酿酒酵母质粒的提取
酿酒酵母的分离纯化 - 副本
酿酒酵母的筛选流程图
调查发现 开发设计 采集样品 增殖培养 （或富集）
筛选（初筛、复筛）
原种斜面
纯种分离
通过筛选的菌种斜面
性能鉴定
育种出发菌
菌种保藏机构提供的纯种斜面
菌种保藏
材料与仪器 低温保藏的酿酒酵母，麦芽汁培养基 9个平板、6支大试管、6支小试管、吸管（1ml、10ml）、 涂布棒、三角瓶等待用
3 耐酸酵母菌株的相对生活力测试：将供试的各酵母菌 株，分别接种于pH值相同的麦芽汁培养基，培养测定选出 的各酵母菌株在特定pH值条件下生活力的差异性，选择生 长较好的菌株作后继供试菌株。
•
4 耐酸酵母菌株的发酵环境生态适应性测试：将选出的 耐酸酵母菌与其他非耐酸酵母菌，作混菌对比培养，选择 相对生活力强、种群密度大的耐酸酵母菌株作后继供试菌 株。 • 5 耐酸酵母菌株的生产性能测试：将选出的各耐酸酵母 菌株，分别接种于常规酒精发酵培养基中。培养3d~6d后， 定时观察、测定产酒情况、产酒与pH值变化的相关性，了 解各酵母菌株的生产性能。
试验方法 • 1、酵母菌的分离接种 • 2、耐酸酵母菌的分离与筛选 • 3、性能鉴定
准备试验 • （1）将实验所用的9个平板、6支大试管、6支小试管、吸 管（1ml、10ml）、涂布棒、三角瓶等干杀待用 （2）用100ml容量瓶配制质量浓度为0.9%的生理盐水，分 装入6支大试管，各9ml，121℃高压湿热灭菌15min • （3）称取麦芽汁琼脂粉8g溶解至约200ml，加热煮沸， 分装，121℃高压湿热灭菌15min • （4）将湿热灭菌后的麦芽汁琼脂加热溶解冷却至约 50~60℃，倒平板，9个板，每个约15ml；倒小试管，每 管约5ml，制作斜面
酵母的筛选 • 酵母菌在长期的白酒发酵生产过程中因不断的生长繁殖， 将产生一定量的自发突变，一旦“耐酸突变”发生，耐酸 突变个体因“自然选择与适应”，将出现并存活于窖底泥、 黄浆水等低pH值环境中；因此，采用酸度呈梯度差异的 选择培养基，利用微生物学、遗传学等的相关原理与技术 方法，通过菌种的分离、纯化、扩培以及筛选、鉴定等相 关试验，以pH值呈梯度差异的培养基为选择条件，进行 了酵母菌的筛选。
酿酒酵母载体质粒
酿酒酵母载体质粒
酿酒酵母载体质粒是指用于将目的基因引入酿酒酵母细胞中的质粒。
质粒是一种环状的双链DNA分子，可独立于染色体存
在并繁殖。
酿酒酵母载体质粒通常包含以下元素：
1. 原核起始子（promoter）：用于启动目的基因的转录，使其
产生蛋白质。
2. 选择性标记基因（selectable marker gene）：常用的选择性
标记基因包括对抗生素的抗性基因（如抗生素抗性基因）或与缺失酵母株的互补基因（如RNA聚合酶II基因）。
选择性标
记基因能够在酵母细胞中提供抗性，使得只有表达该基因的转化细胞能够生长。
3. 多克隆位点（multiple cloning site，MCS）：用于将目的基
因插入质粒中，一般由多个限制性内切酶切割位点组成，方便将外源基因插入质粒。
4. 酿酒酵母起始子（promoter）：用于应用在酿酒酵母细胞中
工作的目的基因。
5. 终止子（terminator）：用于终止目的基因的转录。
通过插入目的基因到酿酒酵母载体质粒中，并经由转化等方法将质粒引入酿酒酵母细胞中，可以使得酵母细胞表达目的基因，从而进行相应的功能研究和应用实验。
