茚三酮法植物体内游离脯氨酸含量的测定
脯氨酸含量的测定方法
植物体内游离脯氨酸含量的测定一、原理磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。
然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。
在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。
二、仪器及试剂1. 仪器：分光光度计；电子分析天平；离心机；10ml+2ml离心管；恒温水浴锅；2 .试剂及配制：冰醋酸；甲苯。
2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L －1磷酸(7ml磷酸+13ml蒸馏水)中，37度摇床摇动溶解，贮于4℃冰箱中。
3％磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。
1mg·ml-1脯氨酸标准母液配制三、实验步骤1. 脯氨酸标准曲线的制作1.1 取6支10ml离心管编号，按下表配制每管含量为0～25μg的脯氨酸标准液。
加入表中试剂后，标准曲线样品和待测样品一起置于沸水浴中加热60min （注意管盖需要压住，不然会爆开挥发液体），取出冷却，各试管再加入2ml 甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。
1.2 以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。
1.3 标准曲线的绘制以1～5号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品的测定2.1 脯氨酸的提取液氮研磨样品材料，称取适当重量样品粉末（0.1-0.2g）于2ml离心管, 然后向各管分别加入1.5ml3％的磺基水杨酸溶液，振荡混匀。
（注意：样品一定要精确称量并记录）离心12000g，10min，上清液1ml移至新10ml离心管中。
2.2 测定加入1ml冰醋酸及1ml 2.5﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热60min，溶液即呈红色。
冷却后加入2ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。
植物体内游离脯氨酸含量的测定(精)
实验20 植物体内游离脯氨酸含量的测定一、原理当植物缺水时体内的脯氨酸含量增加。
植株体内脯氨酸含量在—定程度上反映了植株体内的水分情况，因而可以作为植物缺水情况的参考性生理指标。
用人造沸石在 pH 1~7 范围内振荡溶液，可除去干扰的氨基酸或使不与茚三酮反应（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等），脯氨酸与茚三酮试剂呈显色反应，其含量与颜色深浅成正相关，可用分光光度计测定。
此法有专一性。
二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料植物叶片。
（二）试剂• 80%乙醇。
• 人造沸石。
• 活性炭。
4 ．茚三酮试剂：将 2.50 g 茚三酮于 60 mL 冰醋酸和 40 mL 6 mol/L 磷酸中，加热（ 70 ℃）溶解。
试剂至少在 24 小时内稳定。
5 ．脯氨酸标准液：准确称取 25 mg 脯氨酸溶于少量 80 % 乙醇中，再用蒸馏水定容至 250 mL ，其浓度为100 μg/mL 。
再取此液 10 mL ，用蒸馏水稀释至 100 mL ，即成10 μg/mL 的脯氨酸标准液。
（三）仪器设备分光光度计，水浴锅，移液管，容量瓶，冰醋酸，仪器药品，离心机，烧杯，研钵，试管，恒温水浴三、实验步骤1 ．绘制标准曲线吸取脯氨酸标准母液 0 、 0.2 、 0.4 、 0.8 、 1.2 、 1.6 、 2.0 mL 分别放入 7 支具塞刻度试管，分别加入蒸馏水至 2.0 mL, 其脯氨酸含量分别为0 、 2.0 、 4.0 、 8.0 、 12.0 、 16.0 、20.0 μg 。
分别吸取上述标准溶液 2 mL ，加冰醋酸 2 mL, 茚三酮试剂 2 mL 加入试管中，混匀后加玻璃球塞，在沸水浴中加热 15 min 。
