使用偏爱密码子大幅度提高苯丙氨酸脱氨酶在食品级乳酸乳球菌中的表达
副高卫生职称《营养与食品卫生》(题库)考前点题卷一
副高卫生职称《营养与食品卫生》（题库）考前点题卷一[单选题]1.下列关于氨基酸密码子的描述哪一项（江南博哥）是错误的()A.密码子有种属特异性，所以不同生物合成不同的蛋白质一、单项选择题B.密码子阅读有方向性，从5′端起始，3′端终止C.密码子第1，2位碱基与反密码子的第3，2位碱基结合严格按碱基互补原则D.一种氨基酸可有一组以上的密码子E.密码子第3位碱基在决定掺入氨基酸的特异性方面重要性较小参考答案：A[单选题]2.体内肝精氨酸酶的最适pH是()A.4.5B.1.8C.5.2D.7.5E.9.8参考答案：E[单选题]3.绝大多数真核生物mRNA5′－末端有()A.PolyAB.帽子结构C.终止密码D.起始密码E.Pribnow盒参考答案：B[单选题]4.以一酰甘油途径合成三酰甘油主要存在于()A.脂肪细胞B.肠黏膜细胞C.肝细胞D.肌细胞E.肾脏细胞参考答案：B[单选题]5.脂肪动员增强时，肝内生成的大量乙酰CoA主要转变为()A.胆固醇B.脂肪酸C.酮体D.葡萄糖E.CO和H O参考答案：C[单选题]6.三羧酸循环中发生底物水平磷酸化的反应是()A.柠檬酸→异柠檬酸B.异柠檬酸→α–酮戊二酸C.α–酮戊二酸→琥珀酰辅酶AD.琥珀酰辅酶Α→琥珀酸E.琥珀酸→苹果酸参考答案：D[单选题]7.透析使唾液淀粉酶活性显著降低的原因是()A.酶含量减少B.酶失活C.酶蛋白变性D.失去辅助因子E.失去酶蛋白参考答案：D[单选题]8.糖原分解与糖原合成途径的共同酶()A.己糖激酶B.葡萄糖石磷酸酶C.脱支酶D.分支酶E.磷酸葡萄糖变位酶参考答案：E[单选题]9.DNA的Tm()A.只与DNA链的长短有直接关系B.与G－C碱基对含量成正比C.与碱基组成无关D.与A-T碱基对含量成正比E.所有真核生物Tm值都一样参考答案：B[单选题]10.下列哪种化合物中不含高能磷酸键()A.1，6－二磷酸果糖B.二磷酸腺苷C.磷酸烯醇式丙酮酸D.1，3－二磷酸甘油酸E.磷酸肌酸参考答案：A[单选题]11.翻译的产物是()A.多肽链B.tRNAC.rRNAD.mRNAE.DNA参考答案：A[单选题]12.全酶是指()A.酶蛋白－辅助因子复合物B.酶蛋白－底物复合物C.酶必需基团－底物复合物D.酶活性中心－底物复合物E.催化基团－结合基团复合物参考答案：A[单选题]13.体内进行嘌呤核苷酸从头合成最主要的组织是()A.小肠黏膜B.胸腺C.肝脏D.脾脏E.骨髓参考答案：C[单选题]14.胰岛素分子α－1链与β－链的交联是靠()A.盐键B.氢键C.二硫键D.酯键E.范德华力参考答案：C[单选题]15.有关非依赖ρ因子终止转录的描述哪项是错误的()A.终止子含有反向重复序列B.转录产物5′末端有密集的UC.茎环结构改变RNA聚合酶的构象D.转录产物的3′末端可形成茎环结构E.茎环结构可使不稳定的杂化双链更不稳定参考答案：B[单选题]16.正常体内含糖原总量最多的组织器官是()A.脑B.肾C.红细胞D.肝E.肌肉参考答案：E[单选题]17.磺胺类药物抑菌作用的机制是()A.二氢叶酸还原酶B.二氢叶酸合成酶C.四氢叶酸还原酶D.四氢叶酸合成酶E.叶酸合成酶参考答案：B[单选题]18.在已知序列的情况下获得目的DNA最常用的是()A.筛选基因组文库B.化学合成法C.筛选cDNA文库D.聚合酶链式反应E.DNA合成仪合成参考答案：D[单选题]19.人体必需脂肪酸是A.油酸B.丁酸C.花生四烯酸D.亚油酸E.DHA参考答案：D参考解析：人体必需的脂肪酸为亚油酸和亚麻酸。
生物化学题库(含参考答案)
生物化学题库（含参考答案）一、单选题（共74题，每题1分，共74分）1.与血红蛋白合成无关的维生素是()。
A、维生素B6B、维生素B12C、叶酸D、生物素正确答案：D答案解析：A项,血红蛋白合成的关键酶是ALA合酶,其辅基为磷酸吡哆醛(VitB6的活性形式)。
BC两项,血红蛋白的珠蛋白基因表达时,核苷酸及核酸的合成需要以一碳单位为原料,而一碳单位的代谢需要叶酸和VitB12。
D项,生物素是体内多种羧化酶的辅酶,参与CO2的羧化过程,与血红蛋白的合成无关。
2.下列有关脂肪酸合成的叙述不正确的是()。
A、生物素是参与合成的辅助因子之一B、脂肪酸合成酶系存在于细胞质中C、合成时需要NADPHD、合成过程中不消耗ATP正确答案：D答案解析：A项,乙酰CoA是合成脂肪酸的原料,需先羧化生成丙二酰CoA参加合成反应。
催化乙酰CoA转化生成丙二酰CoA的是乙酰CoA羧化酶,其辅基为生物素。
