氨基酸总量的测定
食品氨基酸总量的测定(精)
第八章 食品氨基酸总量的测定【教学目标】：1.掌握氨基酸、含氮量等的概念和相关知识；2.掌握氨基酸液氮的测定方法和操作技能；3.了解比色法的原理，基本方法及仪器使用和维护的知识。
一、甲醛滴定法1原理氨基酸具有酸性的一COOH 基和碱性的一N 2H 基。
它们互相作用使氨基酸成为中性的内盐。
加入甲醛溶液时，一N 2H 基与甲醛结合，其碱性消失。
这样就可能用碱来滴定一COOH 基，并用间接的方法测定氨基酸的量。
用碱完全中和一COOH 基时的pH 值为8.4~9.2。
2试剂（1）40%中性甲醛：用百里酚酞作指示剂，将甲醋用碱溶液中和至淡蓝色。
（2）0.1%百里酚酞乙醇溶液。
（3）0.1N 氢氧化钠标准溶液。
3操作方法称取粉碎样品5.00~10.00g 或液体样品5~10mL,置于烧杯中，加入50mL 水和活性碳约5g ，加热煮沸，过滤，用30~40mL 热水洗涤活性碳，收集滤液于三角瓶中，加入3滴百里酚酞指示剂，用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。
加入中性甲醛20mL ，摇匀，静置1min ，此时蓝色已经消失，再用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。
记录第二次滴定时消耗的碱液毫升数。
4计算氨基酸态氮（%）=100014.0⨯⨯⨯WV N 式中：N----氢氧化钠标准溶液的当量浓度；V----氢氧化钠钠标准溶液的消耗量（第二次）（g ）;W----样品溶液相当于样品的量（g ）;0．014----氮的毫克当量。
5说明（1）用碱性溶液第一次滴定时，用pH 计控制滴定到溶液pH7.5后，然后加入中性甲醛继续用碱液滴定，又用pH 计控制用碱液滴定样液至pH9.2为终点较为正确。
（2）取相同2份样品溶液，其中1份加入中性红指示剂3滴，用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至琥珀色为终点，另1份加入百里酚酞指示剂3滴和中性甲醛20mL ，静置1min 后，用0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色。
按下列、公式计算：100014.0)((%)12⨯⨯-⨯==WV V N X 氨基酸 式中： 2V ------用百里酚蓝作指示剂时消耗氢氧化钠量（mL ）；1V ------用中性红作指示剂时消耗氢氧化钠量（mL ）；N ------标准氢氧化钠溶液的当量浓度；W------样品重量（g ）；0.014----氮的毫克当量。
8第六章 氨基酸定量测定
1.原理： 强离子交换树脂－二乙烯苯树脂： 交联度大，8-12％。 树脂的结构紧密，孔隙度小，适用于分子较小的氨 基酸的分离。选用Na型的树脂。
吸附：一般在pH2.2溶解样品，由于pH比较低，氨 基酸的H＋解离被抑制，氨基酸带正电荷，可以与阳 离子交换树脂发生交换。
样品 液
分离 柱
M
Na+
pK1
COOCH2(CH2)4+NH3
+NH 3
pK2 9.0
COO CH2(CH2)4+NH3 NNH2 NH2
赖氨酸的等当电＝（ pK1＋pK2）/ 2 = 9.75
洗脱：当pH2.2，3.3，4.9等缓冲液相继流经树脂时， 随着pH逐渐升高，氨基酸失去正电荷，与树脂结合 减弱，从树脂上脱落下来。由于氨基酸的氨基不同， 因此与柱子的结合能力不同。 酸性氨基酸带的正电荷少，等电点比较低，碱性氨 基酸带的正电荷多，被置换下来的pH比较高。
吹数分钟(或置于70～80℃烘
箱中烘干)即可观察到紫红色
的氨基酸斑点，脯氨酸例外，
为黄色斑点。
用铅笔圈出氨基酸斑点，量出溶剂前沿的距离及 各斑点中心与起点之间的距离，并计算各氨基酸 的Rf值。
原点到层析点中心的距离
Rf＝ 原点到溶剂前沿的距离
标准氨基酸薄层层析色谱
氨基酸的性质与Rf之间的关系
层析的分离是基于氨基酸的非极性性质。 物质的极性越小（即非极性越大）,在有机溶剂中分 配就越多，迁移率Rf就越大；
混合样
加样
洗脱剂
分离结果
影响电离的基团：氨基、羧基、胍基、咪唑基、酚基。
