苯丙氨酸解氨酶的测定
苯丙氨酸解氨酶的测定
苯丙氨酸解氨酶的测定一、实验目的利用无土栽培技术培育不同pH下水芹，使用离心技术粗提取苯丙氨酸解氨酶，用分光光度计测不同的吸光值。
二、实验原理无土栽培是用人工配制的培养液，供给植物矿物营养的需要。
离心技术的应用是将样品放入离心机的离心管内，离心机驱动时，样品液就随离心管做匀速圆周运动，于是就产生了一向外的离心力。
由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互间的分离。
分光光度法则是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。
三、仪器与试剂仪器：高速离心机、分光光度计、玻璃瓶、研钵、烧杯、量筒、试管、剪刀和纱布等。
试剂：霍格兰营养液，磷酸缓冲液,0.02mol/L苯丙氨酸,硼酸缓冲液，高锰酸钾材料：水芹幼苗，0.1mol/LNaOH溶液四、操作步骤一、水芹的无土栽培1.配好无土栽培营养液，准备7个玻璃瓶，分别加入15ml营养液。
再加NaOH溶液把玻璃瓶中pH值调成5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，贴上标签。
2.把水芹幼苗从玻璃瓶中取出经过洗净，用高锰酸钾消毒处理后，分别移入盛有营养液的玻璃杯中，放在光照培养箱培养3.定期观察并注意加霍格兰营养液和NaOH溶液使玻璃瓶中pH保持不变。
二、水芹中苯丙氨酸解氨酶的粗提取1.等到水芹大概张到20cm左右，就把它们分别从玻璃瓶中取出，在30℃暗中培养5小时。
然后分别把同一pH值的水芹分别剪成根，茎，叶，根茎，根叶，叶茎，根茎叶七个部分均为0.5g。
2.加预冷的pH7.2磷酸缓冲液5mL，冰浴下充分研磨，均匀混合，用4层纱布过滤。
4000rpm 离心15min，弃沉淀。
获上清液用磷酸缓冲液稀释5倍，作为酶测定的粗提液，置于冰浴下保存备用。
三、水芹中苯丙氨酸解氨酶的吸光度测定设计对照试验：A：取粗水芹酶液0.1mL，加入2.5mL 0.02mol/L苯丙氨酸B：取0.1mL硼酸缓冲液，加入2.5mL 0.02mol/L苯丙氨酸（对照）。
苯丙氨酸解氨酶_PAL_的研究进展_崔建东
食品工业科技
ScienceandTechnologyofFoodIndustry
综 述
苯丙氨酸解氨酶 (PAL)的研究进展
崔建东 , 李 艳 , 牟德华 (河北科技大学生物科学与工程学院 , 河北石家庄 050018)
苯丙氨酸解 氨酶 (Phenylalanineammonialyase, PAL, EC.4.3.1.5)广泛存在于各种植物和少数微生物 中 , 是植物体内次生代谢的关键酶和限速酶 , 在微生 物中可催化 L-苯丙氨酸脱氨生成肉桂酸和氨 。 纯化 后的 PAL可以用于治疗某些肿瘤 [ 1] , 监控苯丙酮尿 患者血浆中的苯丙氨酸含量 , 治疗苯丙酮尿患者[ 2] , 但其主要用途是催化反式肉桂酸转化合成 L-苯丙氨 酸 (L-phenylalanine, L-phe)。 L-phe是合成阿斯巴 甜 (aspartame, APM)的主要原料 , 随着 APM的全球 热销和反式肉桂酸生产成本的降低 , 利用 PAL转化 反式肉桂酸合成 L-phe的方法成为当前生物化工领 域研究的热点 。本文就 PAL的基本特点及近几年的 研究进展作简要介绍 , 重点介绍微生物 PAL的研究 进展 。
3 微生物 PAL研究
1966年 , Ogata等 [ 9] 在研究芳香族氨基酸的微生 物代谢时发现 , 红酵母属中的某些种能以 L-苯丙氨 酸为唯一碳 、氮源生长 , 并在培养基中积累肉桂酸 。 随后 , 该酶相继在其它微生物中被发现 , 主要有霉菌 与酵母菌 。包括[ 10] :链霉菌属 (Streptomyces)、枝孢霉 属 (Cladosporium)、粘 滑 菇 属 (Hebeloma)、鳞 伞 属 (Pholiola)、 鬼 伞 属 (Coprinus)、 共 头 霉 (Symcephalasilrum)、烟熏离褶伞属 (Lyophyllum)、内 孢霉 属 (Endomuces)、曲 霉属 (Asperhilllus)、地霉 属 (Geotricum)、 从 梗 孢 属 (Monilella)、 小 丛 壳 属 (Glomerella)、卵 孢酵母 属 (Oosporidium)、类酵 母属 (Saccharomycodes)、掷酵母属 (Sporidiobolus)。 目前 , 对微生物 PAL的研究主要集中在菌种选育以及提高 PAL活性和稳定性方面 。