这种酿酒酵母载体质粒在酿酒酵母遗传工程中起到了重要作用。
质粒的酿酒酵母转化实验报告
酿酒酵母转化实验报告摘要本文介绍了酿酒酵母转化实验的实验步骤和实验结果。
首先，介绍了实验所使用的材料和器材，以及实验的准备步骤，包括菌株的提取、培养基的种植和抗生素的添加等。
其次，介绍了质粒转化的步骤，包括提取质粒、构建质粒等。
最后，介绍了实验结果，包括质粒转化后酵母菌株的抗性检测和质粒转化效率的估算等。
关键词：酿酒酵母，质粒转化，抗性检测，质粒转化效率1. 实验简介酿酒酵母转化实验是一种常用的基因工程实验，它是将外源基因转入酿酒酵母中，以改变酵母的生理特性和功能的一种方法。
通过质粒转化，可以将外源基因转入酿酒酵母，从而改变酵母的生理特性和功能，为酿酒酵母的改良和研究提供了便利。
2. 实验材料和器材（1）材料：酿酒酵母菌株，质粒，抗生素，营养培养基，细胞溶解剂；（2）器材：离心机，离心管，烧杯，热水浴，烧杯架，离心瓶，烧杯支架，温度控制器，离心管支架，摇床，培养箱等。
3. 实验步骤（1）菌株提取：将酿酒酵母菌株放入营养培养基中，摇床培养24小时，然后用离心机离心提取菌液；（2）培养基种植：将菌液滴入营养培养基中，放入培养箱培养24小时；（3）抗生素添加：将抗生素添加到营养培养基中，放入培养箱培养24小时；（4）质粒提取：将质粒放入烧杯中，加入细胞溶解剂，热水浴溶解，然后用离心机离心；（5）构建质粒：将质粒和菌液混合，放入烧杯中，加入CaCl2，放入热水浴37℃反应30min，然后用离心机离心；（6）质粒转化：将离心后的质粒液滴入培养基中，放入培养箱培养24小时；（7）抗性检测：将质粒转化后的酵母菌株放入营养培养基中，添加抗生素，放入培养箱培养24小时，观察菌株是否有抗性。
4. 实验结果（1）质粒转化后酵母菌株具有抗性：质粒转化后的酵母菌株在抗生素的作用下仍能够正常生长，表明质粒转化后的酵母菌株具有抗性。
（2）质粒转化效率估算：通过对质粒转化后的酵母菌株的抗性检测，估算出质粒转化的效率为85%。
5. 结论通过本实验，我们可以得出结论：酿酒酵母质粒转化实验成功，质粒转化后的酵母菌株具有抗性，质粒转化效率估算为85%。
酿酒 分离
酿酒过程中的酵母分离是一个关键步骤，它确保了酿造过程中使用的是纯净且适合特定酒种的酵母菌株。
以下是一些酿酒酵母分离的基本步骤和注意事项：
1. 样品采集：酿酒酵母通常来源于发酵液、酒糟或酵母泥。
采集样品时，应确保工具的无菌操作，避免污染。
2. 分离纯化：将采集的样品进行适当的稀释，然后取一定量涂布于选择性培养基上，如YEPD培养基，这是一种常用的富集培养基。
在适当的温度（通常是28℃）下培养几天，以便酵母生长形成单菌落。
3. 单菌落挑选：在培养基上，挑选出不同的单菌落，这可以通过观察菌落的颜色、形状和质地来初步判断酵母的种类。
4. 形态鉴定：将挑选出的单菌落接种到WL鉴别培养基上，进一步观察和鉴定。
酿酒酵母在WL培养基上通常呈现为奶油色带有绿色、不透明，形状为球形、光滑、突起。
5. 生理生化测试：进行一系列的生理生化测试，以确定酵母的种属。
这些测试包括发酵能力、产生酒精的类型和数量、对不同碳源和氮源的利用等。
6. 分子生物学鉴定：为了更准确地鉴定酵母菌株，可以采用分子生物学方法，如PCR和DNA测序，分析其核糖体RNA（rRNA）或内部转录间隔区（ITS）等基因序列。
7. 保存与应用：经过鉴定和性能测试的酵母菌株可以保存于-4℃的冰箱中，用于未来的酿造。