洗脱顺序： 酸性氨基酸，中性氨基酸，芳香族氨基 酸，碱性氨基酸 日立832型氨基酸分析仪的洗脱顺序： 天门冬，苏，丝，谷，脯，甘，丙，半胱，缬，蛋， 异亮，亮，酪，苯丙，赖，氨，组，精
样品前处理-酸水解
样品前处理
一、前处理方法
氨基酸总量的测定需要三种方法。
通常我们使用酸水解法测定
天冬氨酸，苏氨酸，丝氨酸，谷氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丙氨
酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，组氨酸，精氨酸等15种氨基酸，用氧化水解法测定胱氨酸和蛋
氨酸，用碱水解法测定色氨酸。
在酸水解过程中色氨酸被全部
破坏，无法测定，含硫氨基酸（胱氨酸和蛋氨酸）会被部分氧
化，无法侧准。
二、采样
样品须具有代表性，用四分法缩减分取25克左右，粉碎并通过
0.25mm孔径（60目）筛，充分混匀后待测。
由于氨基酸在氧
及碳水化合物存在下易破坏，所以样品粉碎时温度不能过高，
需低于50度。
对于粗脂肪含量大于或等于5%的样品，需先脱
脂，然后风干，混匀备用。
酸水解的样品应先测定粗蛋白的含
量。
样品的称量需用万分之以上天平。
三、前处理步骤
1、酸水解
A、称取含蛋白7.5-25mg的样品于20ml安培瓶中（切勿贴壁）
B、加入10ml 6mol/L盐酸，抽真空至小于7Pa后，冲氮气，再
抽真空充氮气，如此重复三次后，在充氮气情况下封口或拧紧螺丝盖。
C、封口后的安培瓶放入110度恒温干燥箱内水解22-24小时
D、冷却、混匀、开管、过滤，定容于25毫升容量瓶，取适量
滤液置于旋转蒸发仪中，60度以下抽真空，蒸干，加少
许水，反复1-2次
E、加入3-5ml PH2.2稀释液，使浓度达到50-250nmol/ml。
混
匀后过0.45微米滤膜，或10000转离心10分钟，后取上清，待上机用。
实验一 氨基酸总量的测定(发园艺.设施等)
实验一植物组织中氨基酸总量的测定(茚三酮比色法)一、目的意义和要求：二、原理：三、植物材料：1、发芽水稻种子：用水(对照)、50mmol/L NaCl和500mmol/L NaCl溶液分别浸种２天后，室温（28℃）下萌发２天。
2、每组用２种材料，即１种对照和１种NaCl处理。
四、试剂配制 :1.水合茚三酮试剂: 称取0.6克再结晶的茚三酮置烧杯中，加入15毫升正丙醇，搅拌使其溶解。
再加入30毫升正丁醇及60毫升乙二醇，最后加入9毫升pH5.4的乙酸—乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶，置冰箱中保存备用，10天之内有效。
2. 乙酸—乙酸钠缓冲液（pH为5.4）：称取化学纯乙酸钠54.4克，加100毫升无氨蒸馏水，在电炉上加热至沸，使体积蒸发至原体积的一半。
冷却后加30毫升冰乙酸，用无氨蒸馏水稀释至100毫升。
3. 标准氨基酸：称取80℃下烘干的亮氨酸46.8毫克，溶解在10%的异丙醇中，并用10%异丙醇稀释至100毫升。
取此液5毫升，用蒸馏水稀释至50毫升，即为每毫升含氮5微克的标准液。
4.0.1%抗坏血酸：称取50毫克抗坏血酸溶于50毫升无氨蒸馏水中，随用随配。
五、操作步骤：1、样品制备：称取水稻萌发种子1克于研钵中，加入2ml10%乙酸、石英砂，充分研成匀浆，再加入3ml10%乙酸，研磨均匀后用蒸馏水洗入100ml容量瓶并用蒸馏水定容至100ml。
混匀后用干燥滤纸过滤到三角瓶中备用。
2、标准曲线的绘制：取8支试管，按下表编号、加试剂。
2、样品测定：取3支20ml刻度试管，按下表编号、加试剂。
加完试剂后，混匀，盖上玻塞，置沸水浴中加热15分钟，然后取出放在冷水浴中迅速冷却并经常摇动，使加热时形成的红色逐渐被空气氧化而褪色，直至溶液呈蓝紫色时，用60%的乙醇定容至20毫升，摇匀，用光径为1厘米的比色杯，在波长570nm下测定其消光值，制作标准曲线。
3、样品测定：取2支试管，分别加入2亳升过滤液，加入0.1%抗坏血酸0.1毫升，水合茚三酮3ml,混匀加盖，置沸水浴加热15min，取出后用冷水迅速冷却，用60%乙醇定容至20ml。
氨基酸总量的测定
