诱变方法
理化诱变方式
理化诱变方式
1.物理法：射线（紫外线、X光线、Y射线，中子线），激光微束，离子束，微波，超声波，热力等。
2.化学诱变法：浸渍法、涂抹法、滴液法、注射法、施入法和熏蒸法。
化学诱变剂：碱基类似物、烷化剂，移码诱变剂，硫酸二乙酯（DFS）、5-溴尿嘧啶（5－BU）、氮芥（Nm）、N'广甲基N'亚硝基胍（NTG）。
3.生物法：空间条件处理诱变，病原微生物诱变，转基因诱变。
人工诱变在人为的条件下,利用物理、化学等因素，诱发生物产生突变，从中选择、培育动植物和微生物的新品种。
诱变育种是指用物理、化学因素诱导植物的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株，进而培育成新的品种或种质的育种方法。
化学诱变方法
化学诱变方法
化学诱变是一种基因工程技术，它可以利用特定化学药物对目标基因进行精确修饰，从而
改变基因的表达结果。
该方法可应用于多种互补DNA片段，突变位点和编码基因的改造，以及其他细胞科学应用。
化学诱变可提供一种精确方法，以调控基因表达，而不会对基因
其他部分产生不良影响。
化学诱变首先将抗生素敏感诱导体转导至目标细胞，然后添加特异性的化学敏化剂，从而
特定部位的基因被切除，同时还可以概念性上发现新的目标位点。
这项技术最初主要应用
于真菌基因组中。
随着技术的发展，它也被投入了植物，昆虫，病毒和高等动物基因组的
基因结构改造的相关工作中。
在抗生素敏感的性状转导中，用于诱变的化学物质有多种类型，其中包括氯仿和壬基苯酚。
氯仿是一种有毒物质，用来切除DNA片段，并能够调节不同种类的基因表达。
而壬基苯
酚是一种脱氢酶诱导剂，能够调节特定细胞内酶的活性，并利用这一活性靶向改变基因的
表达，对一些具有特异性的基因特异性调控特别有用。
如今，在基因组学技术中使用化学诱变技术已经取得了巨大的进步，这种技术的价值越来
越受到关注。
它以精确的方式进行操作，使我们能够轻松地识别和调节基因表达，从而可
以改变一个特定模式/行为/特性。
它促进了许多科学应用，比如生理，生化和临床研究，
以及基因疗法的研究，使得基因工程技术使人们了解和控制其整个基因图谱。
总之，化学诱变是一种非常有用的基因操作方法，其精确性和有效性在诸多领域有着广泛的应用。
它可用于识别和调控基因表达，改变特定的结构/行为特性，以及基因疗法的研究，深受科学家的欢迎。
常规育种方法
一、诱变育种：诱变育种是指利用人工诱变的方法获得生物新品种的育种方法原理：基因突变方法：辐射诱变，激光、化学物质诱变，太空（辐射、失重）诱发变异→选择育成新品种优点：能提高变异频率，加速育种过程，可大幅度改良某些性状；变异范围广。
缺点：有利变异少，须大量处理材料；诱变的方向和性质不能控制。
改良数量性状效果较差。
二、杂交育种：杂交育种是指利用具有不同基因组成的同种（或不同种）生物个体进行杂交，获得所需要的表现型类型的育种方法。
其原理是基因重组。
方法：杂交→自交→选优优点：能根据人的预见把位于两个生物体上的优良性状集于一身。
缺点：时间长，需及时发现优良性状。
三、单倍体育种：单倍体育种是利用花药离体培养技术获得单倍体植株，再诱导其染色体加倍，从而获得所需要的纯系植株的育种方法。
（主要是考虑到结合中学课本，经查阅相关资料无误。
）其原理是染色体变异。
优点是可大大缩短育种时间。
原理：染色体变异，组织培养方法：选择亲本→有性杂交→F1产生的花粉离体培养获得单倍体植株→诱导染色体加倍获得可育纯合子→选择所需要的类型。
优点：明显缩短育种年限，加速育种进程。
缺点：技术较复杂，需与杂交育种结合，多限于植物。
四、多倍体育种：原理：染色体变异（染色体加倍）方法：秋水仙素处理萌发的种子或幼苗。
优点：可培育出自然界中没有的新品种，且培育出的植物器官大，产量高，营养丰富。
缺点：只适于植物，结实率低。
五、细胞工程育种：细胞工程育种是指用细胞融合的方法获得杂种细胞，利用细胞的全能性，用组织培养的方法培育杂种植株的方法。
原理：细胞的全能性方法：（1）植物：去细胞壁→细胞融合→组织培养（2）动物克隆：核移植→胚胎移植优点：能克服远缘杂交的不亲和性，有目的地培育优良品种。
动物体细胞克隆，可用于保存濒危物种、保持优良品种、挽救濒危动物、利用克隆动物相同的基因背景进行生物医学研究等。