B项,脂肪酸合成是在线粒体外即细胞质中进行的,因脂肪酸合成酶系存在于细胞质中。
CD两项,脂肪酸合成除需要乙酰CoA外,还需要ATP、NADPH、HCO -(CO )、及Mn2+等,乙酰CoA与丙二酰CoA每经转移、3 2缩和脱羧及还原(加氢、脱水和再加氢)1次碳链延长2个碳原子,重复多次可合成含16碳的软脂酸,以上还原过程的供氢体为NADPH,所以合成时需要大量NADPH。
3.6-磷酸果糖激酶最强的变构激活剂是()。
A、果糖-1,6-二磷酸B、果糖-2,6-二磷酸C、ATPD、GTP正确答案：B答案解析：6-磷酸果糖激酶-1变构抑制剂:柠檬酸、ATP;变构激活剂:果糖-1,6-二磷酸、果糖-2,6-二磷酸、ADP、AMP。
①果糖-1,6-二磷酸是反应产物,对反应起正反馈作用以促进糖酵解;②果糖-2,6-二磷酸是最强的激活剂。
4.若将一个完全被放射性标记的DNA分于放于无放射性标记的环境中复制三代后,所产生的全部DNA分子中,无放射性标记的DNA分子有几个?()A、2个B、1个C、4个D、6个正确答案：D答案解析：DNA复制为半保留复制,复制三代即产生8个DNA分子。
基于密码子优化的FAD依赖葡萄糖脱氢酶在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质
（Institute of Microbiology，Hebei Academy of Sciences，Baoding 071051）
Abstract: The objective of this work is to obtain high-yield FAD-dependent glucose dehydrogenase（FAD-GDH）. First，by optimizing the codons of FAD-GDH gene according to the codon preference of Pichia pastoris，the gene fragment was artificially synthesized，then the recombinant vector pMD-GDH containing FAD-GDH e gene was constructed and transferred into P. pastoris（X33），and the secretory expression by methanol induction was achieved. Results showed that a stable recombinant strain with high enzymatic activity was obtained by screening positive transformants at test-tube level. In the 10 L fermenter after 136 h induction culture，enzyme activity reached 257 600 U/ L. The analysis of enzymatic characterization demonstrated that the optimal pH and temperature while using glucose as substrate were 7.0 and 55℃，respectively. The initial enzyme activity still remained 70% after 150 min treatment at 50℃. In the range of pH 4-7，FAD-GDH still retained over 50% activity after incubated at 37℃ for 4 h. Cu2+ presented relatively large inhibition to enzyme activity. FAD-GDH harbored a relative high substrate specificity and D-glucose was the optimal substrate. The efficient expression of FAD-GDH in P. pastoris is achieved by optimizing the codon preference of P. pastoris，which provides a theoretical basis for the detection of blood glucose.