氨基酸总量的测定(茚三酮比色法)一、方法原理：氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，可产生二酮茚一二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，其颜色深浅与氨基酸含量成正比，据此可以比色测定氨基酸含量。
二、试剂：1．2％茚三酮溶液：1g茚三酮(C9H403·2H2O)溶于25ml热水中，加入40mg氯化亚锡；(SnCl2·2H2O)，搅拌溶解，滤去残渣，滹液放在冷暗处过夜，用水定容为50ml，保存声冷暗处。
如茚三酮有微红色，配成的溶液也带红色，将影响比色测定，需将茚三酮重结晶后再用方法是：取5g茚三酮溶于20ml热水中，加入0.2g活性炭，轻轻摇动，放三十分钟后过滤，滤液置冰箱中过夜，次日过滤，用1ml冷水淋洗结晶，然后放在干燥器中干燥，装瓶保存。
2。
磷酸盐缓冲液(pH8.0)：①1／15mol/l磷酸二氢钾溶液：取KH2P04 0.9070g溶于lOOml水中。
②1／15mol/l磷酸氢二钠溶液：取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)23.876g溶于水，加水至1000ml。
取①50ml与②95ml混匀即得。
3．10％醋酸：取lOml冰醋酸加水至lOOml。
4，氨基酸标准溶液(200ppm)：称取干燥的氨基酸(白氨酸，或其它的氨基酸)0.2000g溶解于水，定容为1000ml。
三、仪器：水浴，721分光光度计。
四、操作步骤：(一)标准曲线绘制：分别吸取氨基酸标准溶液(200ppm)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml各置于25ml容量瓶中,加水补充至4.0ml，各加入缓冲液lml，加入茚三酮lml，摇匀。
置沸水浴中加热15分钟，取出迅速冷却至室温，—用水定容。
放置15分钟，在570nm波长下测定，绘制标准曲线。
氨基酸浓度分别为0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.Oppm。
(二)样品测定：l提取样品：称取1.0 ~2.0g植物样品(新鲜样或干样)，加5m1 10％醋酸，在研钵中研碎，用水洗移入lOOml容量瓶，水定容，过滤到三角瓶中，取滤液测定。
氨基酸的定量测定
6、三硝基苯磺酸法
原理： 三硝基苯磺酸（TNBS）是定量测定氨基酸的重要试剂之一。 TNBS 在偏碱性的条件下与氨基酸反应，先形成中间络合物。 中间络合物在光谱上有2个吸收值相近的高峰，分别位于355nm 和420nm 附近。然而溶液一旦酸化，中间络合物转化成三硝基苯 -氨 基酸（TNP-氨基酸），420nm 处的吸收值显著下降，而350nm 附近 的吸收峰则移至340nm 处。 利用 TNBS 与氨基酸反应的这一特性，可在420nm 处（偏碱性 溶液中）或在340nm（偏酸性溶液中）对氨基酸进行定量测定。在 340nm 处，各氨基酸的吸收度大致相近，而在420nm 处的吸光度因 2 氨基酸种类而异；在加入适量 SO3 时，吸收值升高。 本法允许的测定范围是 0.05～0.4μmol 氨基酸。
1、甲醛滴定法
计算结果：
氨基酸态氮含量=
(V2 V1 ) c 0.014 100 % m
式中：c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L V1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL V2——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积， mL m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g 1 0.014—— N2毫摩尔质量，g/mmol
100%
式中：VHClO ——所消耗的高氯酸标准溶液的体积 cHClO ——所消耗的高氯酸标准溶液的浓度 M——被测氨基酸的摩尔质量 m——被测氨基酸的质量
4
4、非水溶液滴定法