用分光光度计于波长 515 nm 下进行比色测定，以零浓度为空白对照。
将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标作标准曲线。
2. 植株样品液的提取选取植株功能叶片 2 g ，用 3 mL 80 % 乙醇研磨（放少许石英砂）成浆状。
植物体内游离脯氨酸含量的测定
目的意义植物在正常条件下游离脯氨酸（proline，Pro）含量很低，但在干旱、高温、低温、盐碱、水涝等逆境条件下便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性呈正相关关系。
因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标，测定其含量也成为抗性生理研究的重要内容之一。
本实验的目的是掌握游离脯氨酸含量的测定方法、原理及操作技术。
一、酸性茚三酮法（一）原理植物体内的氨基酸只有脯氨酸能与酸性茚三酮发生反应，生成稳定的红色产物。
该产物在515nm有一最大吸收高峰，其吸收值与脯氨酸的含量呈直线关系。
因此，样品中的脯氨酸含量可用酸性茚三酮法测定。
除脯氨酸外，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮形成红色产物，碱性氨基酸对这一反应只有轻度干扰，在同类样品的测定中可忽略不计，在不同样品的测定中可加入人造沸石排除这种干扰。
（二）实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：正常生长与经逆境处理的植物茎、叶、穗等器官或组织。
2. 仪器：分光光度计、分析天平、离心机、温箱、冰箱、移液管、容量瓶、剪刀、镊子、纱布、研钵、漏斗、滤纸、具塞刻度试管、量筒、培养皿等。
3. 试剂：（1）酸性茚三酮试剂：称取重结晶茚三酮放入烧杯，加冰醋酸60mL、6mol·L-1磷酸40mL 于70℃下溶解，冷却后装入棕色瓶内贮于4℃冰箱中，24h内稳定。
现用现配。
（2）100μg·mL-1脯氨酸母液：精确称取脯氨酸溶于少量80％乙醇中，用蒸馏水定容至100mL。
（3）其他试剂：人造沸石、活性炭粉、冰醋酸、80％乙醇。
（三）操作步骤1. 标准曲线制作：（1）取7个50mL容量瓶，分别放入脯氨酸母液、、、、、、，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为、、、、、、μg·mL-1。
（2）另取具塞刻度试管8只（0～7号），0号加入2mL蒸馏水，1～7号分别加入不同浓度的标准系列各2mL，再分别加入冰醋酸2mL和茚三酮试剂2mL，充分摇匀，加盖，沸水浴10～15min。
植物体内游离脯氨酸含量的测定
3
仪器与试剂：
1、实验试剂：
３%磺基水杨酸，甲苯，冰醋酸，人造沸石， 酸性茚三酮试剂（25g茚三酮溶于60ml冰醋酸和40ml 6mol/L磷酸中,加热（70℃）溶解。常温保存期24h，冰箱中保存 48h）， 标准脯氨酸溶液（10mg脯氨酸溶于100ml80％乙醇中，浓度 为100ug/ml）
材料在第一片新叶完全展开后分为两组，第一组作为对 照,继续浇灌1/2Hoagland溶液；第二组为NaCl处理组，浇灌 含0.8%NaCl的1/2Hoagland溶液;继续培养三天后，取地上部 分以备实0、0.5、1.0、5、10、20μg/ml 一系列浓度的标准溶液。取标准溶液各2ml，加入2ml３%磺 基水杨酸、１ml冰醋酸和３ml茚三酮试剂于加塞试管中，充 分混匀后在沸水浴中加热显色40min，冷却后加入４ml甲苯 盖好盖子充分震荡，待其静置分层后，吸取红色甲苯相，于 波长520nm测定OD值，以OD值为纵坐标，脯氨酸浓度 （ μg/ml ）为横坐标绘制标准曲线。
２、实验仪器：
天平，研钵，移液管，水浴锅，离心机，试管，722型分光 光度计
4
实验步骤：
1、准备实验材料
提前7-10天培养小麦材料并根据实验目的对其分组处理， 以备后用。
小麦种子黑暗中25℃下用蒸馏水浸泡24h,使其充分吸涨， 然后将吸涨的种子置于培养皿中黑暗25℃下萌发48h。将萌发 一致的种子播种于培养皿中,用1/2的Hoagland营养液培养.