缺点：技术复杂，难度大；它将对生物多样性提出挑战，有性繁殖是形成生物多样性的重要基础，而“克隆动物”则会导致生物品系减少，个体生存能力下降。
诱变育种的方法
诱变育种的方法引言：诱变育种是指通过诱变剂引起植物或动物基因发生变异，从而产生新的有用性状的育种方法。
诱变育种可以提高作物的抗病性、适应性和产量等特性，对农业生产和人类生活具有重要意义。
本文将介绍几种常用的诱变育种方法。
一、物理诱变方法：物理诱变方法是利用物理因素对生物体的基因产生变异的方法。
常用的物理诱变方法有辐射诱变和化学诱变。
1. 辐射诱变：辐射诱变是指利用电离辐射对生物体进行诱变。
常用的辐射诱变方法包括γ-射线辐射和X射线辐射。
辐射诱变可以产生大量的突变体，通过对突变体的筛选和评价，可以选育出具有优良特性的新品种。
2. 化学诱变：化学诱变是指利用化学诱变剂对生物体进行诱变。
常用的化学诱变剂有EMS（乙基甲磺酸甲酯）和NaN3（氮化钠）。
化学诱变剂可以引发DNA的突变，从而产生新的基因型和表型。
二、生物诱变方法：生物诱变方法是利用生物因素对生物体的基因产生变异的方法。
常用的生物诱变方法有基因工程技术和细胞诱变技术。
1. 基因工程技术：基因工程技术是指通过改变生物体的基因组成，从而产生新的有用性状的育种方法。
常用的基因工程技术包括基因克隆、基因转移和基因编辑等。
通过基因工程技术，可以将具有有益特性的基因导入到目标生物体中，从而实现育种目标。
2. 细胞诱变技术：细胞诱变技术是指通过处理植物细胞或动物细胞，使其发生基因突变，从而产生新的有用性状的育种方法。
常用的细胞诱变技术包括化学诱变、辐射诱变和基因转化等。
细胞诱变技术可以提高诱变效率，加快育种进程。
三、化学诱变方法：化学诱变方法是利用化学品对生物体的基因产生变异的方法。
常用的化学诱变方法有化学诱变剂和化学物质处理。
1. 化学诱变剂：化学诱变剂是指通过处理生物体，使其基因发生突变的化学物质。
常用的化学诱变剂有EMS（乙基甲磺酸甲酯）、NTG（亚硝酸乙酯）和NaN3（氮化钠）等。
化学诱变剂可以改变DNA的结构，引发基因突变。
2. 化学物质处理：化学物质处理是指利用化学物质对生物体进行处理，使其基因发生变异。
紫外诱变方法
紫外诱变方法宋炜等：高产脂肪酶酵母菌株的分离筛选及紫外诱变中南林业科技大学学报，2009，29(3)：55-641．2．4 紫外诱变1．2．4．1 紫外诱变处理取2 mL处于对数生长期的菌液于直径75 mm 的无菌培养皿中，置于30 w 紫外灯下30 cm处，分别照射处理：30 S、45 S、90 S、120 S、180 S、240 S、300 S，每个处理重复3次，用罗丹明B平板计算存活率，得出诱变致死曲线。
每次紫外照射后在黑暗培养箱中静置30 min，然后在黑暗中稀释至1O-4、10-5倍，分别取0.1 mL涂于罗丹明B平板上，每级稀释液涂抹3个平板，以不进行照射作对照，紫外线照射以后的操作都在黑暗中进行，防止光修复。
将涂匀的平板，用黑布裹好，置于28℃恒温培养箱中避光培养4 d。
1．2．4．2 突变菌株的初筛将培养好的平板取出进行菌落计数，计算致死率。
致死率(%)=100一(处理后每0.2 mL菌落数／对照每0.2 mL菌落数)×100。
同时测量透明圈直径(D)和菌落直径(d)，用接种针挑取经不同剂量诱变的直径较大菌落，将相同处理剂量D／d比值大于对照D／d的菌落穿刺于同一个罗丹明B培养皿上，每皿点6个，黑暗条件下培养4 d。
1．2．4．3 突变菌株的摇瓶复筛从相同处理时间的初筛平皿中选取D／d最大突变菌株，28℃摇瓶培养72 h，离心取上清液测酶活力．孙同毅等：高产碱性蛋白酶菌株HAP26选育氨基酸和生物资源2007，29(2)：20～22 1．2．1诱变(1)NTG诱变处理将在10 g·L～N一甲基一硝基一N一亚硝基呱(NTG)溶液中浸泡过的滤纸片(‘p1．5 cm)放在涂满嗜碱芽孢杆菌HAP26的培养皿中央。
(2)N+离子注入条件本试验采用由郑州大学提供的离子注入机。
注入离子能量为30 Kev，单次脉冲时间为6 s，间隔时间为60 s，单次注入离子能量为×1014N+个数／cm2，真空度为5～6×10-3Kpa。
诱变育种途径二：化学诱变育种.