河北省张家口市北晨学校高三生物月考试题含解析
河北省张家口市北晨学校高三生物月考试题含解析一、选择题（本题共40小题，每小题1.5分。
在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。
）1. 下列为某一段多肽链和控制它合成的DNA双链的一段：“—甲硫氨酸—脯氨酸—苏氨酸—甘氨酸—缬氨酸—”。
密码子表：甲硫氨酸(AUG)、脯氨酸(CCA、CCC、CCU)、苏氨酸(ACU、ACC、ACA)、甘氨酸(GGU、GGA、GGG)、缬氨酸(GUU、GUC、GUA)。
根据上述材料，下列描述中，错误的是A．这段DNA中的①链起了转录模板的作用B．决定这段多肽链的遗传密码子依次是AUG、CCC、ACC、GGG、GUAC．这段多肽链中有4个“—CO—NH—”的结构D．若这段DNA的②链右侧第二个碱基T为G替代，这段多肽中将会出现两个脯氨酸参考答案：D2. 玉米的某一性状有野生型和突变型，由一对基因B和b控制，杂合子中有87.5%的个体表现为突变型。
某一玉米自交，F1中出现两种表现型。
下列有关分析错误的是( )A. F1的基因频率与亲本相比不会发生改变B. 亲本可均为突变型C. F1中的杂合子自交后代突变型∶野生型＝11∶5D. F1自由交配产生的F2中，突变型与野生型的比例为1：1参考答案：D【分析】由题意可知，本题主要考查的是基因频率和孟德尔遗传定律等知识。
【详解】A、某一玉米群体自交后F1产生两种表现型，则该玉米群体中一定有杂合子，它们自交，后代基因频率不会改变，A正确；B、亲本可能全是突变型杂合子，基因型为Bb，B正确；C、F1中杂合子基因型为Bb，其自交F2基因型及比例为BB：Bb：bb=1：2：1，根据题意杂合子中87.5%的个体表现为突变型，即7/8为突变型，可推知，F2中表现型及比例为突变型：野生型=（1/4+2/4×7/8）：（2/4×1/8+1/4）=11：5，C正确；D、F1自由交配产生的F2中杂合子比例会发生变化，突变型的比例增多，野生型的比例减少，D错误。
人教版高中生物必修2第4章 基因的表达第3节 遗传密码的破译(选学)习题含解析
第三节遗传密码的破译一、单选题1．遗传学上将某种分子上决定一个氨基酸的三个相邻碱基称为“密码子”，含有密码子的某分子是（）A. 肽链B. DNAC. 信使RNAD. 转运RNA【答案】C【解析】试题分析：mRNA决定一个氨基酸的三个相邻碱基称为“密码子”。
2．几种氨基酸可能的密码子如下。
甘氨酸：GGU、GGC、GGA、GGG；缬氨酸：GUU、GUC、GUA、GUG；甲硫氨酸：AUG。
经研究发现，在编码某蛋白质的基因的某个位点上发生了一个碱基替换，导致对应位置上的氨基酸由甘氨酸变为缬氨酸；接着由于另一个碱基的替换，该位置上的氨基酸又由缬氨酸变为甲硫氨酸，则该基因未变时的甘氨酸的密码子应该是（）A. GGUB. GGCC. GGAD. GGG【答案】D【解析】试题分析：根据题干可知，基因中某个碱基发生替换，结果导致密码子中一个碱基发生改变，甲硫氨酸的密码子是AUG，对比甘氨酸和缬氨酸的密码子可知，只有GUG与AUG相差一个碱基，而GUG与甘氨酸的GGG密码子相差一个碱基，因此基因未突变时，甘氨酸的密码子是GGG，故D正确。
考点：本题主要考查基因突变和密码子，意在考查考生能理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系和推断的能力。
3．最近，科学家在一种生物体内发现了第22种氨基酸--吡酪赖氨酸，并弄清楚了它的密码子，这是一项伟大的成就。
吡酪赖氨酸的密码子是A. 基因中的某三个脱氧核苷酸B. 转运RNA上的三个碱基C. DNA一条链上相邻的三个碱基D. 信使RNA的三个相邻的碱基【答案】D【解析】试题分析：密码子是信使RNA上的三个相邻的碱基，一个密码子决定一个氨基酸，D正确。
考点：本题考查蛋白质合成的知识。