在实际酿造过程中，根据酵母的特性选择合适的接种量和发酵条件。
在整个分离和纯化过程中，无菌操作是关键，避免任何外来的污染。
此外，记录所有的操作步骤和结果也是非常重要的，以便于后续的跟踪和分析。
在酵母的应用上，还需考虑其对酿造条件的适应性，以及是否能产生期望的风味特征。
质粒提取总结(原理、小提、中提、浓度测定)
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质粒提取总结(原理、小提、中提、浓度测定)
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很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。
酵母质粒的提取注意事项
酵母质粒的提取注意事项1. 实验前准备在进行酵母质粒提取实验之前，需要准备好所需材料和试剂。
常用的材料包括酵母培养物、细胞裂解液、酶切酶、离心管、离心机等。
试剂方面，需要注意购买高质量的试剂，并按照说明书的要求保存和使用。
2. 细胞培养与处理在进行酵母质粒提取实验之前，需要进行酵母菌的培养和处理。
首先，将酵母菌接种到含有所需培养基的琼脂糖平板上，培养一夜，然后挑取单个菌落转移到液体培养基中，继续培养至所需菌量。
此外，在进行酵母菌细胞处理时，需要注意细胞浓度的控制，避免浓度过高或过低对实验结果产生影响。
3. 细胞裂解与质粒提取酵母菌细胞裂解是酵母质粒提取的重要步骤。
一般情况下，细胞裂解可通过化学方法、机械方法或酶解方法实现。
其中，酶解方法常用于酵母菌质粒提取，具有操作简单、效果较好的特点。
在进行细胞裂解时，需要注意裂解液的选择和浓度，以及裂解时间和温度的控制，以确保细胞完全裂解，质粒DNA充分释放。
4. 质粒DNA纯化与保存在进行质粒提取后，需要对提取得到的质粒DNA进行纯化和保存。
纯化可以通过酚/氯仿法、硅胶柱纯化法或商用质粒纯化试剂盒等方法实现。
在选择纯化方法时，需要根据实验要求和样品特点进行选择，并根据说明书的要求进行操作。
纯化后的质粒DNA应及时保存，可以用TE缓冲液稀释保存在-20°C或-80°C的冰箱中，以避免质粒DNA的降解和损失。
5. 实验操作注意事项在进行酵母质粒提取实验时，还需要注意以下几点操作事项：- 实验室操作要严格遵守无菌操作的要求，以避免外源性DNA的污染。
- 实验过程中注意个人防护，佩戴手套、口罩和实验服，避免实验中的化学品对身体造成伤害。
- 实验前应仔细阅读所用试剂的说明书，了解其性质和使用方法，按照要求准确称取和调配试剂。
- 实验中的离心操作要注意离心管的放置位置和离心速度的选择，以避免样品的溢出和离心管的破裂。
- 实验后要及时清洗实验台面和相关器材，保持实验环境的整洁和无菌。
一种快速、有效、经济的提取酵母质粒的方法
一种快速、有效、经济的提取酵母质粒的方法
熊福银;林艳丽;吴晓洁;周艳荣;邓继先;陈红星
【期刊名称】《生物技术通讯》
【年(卷),期】2009(20)3
【摘要】目的:建立一种经济有效、快速简便、稳定的提取酵母质粒的方法.方法:用葡糖苷酸酶消化酵母细胞壁以获取原生质体,然后采用碱裂解法裂解原生质体以获得质粒.结果:与采用商品化离心柱法试剂盒所提取的质粒相比,用该法获取的酵母质粒在PCR分析及转化效果方面没有差异.结论:建立了一种经济有效、快速简便、稳定的提取酵母质粒的方法.