6
3、NaCl胁迫对小麦脯氨酸含量的影响
分别取对照和ＮaCl处理的小麦幼苗的地上部分（芽鞘 和叶子）0.3g，用３%磺基水杨酸５ml研磨提取，匀浆移 至试管中，在沸水浴中提取10分钟，加入0.5g人造沸石充 分震荡，冷却后转移至离心管中，3000r/min离心10min， 取上清液待测。
植物中脯氨酸含量的测定实验报告及结果
4.配制酸性茚三酮溶液和后续使用酸性茚三酮溶液进行染色的过程中注意不要弄到皮肤上。
5.与酸性茚三酮溶液的反应一定要反应足够长的时间才能使脯氨酸充分染色，否则会使最后测得的样品吸光度偏低。
6.沸水浴加热的过程中注意反应时间要充分。
采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。 样品在520nm波长下比色，即可从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。
（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）
根据吸光度测定，பைடு நூலகம்得数据如下：
编号
1
2
3
4
5
6
脯氨酸浓度（μg/2ml）
2
4
6
8
10
12
吸光度
0.067
0.083
0.124
0.165
0.239
0.276
肇 庆 学 院
生命科学学院生物化学课实验报告 实验老师李芸瑛
12级生物科学3班5组 姓名：张鹏学号：36实验日期：2013年11月27日
实验题目植物中脯氨酸含量的测定
实验目的：
了解植物体内脯氨酸含量对植物抗寒性的影响，掌握标准曲线法测定蛋白质质量浓度的基本操作和722型分光光度计的试用和操作方法。
实验原理：
脯氨酸检测试剂盒(茚三酮比色法)
脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)简介：脯氨酸(Proline，Pro)是一种环状的α-亚氨基酸，呈中性，等电点为6.30，水中溶解度比任何氨基酸都大，水中可溶162g左右，易潮解不易得结晶，有甜味。
与茚三酮溶液共热，生成黄色化合物，一旦进入肽链后，可发生羟基化作用，从而形4-羟脯氨酸，是组成动物胶原蛋白的重要成分。
羟脯氨酸也存在于多种植物蛋白质中，尤其与细胞壁的形成有关，在正常情况下脯氨酸含量较低，但在逆境下(旱、热、冷、冻、盐碱等)，常有脯氨酸的明显积累，即积累指数与植物的抗逆性有关。
在临床、生物材料、工业等方面均有广泛应用。
Leagene脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)检测原理是脯氨酸游离于磺基水杨酸溶液中，前者与茚三酮共热发生反应，能产生稳定的红色产物，以分光光度计测定处吸光度，在一定范围内颜色深浅(即吸光度)与脯氨酸浓度成正比。
该试剂盒主要用于测定植物组织中的游离脯氨酸含量。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、蒸馏水2、研钵或匀浆器3、离心管或试管4、滤纸或纱布5、水浴锅6、比色杯7、分光光度计操作步骤(仅供参考)：编号名称TO111350TStorage试剂(A): 脯氨酸标准(100μg/ml) 1ml 4℃试剂(B): PRO Lysis buffer 250ml RT试剂(C): PRO Assay buffer80ml RT试剂(D): 茚三酮2支RT 避光使用说明书1份1、准备样品：①植物样品：取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取，加入PRO Lysis buffer 后匀浆或研磨，沸水浴(期间经常摇动)，混匀，用滤纸或纱布过滤，滤液即为脯氨酸提取液，4℃保存备用。
②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，冻存，用于脯氨酸的检测。
③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用PRO Lysis buffer进行适当匀浆，留取上清即脯氨酸提取液，4℃保存备用，用于脯氨酸的检测。
茚三酮法植物体内游离脯氨酸含量的测定
茚三酮法植物体内游离脯氨酸含量的测定游离脯氨酸在植物体内的积累指数与植物的抗逆性有关。
因此作为衡量植物抗逆性的一项生化指标。
一、【目的】在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加10~100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。
因此，测定植物体内游离脯氨酸的含量，在一定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力，可作为植物抗逆性的一项生化指标。
二、【原理】采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。
在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。
脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比，可以用分光光度法测定。
（有的用80%酒三、【仪器与用具】分光光度计：水浴锅；漏斗；20ml大试管数支；20ml具塞刻度试管9支；5〜10ml注射器或滴管。
2.5%酸性茚三酮显色液：称取2.5g茚三酮，加入60ml冰乙酸和40ml2mol/L磷酸（以3:2混合），在70度下加热溶解，冷却后贮于棕色瓶中，此液在4°C下2〜3d有效。
3.脯氨酸标准溶液:准确称取25Mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100p g/ml。
再取此液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，即成10p g/ml的脯氨酸标准液。
再用蒸馏水释释成1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0p g/mL 的系列溶液。
四、【方法与步骤】样品脯氨酸提取：取不同处理（干旱处理与对照）的剪碎混匀小麦叶片各0.3g（干样根据水分含量酌减），分别置于20ml具塞试管中，加入5ml3%硝基水杨酸溶液，管口加盖玻璃塞，于沸水浴中浸提15Min。