意在考查能理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力。
4．若细胞质中tRNA1(AUU)可转运氨基酸a,tRNA2(ACG)可转运氨基酸b,tRNA3(UAC)可携带氨基酸c(括号中的字母表示tRNA顶端环状结构外露的三个碱基),现在以DNA分子中的一条链…A—C —G—T—A—C—A—…为模板合成蛋白质,则该蛋白质基本组成单位的排列可能是( )A.a—b—cB.c—b—aC.b—a—cD.b—c—a【答案】D【解析】试题分析：氨基酸a对应的密码子是UAA，氨基酸b对应的密码子是UGC, 氨基酸c对应的密码子是AUG。
【08考研】各重点高校的生物化学试题
欲索取更多考研资料，请上北京天问教育网站官网！中国科学院2002年A是非题2．赖氨酸、精氨酸和组氨酸都是碱性氨基酸，在pH7时携带正电荷。
( )3．维生素对人体的生长和健康是必需的，但人体不能合成维生素。
( )4．酶的最适pH与酶的等电点是两个不同的概念，但两者之间有相关性，两个数值通常比较接近或相同。
( )5．对于一个酶而言，其过渡态底物的类似物与其底物的类似物相比较，是更有效的竞争性抑制剂。
( )选择题1．苯丙氨酸在分解代谢中先转变为：A．酪氨酸B．组氨酸C．色氨酸3．引起疯牛病(牛海绵脑病)的病原体是：A．一种DNA B．一种RNA C．一种蛋白质D．一种多糖8．在羧肽酶A的活性部位存在一个紧密结合的Zn2＋离子，这个Zn2＋离子的作用是：A．亲核催化作用B．亲电催化作用C．酸碱催化作用D．并不发挥催化作用，而是稳定催化部位的结构9．α—酮戊二酸脱氢氧化生产琥珀酸。
在有氧的条件下，完整线粒体中，一分子α—酮戊二酸氧化后将能生成：A．1分子A TP B．2分子A TP C．3分子A TP D．4分子A TP10．三羧酸循环中草酰乙酸是什么酶作用的产物：A．柠檬酸合成酶B．琥珀酸脱氢酶C．苹果酸脱氢酶D．顺乌头酸酶11．青毒素的抗菌原理是：A．是K＋的载体B．抑制细菌的核酸合成C．抑制细菌细胞壁的合成D．抑制细菌核糖体蛋白质合成13．细胞质中主要有三种RNA：tRNA、mRNA和rRNA，其相对含量是：A．tRNA>mRNA>rRNA B．tRNA>rRNA>mRNA C．rRNA>tRNA>mRNA16．RNA形成二级结构的碱基配对，除了A－U和G－C外，还有：A．A-C B．A-G C．G-U17．下列4种辅酶中，哪一种既可以传递乙酰基，又可以传递氢：A．NAD＋B．辅酶A C．硫辛酰胺D．四氢叶酸填空题2．在酶的催化机理中，侧链基团既是一个很强的亲核基团又是一个很有效的广义酸碱基团的残基是＿＿＿＿＿＿。
2019年高考理科综合全国卷(全国ⅠⅡ Ⅲ卷)共三套试卷试题真题含答案
绝密★启用前
在
2019 年普通高等学校招生全国统一考试·全国Ⅰ卷
理科综合
可能用到的相对原子质量： H 1 C 12 N 14 O 16 Mg 24 S 32
此
Fe 56 Cu 64
一、选择题：本题共 13 个小题，每小题 6 分。共 78 分，在每小题给出的四个选项中，
只有一项是符合题目要求的。
要课题。下图为少量 HCl 气体分子在 253 K 冰表面吸附和溶解过程的示意图。下列
叙述错误的是
()
A.冰表面第一层中， HCl 以分子形式存在 B.冰表面第二层中， H + 浓度为 5 103 mol L-1 （设冰的密度为 0.9 g cm-3 ）
C.冰表面第三层中，冰的氢键网格结构保持不变 D.冰表面各层之间，均存在可逆反应 HCl H+ +Cl-
() A.水平拉力的大小可能保持不变 B.M 所受细绳的拉力大小一定一直增加 C.M 所受斜面的摩擦力大小一定一直增加 D.M 所受斜面的摩擦力大小可能先减小后增加 20.空间存在一方向与直面垂直、大小随时间变化的匀强磁场，其边界如图（a）中虚线 MN 所示，一硬质细导线的电阻率为ρ、横截面积为 S，将该导线做成半径为 r 的圆环