化学诱变育种利用化学诱变剂处理，诱发植物发生遗传变异，从而选育新品种称为化学诱变育种。
早在1948年，Gustafsson等曾用芥子气处理大麦获得突变体。
1967年Nilan 用硫酸二乙酯处理大麦种子育成了矮秆、高产品种Luther。
此后化学诱变剂的研究和应用就逐步发展起来。
目前发现的一些化学诱变剂的主要特性见表7-4，但较公认的最有效和应用较多的是烷化剂和叠氮化物两大类。
烷化剂中仍以甲基磺酸乙脂(EMS)、硫酸二乙酯(DES)和乙烯亚胺(EI)等类型的化合物应用较多，叠氮化物则以叠氮化钠研究和应用较多。
表7-4 常用化学诱变的主要特性与物理诱变剂相比，化学诱变剂的特点有：①诱发突变率较高，而染色体畸变较少。
主要是诱变剂的某些碱基类似物与DNA的结合而产生较多的点突变，对染色体损伤轻而不致引起染色体断裂产生畸变。
②对处理材料损伤轻，有的化学诱变剂只限于DNA的某些特定部位发生变异。
③大部分有效的化学诱变剂较物理诱变剂的生物损伤大，容易引起生活力和可育性下降。
此外，使用化学诱变剂所需的设备比较简单，成本较低，诱变效果较好，应用前景较广阔。
但化学诱变剂对人体更具有危险性，必须选择不影响操作人员健康的有效药品。
但高效低毒的化学诱变剂数量不多，所以一般育种工作者仍以物理诱变为主。
一、化学诱变剂的类别与性质(一)烷化剂是指具有烷化功能的化合物。
它带有一个或多个活性烷基，如CH3、C2H5，该烷基转移到一个电子密度较高的分子上，可置换碱基中的氧原子，这种作用称为烷化作用。
烷化剂可以将DNA的磷酸烷化。
常用的烷化剂为甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、乙烯亚铵、亚硝基乙基尿烷(NEU)和亚硝基乙基脲(NEH)等。
(二)叠氮化钠(NaN3)是一种动植物的呼吸抑制剂，它可使复制中的DNA碱基发生替换，是目前诱变率高而安全的一种诱变剂。
可以诱导大麦基因突变而极少出现染色体断裂。
这对大麦、豆类和二倍体小麦的诱变有一定的效果，但对多倍体的小麦或燕麦则无效。
简述诱变育种的基本流程
简述诱变育种的基本流程
诱变育种是指利用诱变剂将植物的DNA或RNA转化为突变体,然后通过基因编辑技术将这些突变体转化为育种目标。
以下是诱变育种的基本流程:
1. 诱变剂选择:选择适当的诱变剂,如放射性同位素、化学物质或病毒,以确保诱变剂能够引起植物的基因突变。
2. 诱变处理:将植物或其他生物暴露在适当的诱变剂中,以诱导基因突变。
通常使用化学诱变剂、辐射诱变剂或病毒来诱导突变。
3. 检测和分析:检测诱变剂引起的突变,并对突变进行分类和评估。
可以使用生物分析技术,如PCR、测序和转录组技术,来分析突变基因和突变类型。
4. 突变基因编辑:利用基因编辑技术,如CRISPR/Cas9,将突变基因转化为
育种目标。
这些技术可以通过精确定位和修改突变基因来创造新的品种。
5. 筛选和育种:通过比较诱变育种目标品种与野生型品种,选择诱变育种目标品种并进行育种。
这可以通过自然选择、遗传变异和人工选择等方法来实现。
诱变育种是一种高效的方式,可以创造新的品种,特别是对于那些无法通过自然选择和遗传变异形成新物种的植物品种。
但是,诱变育种也存在一些潜在的风险,如诱变剂的安全性和环境污染。
因此,在进行诱变育种时,必须小心谨慎,并遵循相关的安全性和环境保护规定。
人工诱变的物理方法
人工诱变的物理方法
1. 辐射诱变：利用辐射的能量和粒子的作用，引起基因突变，包括电离辐射（X 射线、γ射线、β粒子）和非电离辐射（紫外线、可见光、红外线、微波、电磁波等）。