【总页数】2页(P386-387)
【作者】熊福银;林艳丽;吴晓洁;周艳荣;邓继先;陈红星
【作者单位】军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北
京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
【相关文献】
1.一种快速高效提取酵母质粒的方法 [J], 张怡;刘坤;曹鹏;魏森;韦丹丹;杜建;李鹏坤;李成伟
2.一种快速提取质粒DNA鉴别重组克隆的方法 [J], 何冬兰;余金龙;邵坤彦;邵洁云
3.一种快速提取质粒DNA用于鉴别重组克隆的方法 [J], 郭旭东;毛舒燕;侯冬霞;旭日干
4.一种简便的适用于酵母双杂交系统的酵母质粒提取方法 [J], 苑丽娜;王定和;王永杰;郭佳;单卫星
5.一种从酵母菌转化子中分离、检测重组质粒的有效方法 [J], 刘巍峰;高东
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质粒抽提的8大窍门
质粒抽提的8大窍门时间：2010-02-04 09:42:01 来源：作者：点击：480次1、摇菌时间过夜培养是一个普遍接受的概念，而且适合大部分情况。
如果出现了问题，调整培养时间会有帮助：Nick 多，则增加培养时间；酶切出现问题，则减少培养时间。
2、起始菌体量大家习惯说“从多少 ml 菌液中抽提质粒”，但一定要养成每次都观察菌体量的习惯，因为质粒毕竟是在菌体中，而且，抽提质粒所用的试剂量，都只与菌体量有关。
3、菌体的彻底悬浮如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在溶液 II 加入后，变成一个外围几乎彻底裂解，往里不完全裂解，中间没有裂解的团块。
这个团块在溶液 III 加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。
4、使用相对过量的试剂这是适合所有核酸抽提的建议。
试剂相对过量的好处是：稳定性好，纯度高，操作更简单。
如果认为这样不经济，就少用一点菌体。
5、裂解时间加入溶液 II 后，混匀，体系最好能立即变得清澈。
体系如果变得清澈了，马上加入溶液 III 中和。
如果体系不马上变清澈，下次少用一点菌液，或者多用一点溶液。
如今的质粒设计得越来越复杂了，奇怪的现象也越来越多，而所有的奇怪现象，多与裂解时间有关。
6、中和的操作在1.5ml离心管中加入溶液 III 后，先颠倒两次，使管底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。
效果非常好。
7、中和后的离心去蛋白一定要将蛋白质彻底离心下去。
如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面，继续离心的效果并不好；而将上清倒入另外一个离心管中，再离心，效果要好许多。
【降低 RNA 残留的方法】RNA的去除，首先是使用 RNase 消化。
在溶液 I 中加入高浓度的 RNase A (100ug/ml)，或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的质粒，都可以降低 RNA残留，但都不能彻底去除。
幸运的是，RNA 的残留并不影响酶切等最常用的用途。
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酿酒酵母质粒的提取
酵母细胞的细胞壁比较厚，不容易破壁，不如大肠杆菌的质粒容易提取，最近做了些酿酒酵母的实验，从酿酒酵母中提取质粒，现在就总结下实验的方法和步骤。
一、酵母细胞质粒提取步骤：
1、接种单菌落(待检测酵母细胞)于25mLYNB(补加氨基酸营养物)培养基中，30℃振荡培养过夜。
2、第二天取一滴菌液于进行显微镜下观察,目镜用16,物镜用40倍观察细胞壁破碎前的状态,其成杆状,流动性比较下。
3、取10ml的培养酵母菌液,5000g离心3min,弃上清液.加入5ml 的1倍TE悬浮。
4、将悬浮液倒入高压破壁仪的样品管中,利用高压破碎机进行破碎细胞壁,压力加到20Mpa,停留15s,降压,反复来回压3次.取出细胞液,取一滴于显微镜下观察,如果细胞呈不规则的球状时,而且其流动性比较大,说明其细胞壁已经破碎成为原生质体。
5、取2个EP管,每管加入1.5ml上述的细胞液,12000g离心5min,收集原生质体.弃取上清液,每管加入300ul10%的SDS溶液,混匀冰浴5min,进行破原生质体。
6、然后加入150ul的tris饱和酚,和150ul的卤仿异戊醇混合液(卤仿:异戊醇=24:1),混匀,12000g,离心10min。
7、将水相移到另一EP管中,加入等体积的卤仿异戊醇混合液(卤仿:异戊醇=24:1), 混匀,12000g,离心10min。
8、将水相移到另一EP管中,加入1/10体积的3M KAC溶液和2倍体积的无水乙醇,放入-20℃冰箱中。
9、1h,12000g离心10min,倒出乙醇,等干燥后加入1ml的70%的无水乙醇,混匀,12000g,离心10min。
10、弃去乙醇,等室温干燥后,每管加入20ul的TE溶液(如要去处RNA酶,加入1ul的100mg/ml浓度的RNA酶),放入-20℃冰箱即可。
11、跑电泳进行检测是否从酵母菌中提出质粒了。