示，假设两星球均为质量均匀分布的球体。已知星球 M 的半径是星球 N 的 3 倍，则
A.M 与 N 的密度相等
()
B.Q 的质量是 P 的 3 倍
C.Q 下落过程中的最大动能是 P 的 4 倍 D.Q 下落过程中弹簧的最大压缩量是 P 的 4 倍
三、非选择题：共 174 分，第 22~32 题为必考题，每个试
理科综合试卷 第 3页（共 124页）
此
A.相比现有工业合成氨，该方法条件温和，同时还可提供电能
葡聚糖外切酶和葡聚糖内切酶基因密码子的优化及表达
葡聚糖外切酶和葡聚糖内切酶基因密码子的优化及表达苏少锋;萨初拉;刘红葵;赵小庆;吴青海;其布日;王蕴华;呼和【摘要】[目的]合成经过密码子优化的葡聚糖外切酶和葡聚糖内切酶基因,并将2个基因在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,ctis)中进行分泌表达.[方法]对瘤胃真菌(Piromyces rhizinflatus,P.rhizinflatus)的外切葡聚糖酶cbhYW23-1基因(GenBank登录号:EU314937.1)和产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes,F.succinogenes)的内切葡聚糖酶end-1基因(GenBank登录号:X88561.1)进行ctis MG1363密码子偏爱性优化,并在2个基因的上游和下游分别引入Cla Ⅰ/XbaⅠ和HindⅢ酶切位点,得到含有优化的cbhYW23-1基因和end-1基因的克隆载体pUC57-cbhYW23-1和pUC57-end-1;通过酶切后分别连接到构建的组成型分泌载体pMG36e+P32+SPusp45上,得到2个基因的表达载体,然后电转至ctis MG1363中,利用红霉素抗性筛选得到高拷贝转化重组子;以CMC-Na(羧甲基纤维素钠)为底物验证其活性及表达情况.[结果]成功地构建了cbhYW23-1基因和end-1基因的分泌型表达载体,2个基因均能够在ctisMG1363中高效稳定表达,2株重组菌株表达的外切葡聚糖酶酶活和内切葡聚糖酶酶活分别为118.80 U/mL和294.32 U/mL.[结论]密码子优化后的2个纤维素酶基因在ctis中获得理想稳定的表达,其高效基因工程菌的构建为将来实现这2种纤维素酶的工业化生产奠定了技术基础.【期刊名称】《畜牧与饲料科学》【年(卷),期】2017(038)003【总页数】8页(P1-8)【关键词】外切葡聚糖酶;内切葡聚糖酶;克隆;密码子优化;功能表达【作者】苏少锋;萨初拉;刘红葵;赵小庆;吴青海;其布日;王蕴华;呼和【作者单位】内蒙古农业大学动物科学学院,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农牧业科学院生物技术研究中心,内蒙古呼和浩特010031;内蒙古农牧业科学院生物技术研究中心,内蒙古呼和浩特010031;内蒙古农牧业科学院生物技术研究中心,内蒙古呼和浩特010031;内蒙古农牧业科学院生物技术研究中心,内蒙古呼和浩特010031;内蒙古农牧业科学院生物技术研究中心,内蒙古呼和浩特010031;内蒙古农牧业科学院生物技术研究中心,内蒙古呼和浩特010031;内蒙古农牧业科学院生物技术研究中心,内蒙古呼和浩特010031;内蒙古农牧业科学院生物技术研究中心,内蒙古呼和浩特010031【正文语种】中文【中图分类】Q755;Q933纤维素是目前含量最丰富的可再生性有机资源和多糖物质［1］，其广泛存在于植物细胞壁中。