②回滴法（适用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精确称取氨 基酸样品30~40mg 左右，溶解于5mL高氯酸标准溶液中，加2滴甲基紫指示剂，剩 余的酸以醋酸钠溶液滴定，颜色变化由黄，经过绿、蓝至初次出现不褪的紫色为 终点。 氨基酸含量=
氨基酸总量的测定
一、单指示剂甲醛滴定法
3.操作步骤
（1）样品称量：称取一定量样品(约含20mg的氨基酸)于烧杯 中(如为固体加水50mL)； （2）滴加指示剂：加2-3滴0.1%百里酚酞乙醇溶液 （3）NaOH标准溶液滴定：用0.1mol/L NaOH标准溶液滴定至 淡蓝色。 （4）加入甲醛生成羟甲基衍生物：加入中性甲醛20mL，摇匀 ，静置1分钟，此时蓝色应消失。 （5）NaOH标准溶液再次滴定：再用0.1mol/L NaOH溶液滴定 至淡蓝色。记录两次滴定所消耗的碱液体积mL。
7.思考题 ■ 甲醛法测定氨基酸含量的原理是什么? ■ 为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的—NH+3基上的H+，
不能用一般的酸碱指示剂？
氨基酸总量的测定
氨基酸是含有氨基和羧基的一类有机化合物的统称， 氨基酸不是单纯的一种物质，有时多种氨基酸可以共存。 所以不能以氨基酸百分率来表示氨基酸含量，而需要测定 总的氨基酸量，以氨基酸中所含的氮(氨基酸态氮)的百分 率表示。
基衍生物，使上述平衡右移，促使－NH3释放H＋，使溶液 的酸度增加，滴定中和终点移至酚酞的变色域内（PH9.0 左右）。因此可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液 滴定放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。
任务一 氨基酸总量的测 定
一、单指示剂甲醛滴定法
R-CH-COONH3+
R-CH-COO+ H+ NaOH
若样品中只含有一种氨基酸，就可以从含氮量计算出 氨基酸的含量。
■ 氨基酸总量测定方法主要有单指示剂甲醛 滴定法、双指示剂甲醛滴定法和茚三酮比色法。
氨基酸总量的测定 二、双指示剂甲醛滴定法测定
氨基酸总量的测定
氨基酸总量(氨态氮)的测定一、目的与原理：1、了解掌握单指示剂与双指示剂甲醛滴定法测氨基酸总量的方法与原理：二、单指示剂甲醛滴定法：(一)原理：氨基酸具有酸、碱两重性质，因为氨基酸含有-COOH基显示酸性，又含有-NH2基显示碱性。
由于这二个基的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐。
当参加甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可用碱来滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量，反响式可能以下面三种形式存在。
〔二〕试剂(1)40％中性甲醛溶液，以麝香草酚酞为指示剂，用1N NaOH溶液中和。
(2)0.1％麝香草酚酞乙醇溶液。
(3)0.100N氢氧化钠标准溶液。
(三)操作步骤：称取一定量样品(约含20毫克左右的氨基酸)于烧杯中(如为固体加水50毫升)，加2-3滴指示剂，用0.1OON NaOH溶液滴定至淡蓝色。
参加中性甲醛20毫升，摇匀，静置1分钟，此时蓝色应消失。
再用0.1OON NaOH 溶液滴定至淡蓝色。
记录两次滴定所消耗的碱液毫升数，用下述公式计算计算：氨基酸态氮(％)=( N V×0.014×100)/W式中：N：NaOH标准溶液当量浓渡。
V：NaOH标准溶液消耗的总量(m1)W：样品溶液相当样品重量(克)。
0.014：氮的毫克当量。
三、双指示剂甲醛滴定法：(一)原理：与单色法一样，只是在此法中使用了两种指示剂。
从分析结果看，双指示剂甲醛滴定法与亚硝酸氮气容量法(此法操作复杂，不作介绍)相近单色滴定法稍偏低，主要因为单指示剂甲醛滴定法是以氨基酸溶液PH值作为麝香草酚酞的终点。
PH值在9.2，而双指示剂是以氨基酸溶液的PH 值作为中性红的终点，PH值为7.0，从理论计算看，双色滴定法较为准确。
(二)试剂：(1)三种试剂同单指示剂法(2)0.1％中性红(50％乙醇溶液)(三)操作步骤：取一样的两份样品，分别注入100毫升三角烧瓶中，一份参加中性红指示剂2-3滴，用0.100N NaOHOH准溶液滴定至淡蓝色。