取出试管，待冷却至室温后，过滤，滤液待测。
显色取9支具塞刻度试管，编号。
植物体内游离脯氨酸含量的测定
植物体内游离脯氨酸含量的测定一,原理当植物缺水时体内的脯氨酸含量增加.植株体内脯氨酸含量在—定程度上反映了植株体内的水分情况,因而可以作为植物缺水情况的参考性生理指标.用人造沸石在pH 1~7 范围内振荡溶液,可除去干扰的氨基酸或使不与茚三酮反应(如甘氨酸,谷氨酸,天冬氨酸,丙氨酸,缬氨酸,胱氨酸,苯丙氨酸,精氨酸等),脯氨酸与茚三酮试剂呈显色反应,其含量与颜色深浅成正相关,可用分光光度计测定.此法有专一性.二,实验材料,试剂与仪器设备(一)实验材料植物叶片.（二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶；5. 大试管；6. 普通试管；7. 移液管；8. 注射器；9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀。
（三）试剂1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中；2. 3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；3. 冰醋酸；4. 甲苯。
三、实验步骤1. 标准曲线的绘制（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。
（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。
（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。
（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。
（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。
（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。
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茚三酮法植物体内游离脯氨酸含量的测定
游离脯氨酸在植物体内的积累指数与植物的抗逆性有关。
因此作为衡量植物抗逆性的一项生化指标。
一、【目的】
在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加10~100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。
因此，测定植物体内游离脯氨酸的含量，在一定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力，可作为植物抗逆性的一项生化指标。
二、【原理】
采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。
在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm 处有一最大吸收峰。
脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比，可以用分光光度法测定。
（有的用80%酒精）
紫色
三、【仪器与用具】
分光光度计：水浴锅；漏斗；20ml大试管数支；20ml具塞刻度试管9支；5～10ml注射器或滴管。
【试剂】
1．3％磺基水杨酸水溶液；甲苯；冰乙酸
2．5%酸性茚三酮显色液：称取2.5g茚三酮，加入60ml 冰乙酸和40 ml 2mol／L磷酸(以3∶2混合)，在70度下加热溶解，冷却后贮于棕色瓶中，此液在4℃下2～3d有效。
3．脯氨酸标准溶液：准确称取25Mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg／ml。
再取此液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg／ml的脯氨酸标准液。
再用蒸馏水释释成1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL 的系列溶液。
四、【方法与步骤】
样品脯氨酸提取：取不同处理(干旱处理与对照)的剪碎混匀小麦叶片各0.3g(干样根据水分含量酌减)，分别置于20ml 具塞试管中，加入5ml 3％硝基水杨酸溶液，管口加盖玻璃塞，于沸水浴中浸提15Min。
取出试管，待冷却至室温后，过滤，滤液待测。
显色取9支具塞刻度试管,编号。
分别向各管加入按下表加入脯氨酸标准液（每ml 10μg）样品液和试剂。
混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热30Min，冷却。
向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。
避光静置20min以上. 待分层后，用吸管吸取甲苯层，以1号管为对照在波长520nM下比色。
标准曲线制作
以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程或绘制标准曲线。
五、结果计算
从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量的百分数。
脯氨酸[%(干或鲜样)]c×V
A
w
×106
式中C:提取液中脯氨酸浓度(μg)，由标准曲线求得；
V:提取液总体积(Ml),5ml；
A:测定时所吸取的体积(ml)0.5ml；
W:样品重(g)。
注意事项
1.比色液为比色杯高度四分之三左右
2.静置分层清晰后才可比色
【思考题】
1.植物体内游离脯氨酸测定有何意义
2.脯氨酸提取除本实验方法外，还有何方法？测定时应作哪些改变？
思考题参考答案
1．在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量明显增加。
测定植物体内游离脯氨酸的含量，可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力。
2．脯氨酸提取除本实验方法外，还可以用磺基水杨酸处理样品，待酸性茚三酮反应之后，再用甲苯萃取，520nm 比色。
当脯氨酸提取试剂或萃取剂改变时，测定光密度的波长应当改变，具体采用多少波长，还应根据实验而定。