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22卷2期2006年3月生 物 工 程 学 报Chinese Journal o f Biotechnology V ol.22 N o.2March 2006 Received :October 12,2005;Accepted :N ovember 28,2005.This w ork was supported by a grant from the National Natural Science F oundation of China (N o.30271372).3C orresponding author.T el :86-10-65064135,E -mail :liujingzhong @ 国家自然科学基金资助项目(N o.30271372)。
使用偏爱密码子大幅度提高苯丙氨酸脱氨酶在食品级乳酸乳球菌中的表达H igh -level Expression of Phenylalanine Ammonia-lyase in Lactococcus Lactis Via Synthesized Sequence B ased on Bias Codons陈 星1,2,高 斌1,2,贾兴元1,苏 畅1,吕月平1,王战勇1,范新萍1,肖 白1,刘敬忠13CHE N X ing 1,2,G AO Bin 1,2,J I A X ing -Y uan 1,S U Chang 1,L ΒY ue-Ping 1,W ANG Zhan-Y ong 1,FAN X in-Ping 1,XI AO Bai 1and LI U Jing -Zhong 131首都医科大学附属朝阳医院基础医学研究中心,北京 1000202首都医科大学2003级研究生,北京 1000541Beijing Chaoyang Ho spital Affiliate o f Capital Univer sity o f Medical Sciences ,Beijing 100020,China 2Master G raduate o f Capital Univer sity o f Medical Sciences ,Beijing 100054,China摘 要 为获得苯丙氨酸脱氨酶(PA L )在食品级乳酸乳球菌中的高效表达,将欧芹pal cDNA (pal nat )及根据乳酸乳球菌偏爱密码子设计人工合成的pal 基因(pal art )重组并转化到两种乳酸乳球菌NICE 诱导表达系统中,测定基因工程菌表达PA L 酶的量及活性,对比分析密码子偏爱性对乳酸乳球菌表达外源蛋白的影响。
结果表明:在两种乳酸乳球菌NICE 表达系统中,使用偏爱密码子均可显著提高PA L 酶的表达效率,使NZ 9000ΠpNZ 8048表达系统表达量提高22123倍,NZ 3900ΠpNZ 8149系统提高35190倍。
此研究获得了安全高效表达PA L ,可用于治疗苯丙酮尿症的基因工程菌。
关键词 苯丙氨酸脱氨酶,乳酸乳球菌,NICE 表达系统,密码子中图分类号 Q786 文献标识码 A 文章编号100023061(2006)022*******Abstract T o construct a safer and m ore efficient gene engineering Lactococcus Lactis for expressing phenylalaine amm onia lyase (PA L )which w ill be benefit for PK U therapy ,pal cDNA of Parsly and synthesized sequence based on Lactococcus Lactis bias codons were recombined into tw o Lactococcus Lactis NICE systems.The activities of the expressed PA L were detected ,and the effect of Lactococcus Lactis bias