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氨基酸总量的测定
(茚三酮比色法)
一、方法原理：
氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，可产生二酮茚一二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，其颜色深浅与氨基酸含量成正比，据此可以比色测定氨基酸含量。
二、试剂：
1．2％茚三酮溶液：1g茚三酮(C9H403·2H2O)溶于25ml热水中，加入40mg氯化亚锡；(SnCl2·2H2O)，搅拌溶解，滤去残渣，滹液放在冷暗处过夜，用水定容为50ml，保存声冷暗处。
如茚三酮有微红色，配成的溶液也带红色，将影响比色测定，需将茚三酮重结晶后再用方法是：取5g茚三酮溶于20ml热水中，加入0.2g活性炭，轻轻摇动，放三十分钟后过滤，滤液置冰箱中过夜，次日过滤，用1ml冷水淋洗结晶，然后放在干燥器中干燥，装瓶保存。
2。
磷酸盐缓冲液(pH8.0)：
①1／15mol/l磷酸二氢钾溶液：取KH2P04 0.9070g溶于lOOml水中。
②1／15mol/l磷酸氢二钠溶液：取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)23.876g溶于水，加水至1000ml。
取①50ml与②95ml混匀即得。
3．10％醋酸：取lOml冰醋酸加水至lOOml。
4，氨基酸标准溶液(200ppm)：称取干燥的氨基酸(白氨酸，或其它的氨基酸)0.2000g溶解于水，定容为1000ml。
三、仪器：
水浴，721分光光度计。
四、操作步骤：
(一)标准曲线绘制：
分别吸取氨基酸标准溶液(200ppm)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml各置于25ml容量瓶中,加水补充至4.0ml，各加入缓冲液lml，加入茚三酮lml，摇匀。
置沸水浴中加热15分钟，取出迅速冷却至室温，—用水定容。
放置15分钟，在570nm波长下测定，绘制标准曲线。
氨基酸浓度分别为0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.Oppm。
(二)样品测定：
l提取样品：称取1.0 ~2.0g植物样品(新鲜样或干样)，加5m1 10％醋酸，在研钵中研碎，用水洗移入lOOml容量瓶，水定容，过滤到三角瓶中，取滤液测定。
2．样品液测定：移取样品待测液l ~4毫升，放人25ml容量瓶中，加水至4.Oml，加缓冲液1ml，加茚三酮1ml，摇匀。
置沸水浴中加热15分钟，取出用冷水迅速冷却至室温，加水定容。
放置15分钟后，测定。
同时测定待测液空白值，扣除空白值后，从标准曲线上查得氨基酸的浓度。
五、结果计算：
氨基酸总量(mg％) =(ppm * l00 * 25 * 100)/(W * V * 1000)
= (ppm * 250)/(W * V)
式中：ppm--由标准曲线查得样品测定液氨基酸浓度；
W——称样品重(g)
V——吸取样品待测液体积(ml)
六。
注意事项：
1．配制茚三酮溶液的茚三酮和SnCl2都应该用五色晶体，配成的溶液一般应在10天内用完。
2．应控制反应溶液的pH才能得到重现性好的结果，反应液pH在6.2 ~ 6.4之间为宜，所加试液和缓冲液的量的比例可为2：1或1：1。
3．要控制加热温度和时间，温度过高容易褪色，温度低发色不全。
沸水浴中加热发色快，但可能受热不均匀及容易褪色，可以降低温度(80O C)，延长加热时间，使发色均匀。
也可以在
烘箱中加热，105O C烘10分钟。
4．茚三酮与氨萋酸反应生成的颜色在1小时内稳定，浓度高时褪色较快，应在发色稳定、加水定容后，在半小时内比色。
5．明显带色的试样，可以用活性炭脱色，但某些氨基酸(酪氨酸等)也被活性炭吸附，会使结果降低。
6．茚三酮与氨、胺类、氨基糖类、尿素、蛋白质等也发生反应，这些物质会干扰测定。
7．植物样品处理方法不同，游离氨基酸组成会有变化，应用分析结果时应说明样品处理。