2. 化学诱变：利用化学物质的毒性、氧化性、碱性等性质，诱导基因的随机突变，如使用EMS（乙基甲磺酸乙酯）和EN（硝基能）等化学物质。
3. 热诱变：利用高温或低温环境创造的物理条件来诱发基因的随机突变，如高温处理、低温处理、冷冻处理等。
4. 高压诱变：利用高压环境创造的物理条件，诱发基因的随机突变，如高压灭菌、超高压处理等。
5. 过氧化物诱变：利用过氧化物的自由基作用，诱发基因的随机突变，如使用过氧化氢、过氧化乙酸等物质。
6. 电诱变：利用电场、电流等电力条件，诱发基因的随机突变，如使用电解水处理、电泳诱变等。
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EMS的诱变处理方法：
①EMS 母液的配制：为了安全和防上失效，配制前将需用的器皿，置冰箱内预冷，然后在冰浴中进行配制。
取0.5ml EMS原液，加人到10 ml pH7.2磷酸缓冲液中，加盖，并轻轻转动试管。
由于在水溶液中易失效，故尽可能低温保藏，并要现用现配。
②取新鲜的菌体，经前培养至对数期．离心洗涤，用缓冲液制成8 ml 菌悬液（107-108ml-1）。
对于丝状菌孢子，则前培养至萌动期，悬液含106 ml-1。
③取EMS母液2ml，加人到以8ml的菌悬液中。
在适宜温度下处理一定时间（根据预实验绪果确定）。
处理的最终浓度为0 .lmol／L。
对于真菌孢子，则为0.2-0.5rnol／L。
④EMS处理一定时间后，用50倍生理盐水稀释或加入一定量的2%NaS2O3溶液或多次离心、洗涤，以终止反应。
EMS是剧毒的诱变剂，在整个诱变过程，包括配制药品、操作处理、保存等都要严守安全，不能接触皮肤，所有接触过EMS的器皿，单独用大量水冲洗洗涤，或用10％NaS2O3溶液浸泡过夜，再用清水冲洗干净。
亚硝酸是一稀常用的诱变剂，毒性小．不稳定，易挥发．其钠盐易在酸性缓冲液中产生NO 和NO2
（一）亚硝酸的诱变机制
脱去碱基中的氨基变成酮基，引起转换而发生变异。
A→H，C→U，G→X。
A：T→G：C和G：C→A：T。
亚硝酸的诱变也可以发坐回复突变。
亚硝酸除了脱氨基作用外，还可引起DNA交联作用，DNA复制，从而导致奕变。
（二）亚硝酸的处理方法
1．试剂的配制
（1）1mol／L pH4.5醋酸缓冲液
（2）0.1mol／L亚硝酸钠溶液
（3）0.07mol／L pH8.6磷酸氢二钠溶液
以上试剂用前均要灭菌。
2．处理方法
取孢子悬液1 ml，pH4.5醋酸缓冲液2ml及硝酸钠溶液lml，最后处理浓度为0.025 mol／L ；25-26℃保温10-20min，加入的磷酸氢二钠溶液20 ml，使出下降至pH 6. 8左右，以终止反应。
稀释分离于平板。
如果是处理细菌，亚硝酸最后浓度以0.05 mol／L。
在亚硝酸处理菌体或孢子时要严格控制好温度，否则会影响诱变效果。
羟胺的简称HA，常以盐酸羟胺形式存在，为白色晶体，溶于水，不稳定易分解，具腐蚀性。
1.羟胺的诱变机制
当羟胺浓度为0.1-1.0mol／L pH6.0时，主要与胞嘧啶反应，使羟化的C与A配对，在0.1-1.0mol／L pH9.0，羟胺可以与鸟嘧啶反应，10-3 mol／L时，羟胺可以与胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶起反应。
但据分析，羟胺与T、G反应的是它的产物，而不是它本身。
此外，羟胺有时还能和细胞中其他物质作用产生过氧化氯，也具有诱变作用。
2．羟胺的处理方法