保护酶活性测定方法过氧化物酶POD活性测定1酶液的制备
保护酶活性测定方法一、过氧化物酶（POD）活性测定1、酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布过滤，定容至10ml，低温离心（12×104r/min,0~4℃）15min,取上清夜置于低温冰箱备用。
2、试剂：0.05 mol/L pH 5.5磷酸缓冲液0.05 mol/L 愈创木酚溶液（2-甲基酚）20%三氯乙酸溶液2%H2O23、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管4、过氧化物酶活性测定：（1）加入反应混合液2.9 ml磷酸缓冲液1 ml愈创木酚溶液（2-甲基酚）1 ml H2O20.1ml酶液（2）37℃水浴锅中保温15min,迅速转入冰浴，并加入2ml三氯乙酸溶液终止反应（3）过滤，适当稀释。
在470nm处测OD470。
5、结果计算：以每分钟内OD变化0.01为1个酶活力单位。
即酶活力=OD×D / 0.01t酶的比活力= OD×D /（0.01tw）其中：OD为反应时间内吸光度的变化W为材料鲜重t为反应时间D为稀释倍数。
即提取的总酶液为反应系统内酶的倍数二、多酚氧化酶（PPO）活性测定1、酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布过滤，定容至10ml，低温离心（12×104r/min,0~4℃）15min,取上清夜置于低温冰箱备用。
2、试剂：0.05 mol/L pH 5.5磷酸缓冲液0.05mol/L儿茶酚溶液（邻苯二酚）20%三氯乙酸溶液2%H2O23、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管4、多酚氧化酶活性测定：（1）加入反应混合液3.9 ml磷酸缓冲液1 ml 儿茶酚溶液0.1 ml酶液（2）37℃水浴锅中保温15min,迅速转入冰浴，并立即加入2ml三氯乙酸溶液终止反应。
（3）过滤，适当稀释。
苯丙氨酸脱氨酶实验报告
一、实验目的1. 了解苯丙氨酸脱氨酶（Phenylalanine Dehydrogenase，简称PAH）的基本性质和作用。
2. 掌握苯丙氨酸脱氨酶活性的测定方法。
3. 通过实验验证不同条件下苯丙氨酸脱氨酶活性的变化。
二、实验原理苯丙氨酸脱氨酶是一种参与生物体内氨基酸代谢的酶，其活性对于许多生物学过程至关重要。
本实验采用邻苯二胺法测定苯丙氨酸脱氨酶活性。
该方法原理是：苯丙氨酸脱氨酶将苯丙氨酸脱氨后，产生苯丙酮酸，苯丙酮酸在反应中与邻苯二胺反应，生成深蓝色化合物。
该化合物的蓝色深浅与苯丙酮酸的浓度成正比，可以通过分光光度计测量吸光度来测定苯丙酮酸的生成速率，从而计算苯丙氨酸脱氨酶的活性。
三、实验材料1. 实验试剂：苯丙氨酸、邻苯二胺、氢氧化钠、三氯化铁、蒸馏水等。
2. 实验仪器：分光光度计、恒温水浴锅、移液器、试管等。
四、实验方法1. 配制苯丙氨酸溶液：称取苯丙氨酸0.1g，用蒸馏水溶解，定容至100ml，配制成1mg/ml的苯丙氨酸溶液。
2. 配制邻苯二胺溶液：称取邻苯二胺0.1g，用蒸馏水溶解，定容至100ml，配制成1mg/ml的邻苯二胺溶液。
3. 氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠0.5g，用蒸馏水溶解，定容至100ml，配制成5%的氢氧化钠溶液。
4. 三氯化铁溶液：称取三氯化铁0.1g，用蒸馏水溶解，定容至100ml，配制成1%的三氯化铁溶液。