codons on the expression of exterior protein was analyzed.The results showed that the expression level of PA L was increased by using Lactococcus Lactis bias codons in both Lactococcus Lactis NICE systems.Through which several safer andm ore efficient strains of the gene engineering Lactococcus Lactis were obtained.K ey w ords phenylalaine amm onia-lyase ,Lactococcus Lactis ,NICE system ,codon 经典型苯丙酮尿症(PK U )是由于苯丙氨酸羟化酶(PAH )基因缺陷引起肝细胞内PAH 酶活力严重缺乏所致的常染色体隐性遗传病。
体内正常苯丙氨酸羟化反应需要一些必须的辅助因子,且脱辅基的PAH极不稳定,单纯采用补充苯丙氨酸羟化酶的方法难以达到治疗目的。
研究者们转而采用另一种极有前途的酶———苯丙氨酸脱氨酶(phenylalanine amm onia-lyase,PA L)[1],这种来源于植物或微生物的酶比较稳定,不需辅因子,可将苯丙氨酸(PHE)脱氨生成对人体无毒副作用的肉桂酸(CI N)。
本研究是在我室过去研究的基础上[2-4],期望用食品级NICE诱导表达载体系统(Nisin-C ontrolled Expression system),实现pal基因在乳酸乳球菌(Lactococcus Lactis,ctis)中的高效表达,在小肠吸收PHE之前使其脱氨转化为cin,降低血苯丙氨酸浓度,达到有效治疗PK U的目的。
对于同义密码子而言,不同的物种的使用频率有很大差别,因此出现了所谓的密码子的偏爱性(codon preference or bias)。
外源基因尤其是来自较远物种的基因在宿主的表达会受到一定的影响[5]。
我们根据乳酸乳球菌基因组密码子的使用频率,选取偏爱密码子设计并人工合成PA L基因(pal art),构建了克隆,希望提高两种乳酸乳球菌NICE表达系统的PA L表达水平。
1 材料与方法111 质粒与菌株JM109ΠpET23b-PA L含有欧芹pal cDNA基因,由本室构建[5];两种NICE表达系统均购自荷兰NIZ O研究所。
NZ9000ΠpNZ8048系统带有氯霉素(Cm)抗性筛选标记,方便基因重组,且表达效率高;NZ3900ΠpNZ8149系统无抗生素抗性标记,采用乳糖利用筛选方式,对人体更加安全,构建过程较为困难。
112 目的基因11211 利用PCR扩增pal cDNA(pal nat):以pET23b-PA L为模板,设计合成T1、T2引物用于扩增。
T1:5′-G AG AACGG T AACGG TG C AACT AC-3′, T2:5′-G CT CT AG AG C ATG T C AG TT AAC-3′。
T2含XbaⅠ酶切位点。
11212 根据乳酸乳球菌偏爱密码子设计合成pal art 基因:乳酸乳球菌基因组密码子使用频率数据来自codon usage database(http:ΠΠw w w.kazusa.or.jpΠcodon),计算相对同义密码子使用率(relative synonym ous codon usage-values,RSC U),然后用C odonW113软件进行校验。
在不改变氨基酸种类及序列的基础上,全部选用偏爱密码子设计并人工合成(鼎国公司)全长212kb的pal基因(pal art),并在其5′端引入XbaⅠ酶切位点。