常用浓度为0.1％-5％，可直接在溶液中处理，时间1-2h，然后分离培养。
但一般都加到琼脂平板或振荡培养基中。
然后接入孢子或细菌，在适温下培养，生长过程中处理．所用浓度比直接处理时低些。
六、金属盐类
用于诱变育种的金属盐类主要有氯化锂、硫酸锰等。
其中氯化理比较常用，与其他诱变剂复合处理，效果相当显著。
氯化锂称之为助诱变剂，氯化锂是白色粉末，易溶于水，使用时通常加到培养基中。
为了速免受破坏．倒平板时，当培养基温度冷却到50-60℃时才加入制成平板，然后把细菌或孢子涂布分离，处理终浓度为0.3％-1.5%。
实验思路：出发菌株（酶活较大菌株编号）—紫外诱变——选透明圈较大（与未诱变的菌株进行对照）的进行化学诱变——EMS 和DES诱变——选透明圈较大（与未诱变的菌株进行对照）的进行氯化锂诱变——最终获得突变菌株
注：每次均需要做对照，测酶活，目的菌株选择：透明圈直径：菌落直径（HC值）较大的菌株进行下一步的诱变。
一、紫外诱变方法：
1 培养基
高氏1号液体培养基
发酵培养基
蛋白酶鉴定培养基（脱脂奶粉培养基）
2 步骤
一、孢子液的制备
挑取纯化的斜面培养物（目标菌株）一环接种于50ml/250ml的高氏培养基中，25°180-200r/min培养5d-7d，离心6000r/min，10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次，制成一定浓度的菌悬液（OD600=0.5±0.15）进行紫外诱变。
每种菌做2个。
二、紫外诱变处理
取一定量的菌悬液放入6cm培养皿中（培养皿中液体厚度为2mm）,30cm垂直照射，并用磁力搅拌器进行搅拌，分别照射2,3,4min，将处理的菌液用无菌生理盐水进行梯度稀释分别稀释至10-1，-2，-3浓度，分别取0.1ml在蛋白酶鉴定培养基上进行涂布，至少做3个重复，同时对未经紫外处理的对照菌液也进行同样的梯度稀释后平板涂布，计算致死率，致死率=（1－诱变处理后每0.1 mL 菌落数/对照每0.1 mL 菌落数）×100%，根据经验致死率在70%-80%之间时，正突变率最高。
涂布后的平板在暗处培养3-5d后观察，选取HC比值（透明圈直径/菌落直径）
较对照明显大的单菌落进行发酵（同时进行斜面保种），25°，200r/min，50ml/250ml装量，做3个平行，测其酶活。
二、化学试剂诱变（DES和EMS）
DES诱变
挑取经紫外诱变后的斜面保种突变菌株于液体高氏1号培养基，50ml/250ml接种，25度，180r/min培养5-7d（根据实际情况）诱变处理将处于对数生长期的菌液在室温下 6 000 r/min 离心10 min，弃上清液，收集菌体。
用10 mL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.0）洗涤2 次，然后重悬于pH 7.0 的磷酸缓冲液中，调整菌液浓度为108个/mL（调整OD600=0.5左右即可）。
移取4 mL 菌液到16 mL 磷酸钾缓冲溶液（pH 7.0）中，加入0.2 mL 硫酸二乙酯，分别振荡处理20、40、60 min，最后加入0.5 mL 25%硫代硫酸钠中止反应。
将诱变处理20、40、60 min 的菌液分别稀释为10-1、10-2、10-3三个稀释度，每种浓度做3个重复，取0.1ml平板涂布，以未经化学诱变处理的出发菌为对照，25 ℃恒温培养箱中培养5d。
将培养好的平板取出，菌落计数，计算致死率。
挑取HC比值大的单菌落进行发酵（同时斜面保种），做3个平行重复，测其酶活。
EMS诱变
孢子悬液的制备请参见DES方法，。