5. 样品处理：取适量样品，用蒸馏水溶解，定容至100ml，配制成一定浓度的样品溶液。
6. 实验步骤：a. 取试管一支，加入苯丙氨酸溶液2ml。
b. 加入样品溶液2ml。
c. 加入邻苯二胺溶液2ml。
d. 加入氢氧化钠溶液2ml。
e. 混匀，置于恒温水浴锅中，在特定温度下反应一定时间。
f. 取出试管，加入三氯化铁溶液1ml。
g. 混匀，用分光光度计在特定波长下测定吸光度。
h. 根据吸光度计算苯丙氨酸脱氨酶活性。
五、实验结果与分析1. 苯丙氨酸脱氨酶活性随温度升高而升高，在50℃时达到峰值，随后随温度升高而降低。
苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定
粗提
硫酸铵沉淀
凝胶层析
离子交换层析
注：（ 1 ）绘制蛋白质测定的标准曲线：以 1~ 5 号管溶液的 A 59 5 值为纵 坐标，相应管中的蛋自质微克数为横坐标，作图。
(2) PAL 比活力计算：
六、注意事项 1. 往酶液中加固体硫酸铵时，注意不能有大颗粒，加的速度也不能过快。 2. 层析柱要保持与地面垂直，往柱内加样品时要小心，避免冲坏床面。 七、思考事项
上样：让胶床表面几乎不留液层，将 l ml 酶液小心注入胶床而中央，注意不要 冲坏床面，吸取 lm ！磷酸盐缓冲液，把吸附在玻璃壁上的沉淀液洗入柱内，在 床表面仅有 lml 左右液层时，再小心地用滴管加入 5 - 6 cm 高的磷酸缓冲液 洗脱。
洗脱收集：取刻度试管 5 支（包括上面一支），编号，柱床上面不断加磷酸盐 缓冲液洗脱，出水口不断用刻度试管收集洗脱液，每管收集 3m1 。
紫外分光光度计预热 lOmin, 于波长 290nm 处测定各管的 A 290 。
(8) 蛋白质测定（考马斯亮蓝染色法）
取酶液 0.I ml ，用蒸馏水稀释至 5ml.
取试管 8 支，按下表加入各溶液：
试管编号 标准蛋白质溶液 ( ml ) 稀释酶液（ mI ）
0 1 2 3 4 5 67 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
材料：供试植物材料
四、操作步骤
（ 1 ）酶液提取 植物材料 lg ，剪成小段，加入 5 倍体积的酶提取液，于冰 浴上研钵研磨。
(2) 将已匀浆的酶液用三层纱布过滤。滤液转入离心管， 10000g 冷冻离心 30 分钟。
(3) 取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积，放置冰浴中备用。
（ 4 ）硫酸铵分级沉淀酶蛋白
1. 在 PAL 活力测定中，设置 0 号管和对照管的目的是什么？
酶活性测定方法
体系一酶和蛋白质提取消过毒的打孔器进行伤口处理后，在每个伤口处添加50μL以下处理：（1）无菌水，对照；（2）浓度为1000μg/mlGA3；（3）浓度为1 ×104 spores/ml P. expansum孢子悬浮液；（4）浓度为1000μg/mlGA3+浓度为1 ×104 spores/ml P. expansum孢子悬浮液。
处理后湿纱布覆盖并用PE塑料膜密封作保湿处理。
贮藏于常温（20-25℃）下。
分别在0、12、24、36和48小时取样进行测定酶活性。
取样时沿伤口用刀小心切下1g果实组织，加入10 mL冷(4℃)的50 mmol/L磷酸缓冲液（PBS）内含1.33 mmol/L EDTA和1% PVPP缓冲液(pH 7.8)。
研钵加入少量液氮预冷后，在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机12000rpm离心15分钟。
取上清液供酶活性和蛋白质含量用。
蛋白质含量测定试验材料和试剂：牛血清白蛋白标准溶液：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL的原液。
8.1.2 蛋白试剂考马斯亮蓝G-250：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。
8.1.3 乙醇；磷酸（85％）。