113 pNZ8048-PA L nat及pNZ8048-pal art的构建pal nat含2个NcoⅠ酶切位点,与载体pNZ8048采用一平一粘连接;pal art设计为只含有5′端1个NcoⅠ酶切位点,因此与载体可用两个粘端连接。
pal nat经T4DNA聚合酶处理后,再用XbaⅠ酶切,产物纯化回收。
载体pNZ8048经NcoⅠ酶切、DNA 聚合酶ⅠK lenow大片段补平、XbaⅠ酶切后纯化回收。
两片段用T4DNA连接酶连接。
人工合成的pal art基因及载体pNZ8048均经XbaⅠ、NcoⅠ双酶切并纯化后,用T4DNA连接酶连接。
连接产物转化感受态E.coli MC1061细胞,经氯霉素抗性筛选,菌落直接PCR法[7]鉴定阳性克隆菌株并提取质粒DNA。
114 pNZ8149-pal nat和pNZ8149-pal art的构建基因重组方法同上,连接产物直接转化乳酸乳球菌NZ3900。
115 电穿孔转化乳酸乳球菌电穿孔用感受态ctis的制备均按文献[6]进行,电穿孔用EquiBio Easyject细胞打孔仪进行。
pNZ8048-pal nat及pNZ8048-pal art电转化入NZ9000,参数设定为215kV,25μF,400Ω,筛选培养基用G M17+agar(+5μgΠm L Cm),氯霉素抗性筛选; pNZ8149-pal nat及pNZ8149-pal art电转化入NZ3900,参数设定为215kV,25μF,200Ω,筛选培养基用LS A+agar(+5%乳糖)。
116 阳性克隆筛选鉴定菌落直接PCR法和HP LC测定产物肉桂酸法鉴定阳性菌株[3,6]。
117 PA L蛋白在乳酸乳球菌中的诱导表达及活性分析培养菌液至OD600=014～015时,加入诱导物乳链菌肽(nisin)至终浓度为10ngΠm L,继续培养5h,细菌沉淀干燥称重后加入一定量含PHE的P BS (pH=810),37℃反应1h[8]。
样品经5%高氯酸处理后,HP LC法测定PHE被PA L脱氨后产生的产物肉桂酸含量。
118 PA L蛋白的SDS-PAGE检测诱导培养后细菌超声破碎,按常规方法上样电泳[3],以不含质粒的ctis为对照。
2 结果211 菌落PCR法筛选鉴定阳性克隆直接挑取转化子菌落,T1、T2为引物进行PCR扩增,有212kb片段扩增产物的为阳性克隆。
如图1中31、33、39、41号转化子即为阳性克隆。
212 基因工程ctis的诱导表达及PA L活性测定基因工程ctis经nisin诱导后5h,OD600约为116,可达最高表达量,此时收集菌体加入10mm olΠL PHE,反应1h后经HP LC检测,阳性菌株代谢产物肉桂酸与其标准品的HP LC图谱均在1415min左右出现特异波峰,对比吸收波峰的面积或高度可确定工程菌产物浓度即PA L活性,见图881Chinese Journal o f Biotechnology 生物工程学报 2006,V ol122,N o12图1 菌落PCR 法鉴定重组阳性克隆Fig.1 The positive clones detected by bacteria clones PCRM:λDNA Hin d Ⅲ+Eco R Ⅰ;30-41:different clones.图2 基因工程菌将PHE 脱氨的产物cin 的HP LC 图谱Fig.2 HP LC analysis of the activity of PA L expression by genetic engineering straina :012mm ol ΠL Cinnam ic acid standard ;b :6mm ol ΠL Cinnam ic acid standard ;c :NZ 9000ΠpNZ 8048-pal nat ;d :NZ 9000ΠpNZ 8048-pal art ;e :NZ 3900ΠpNZ 8149-pal nat ;f :NZ 3900ΠpNZ 8149-pal art .2。