；
V 为配料用水体积(ml)；
本文采用一种新的测定水解度的方法。本方法采用的茚 三酮比色法，利用待水解原料的完全水解液作为标准，消除 了由于不同氨基酸与茚三酮结合产物的呈色度不同对测定 结果造成的误差，本方法是依据Qin - Yun Chen[4]的方法进 行改进，使测定结果更接近真实值。 1 材料与方法 1.1 实验材料
（1）棉籽粕：市售棉籽粕；粗蛋白质含量为 37.80%。 （2）Neutrase 中性蛋白酶：购自福州福科生物技术有 限公司； （3）甲醛、茚三酮、氢氧化钠、盐酸等其他试剂均为 分析纯。 1.2 实验仪器 （1）U-3900 紫外分光光度计：日本 HITACHI； （2）AL204 电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有 限公司； （3）HJ-3 恒温磁力搅拌器：常州国华电器有限公司； （4）PHS-3C 型 pH 计：上海埃依琪有限公司； （5）101-2 恒温电热鼓风干燥箱：上海阳光试验仪器 有限公司； （6）SHA-C(数显)水浴恒温振荡器：常州国华电器有限 公司； 1.3 试剂配置 （1）0.05 mol/L NaOH 标准溶液：用小烧杯称取较 0.4g 稍多的 NaOH，用少量不含 CO2 蒸馏水迅速溶解后,定容至 200ml 容量瓶，转移到试剂瓶中，标定后待用；
7
6
5
水解度/ %
4
3
2
1
0 0min
30min 60min 90min 120min 150min 水解时间
◆甲醛滴定法；■茚三酮比色法
180min
图 2 棉籽蛋白水解液水解度两种测定方法比较
利用标准偏差对两种检测方法的精确度进行比较，如表 1 所示。从表 1 中可以看出，茚三酮比色法的相对标准偏差 范围为 1.61%～2.45%，要低于甲醛滴定法的相对标准偏差 2.28%～6.81%。说明茚三酮比色法所测的数值要比甲醛滴定 法更可靠。
C 为滴定用 NaOH 溶液浓度(mol /L)；
14.01 为氮的摩尔质量（g/mol）；
6.25 为氮换算为蛋白质的系数；
M 为配料所加棉籽粕的质量(g)；
pro 为配料所加棉籽粕的蛋白含量(%)。
1.6 茚三酮比色法
1.6.1 工作曲线的绘制
取上述制备的完全水解液 0.2～4ml 于各个试管中，加
A 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0
y = 0.012x - 0.0057 R2 = 0.9995
10
20
30
40
50
60
70
蛋白质质量浓度ug/ml
图 1 完全水解液蛋白质量浓度-吸光度标准曲线
2.2 两种方法的测定结果 对在相同酶解条件下不同时间间隔的棉籽粕蛋白水解
3.47
3.27
3.27
3.61
3.54
3.20
3.27
3.81
3.13
3.47
3.67
3.37
3.57
3.67
3.26
3.42
3.54
0.08
0.11

0.17
2.45
3.22
4.80
4.40
4.89
5.25
4.45
5.13
5.10
4.24
4.93
4.91
4.35
4.78
5.24
150min DH，% 3.81 4.01 3.27 3.94 3.61 3.67 0.25 6.81 5.30 5.35 5.37 5.11
蒸馏水稀释至 20.0ml，（即将此液稀释成质量浓度为
10.0~100mg/L 的溶液），然后各取 2.0ml 稀释液于干净的试
管中，加蒸馏水至 4.0ml，加 pH=8 缓冲溶液 1.0ml，茚三酮
溶液 1.0ml，混匀，沸水浴加热 15min，冷却，蒸馏水稀释
至 25.00ml。在 570nm 处，测吸光度（水作参比）。另取取
（4）30%过氧化氢； （5）茚三酮显色液：称取 2g 茚三酮加入 100ml 蒸馏水， 溶解，放棕色瓶中保存，应每次使用前配制。 （6）pH=8 缓冲溶液：准确量取 0.2mol/L Na2HPO4 94.7ml 与 0.2mol/L NaH2PO4 5.3ml 合并，混匀，转移到试剂瓶中保 存。 （7）样品溶液：取灭酶的水解液 1ml，用去离子水稀 释至 100ml，使其蛋白浓度在 0.08~8g/L。 1.4 实验部分 1.4.1 样品预处理 将样品用高速粉碎机粉碎，通过 60 目样品筛，混合均 匀备用。 1.4.2 水解液与未水解液的制备 称取粉碎棉籽粕 26.50g 置于 1000ml 烧瓶中，加入 500ml 蒸馏水，用 0.1mol/L NaOH 调 pH 至 8，置于 40℃水 浴恒温振荡器中，浸提 2h。取出用 0.1mol/L NaOH 调 pH 至 7.5，加入中性蛋白酶 1.2g，放置在 45℃水浴恒温振荡器中， 在酶解时间，30min，60min，90min，120min，150min，180min 时取出 50ml，在 85℃水浴中加热 10min，使酶失活，取出 冷却至室温后，用低速离心机，在转速为 5000 rpm，离心 10min 后，将上清液转移到试剂瓶中，待用。 另取粉碎棉籽粕 26.50g，按上述条件，但不加酶，制 备棉籽粕未水解液。 1.4.3 棉籽粕蛋白完全水解蛋白液的制备 取棉籽粕 0.2650g(蛋白含量为 100mg)，放入水解管中， 加入 10ml 6mol/L 的盐酸，在真空装置上安装水解管抽真空， 待真空度达到后用酒精喷灯密封水解管。放入 130℃烘箱中 水解 24h，水解完后，把水解管开封，过滤，滤液真空浓缩 至 0.5ml 左右，用蒸馏水定容至 100ml。 1.5 甲醛滴定法 （1）将 pH 计接通电源，预热 30 min 后，用 pH 缓冲溶 液校准 pH 计。 （2）吸取 10.00 ml 未水解棉籽粕蛋白溶液于烧杯中， 加 5 滴 30%过氧化氢。将烧杯置于电磁搅拌器上，电极插入 烧杯内试样中适当位置。开动电磁搅拌器，先用 0.1 mol/L 氢氧化钠慢慢调节 pH 达到 7.5 左右后，再用 0.05 mol/L 氢氧化钠溶液调节至 pH=8.10，并且保持 1 min 不变。然后
不同水解度测定方法所依据的原理不同，由于酶解体系 的特殊性，不同方法测定结果的准确性和精密度可能会有较 大的差异，为了找到准确、可靠的水解度测定方法应用于棉 籽粕适度酶解研究，有必要对几种常用的水解度测定方法进 行比较。目前采用测定蛋白质水解度的方法有甲醛滴定法、 邻苯二甲醛法(OPA)、茚三酮比色法、三硝基苯磺酸法(TNBS) 和pH-stat[2]法等，其中甲醛定法和茚三酮比色法，最为常 用。甲醛滴定法快速简单，但采用此法测定结果低于氨基酸 理论含量，茚三酮比色法由于采用的是单一氨基酸做标准， 而不同的氨基酸对茚三酮的呈色度不同，因此采用茚三酮比 色法结果也有偏差[3]。
钠慢慢调节 pH 达到 7.5 左右后，再用 0.05 mol/L 氢氧化钠