试验方法：分别取牛血清白蛋白标准溶液（1000μg／mL）0,、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL，无菌水补至100μL，加入考马斯亮蓝G-250试剂5mL，作为标准溶液；分别取标准溶液和上清液（试验7中得到）400μL加到酶标板，以无菌水置零，测定OD595；酶活的测定9.1 试验材料和试剂9.1.1 氮蓝四唑；甲硫氨酸；核黄素；过氧化氢；愈创木酚；邻苯二酚。
9.1.2 Na2HPO4-12H2O；NaH2PO4-2H2O。
9.1.3 磷酸缓冲液PBS配制母液：0.2M Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于1000ml 水；0.2M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 水。
苯丙氨酸解氨酶(PAL)检测试剂盒(苯丙氨酸比色法)
苯丙氨酸解氨酶(PAL)检测试剂盒(苯丙氨酸比色法)简介：苯丙氨酸解氨酶(L－phenylalanine ammonia-lyase，PAL)是催化直接脱掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式桂皮酸的酶。
该酶多存在于高等植物、酵母、菌类可溶性部分物质，是1961年J.Koukol在大麦中发现的，推测其分子量约为，这是一个可把苯丙氨酸用于酚类化合物合成的酶。
在组织中的活性可随外界因素而发生显著变化，用光照、病伤害、植物激素处理等会使活性显著增加。
在多数情况下，在组织中活性增加时，酶发生失活作用，这时组织中具有活性酶的量很快就会减少，据认为这种失活是与类蛋白质物质作用有关。
测定细胞木质素合成途径中间代谢物及关键酶活性，可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。
Leagene苯丙氨酸解氨酶(PAL)检测试剂盒(苯丙氨酸比色法)检测原理是以苯丙氨酸作为底物，在酶促反应的最适条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法，于分光光度计检测吸光度，以吸光度变化所需酶量进行计算。
该试剂盒主要用于植物组织的裂解液或匀浆液、血清等样品中内源性的苯丙氨酸解氨酶活性，尤其适用于检测水果中苯丙氨酸解氨酶活性。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、蒸馏水2、研钵或匀浆器3、离心管或试管4、低温离心机5、水浴锅或恒温箱6、比色杯7、分光光度计操作步骤(仅供参考)：编号名称TE040350TStorage试剂(A):PAL Lysis buffer250ml4℃避光试剂(B):PAL Assay buffer30ml4℃避光试剂(C):PAL终止液5ml RT使用说明书1份1、准备样品：①植物样品：取植物组织或水果中层果肉，加入PAL Lysis buffer，冰浴情况下充分捣碎研磨或匀浆，离心，留取上清液，冻存，用于苯丙氨酸解氨酶的检测。
②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，冻存，用于苯丙氨酸解氨酶的检测。
生物化学实习报告
生物化学实验报告生物化学综合实验摘要：本次实验包括苯丙氨酸解氨酶的纯化及其活性测定和大米粉中营养成分的测定两个实验。
关键词：苯丙氨酸解氨酶、Sephadex G—25层析、DEAE纤维素层析、活力、比活力、大米粉、凯式定氮法、索式提取法、3，5—二硝基水杨酸比色法。
实验一苯丙氨酸解氨酶的纯化及其活性测定一、实验目的1.学习掌握分离纯化生物大分子的方法；2.学习掌握酶活性的测定方法；3.了解在分离纯化过程中酶活性的变化；4.了解高速冷冻离心机及蛋白质检测仪的操作步骤。
二、实验原理苯丙氨酸解氨酶（L—phenylalanine: ammonia lyase,简称PAL；EC4.3.1.5）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切相关，在植物生长发育和抵制病菌侵害过程中起重要作用。
PAL催化L—苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值。
规定1h 内增加0.01为PAL的一个活力单位。
酶的比活力是指样品中每毫克蛋白质所含的酶活力单位数。
在实验中将会看到随着PAL的逐步被纯化，其比活力也在逐步增加。
在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠等）使蛋白质沉淀析出称为盐析。
溶液的盐浓度通常以盐溶液的饱和度表示，饱和溶液称100%饱和度。
沉淀一种酶所需的具体浓度需要经实验确定。
Sephadex(交联葡萄糖凝胶)是有细菌葡聚糖长连，用交联剂1—氯2—，3—环氯丙烷交联而成。
凝胶商品名后面的G值表示每克干胶吸水量（毫升数）的10倍。
交联度大，网孔小；交联度小，网孔大。
交联度的大小还与凝胶颗粒的机械强度有关，交联度大，机械强度也大（硬胶），在柱层析中流速快。
根据需要，选用一定型号的的凝胶柱做柱层析介质（蛋白脱盐一般用G—25或G—50，G—100~G—200分离不同分子质量的蛋白组分）。
由于被分离物质的分子大小和形状不同，分子质量大的进入凝胶网孔中被阻滞，从而后流出层析住，达到分离的目的。
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B：取 0.1mL 硼酸缓冲液，加入 2.5mL 0.02mol/L 苯丙氨酸（对照）。 室温下反应 10min 后，分别测两瓶在 290nm 处的吸光值。
水芹各个部分吸光值（290nm）
5
5.5
6
试管编号（pH 值）
根
茎
苯丙氨酸解氨酶的测定
一、实验目的
利用无土栽培技术培育不同 pH 下水芹，使用离心技术粗提取苯丙氨酸解氨酶，用分光光 度计测不同的吸光值。
二、实验原理
无土栽 培是用人工配制的培养液，供给植物矿物营养的需要。 离心技术的应用是将样品放入离心机的离心管内，离心机驱动时，样品液就随离心管做匀速 圆周运动，于是就产生了一向外的离心力。由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此 各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互间的分离。 分光光度法则是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进 行定性和定量分析。
叶
根茎
根叶
叶茎
根茎叶
营养液：霍格兰营养液 磷酸缓冲液: 硼酸缓冲液：
6.5
7
7.5
8
三、实验仪器与试剂
仪器：高速离心机、分光光度计、玻璃瓶、研钵、烧杯、量筒、试管、剪刀和纱布等。 试剂：霍格兰营养液，磷酸缓冲液,0.02mol/L 苯丙氨酸,硼酸缓冲液，高锰酸钾 材料：水芹幼苗，0.1mol/LNaOH 溶液
四、实验步骤
一、水芹的无土栽培 1.配好无土栽培营养液，准备 7 个玻璃瓶，分别加入 15ml 营养液。再加 NaOH 溶液把玻璃 瓶中 pH 值调成 5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，贴上标签。 2.把水芹幼苗从玻璃瓶中取出经过洗净，用高锰酸钾消毒处理后，分别移入盛有营养液的玻 璃杯中，放在光照培养箱培养 3.定期观察并注意加霍格兰营养液和 NaOH 溶液使玻璃瓶中 pH 保持不变。 二、水芹中苯丙氨酸解氨酶的粗提取 1.等到水芹大概张到 20cm 左右，就把它们分别从玻璃瓶中取出，在 30℃暗中培养 5 小时。 然后分别把同一 pH 值的水芹分别剪成根，茎，叶，根茎，根叶，叶茎，根茎叶七个部分均 为 0.5g。 2.加预冷的 pH7.2 磷酸缓冲液 5mL，冰浴下充分研磨，均匀混合，用 4 层纱布过滤。4000rpm 离心 15min，弃沉淀。获上清液用磷酸缓冲液稀释 5 倍，作为酶测定的粗提液，置于冰浴下 保存备用。 三、水芹中苯丙氨酸解氨酶的吸光度测定 设计对照试验：