原生质体制备方法
原生质体制备
拟南芥原生质体制备转化方法选取开花前生长良好情况的拟南芥（Columbia型）叶片，用刀片切成0.5-1 mm宽的叶条；浸于配置好的酶解液中（每5-10 mL酶解液约10-20片叶子）；暗箱抽真空，30 min；转移至室温，继续黑暗酶解3-5 h；当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放；加入等量的W5溶液稀释酶解液；用60-100目筛子（W5溶液润湿）过滤酶解液；将滤液转移至30 mL eppendorf管，500-700 g离心1-2 min，弃上清；加入10 mL预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体；放于冰上静置30 min；保持室温在23℃以下；500 g离心8-10 min，弃上清；加入1 mL MMG溶液重悬原生质体（使其终浓度约在2×105个/mL）；即得到原生质体溶液。
用移液器吸取100 L的以上原生质体溶液于1.5 mL eppendorf管，加入10L DNA（10-20 g的质粒DNA），轻柔混合后，加入110 L PEG溶液，轻柔拍打eppendorf管使其混合完全；室温下诱导转化5-15 min；加入400-440 L W5溶液稀释转化混合液，轻柔颠倒，使之混合完好以终止转化反应；500 g离心2 min，弃上清；加入1 mL W5溶液悬浮清洗，500 g 离心2 min，弃上清；再用1 mL WI溶液轻柔重悬原生质体；室温（20-25℃）下，诱导载体表达18小时以上。
相关溶液配制PEG4000溶液（现用现配）组分用量PEG4000 1 g1 M CaCl20.25 mL0.8甘露醇0.625 mL水0.75 mL纤维素酶解液试剂15 mL酶液体系1-1.5 % Cellulase R10 (YaKult Honsha) 0.225 g 纤维素酶0.2-0.4 % Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 0.045 g 果胶酶0.4 M 甘露醇 1.09 g甘露醇干粉20 mM KCl 1 mL 0.3 M KCl20 mM MES, pH5.7 1 mL 0.3 M MES，pH5.7加水10 mL55℃水浴加热10 min，冷却至室温后加入以下试剂10 mM CaCl2 1 mL 0.15 M CaCl20.1% BSA 1 mL 1.5 % BSA5 mM β-巯基乙醇1mL 75 mM β-巯基乙醇用0.45 m滤膜过滤后即可使用。
一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究
一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究
材料准备：
内生真菌菌株
无菌工作台和器具（如培养皿、显微镜片、移液器等）无菌培养基（如琼脂、乳糖酸钠琼脂培养基等）
无菌培养液（如培养基溶液）
去离子水或无菌PBS缓冲液
培养基制备：
根据内生真菌的要求配制适宜的无菌培养基。
煮沸溶液中加入琼脂，并搅拌至溶解。
转移至培养器并加盖，进行高压灭菌。
菌种处理：
在无菌条件下，将内生真菌分离出来。
用无菌培养液或去离子水洗涤菌株，去除杂质。
原生质体制备：
将清洗后的菌株转移到含有少量无菌培养液的培养皿中。
用显微镜检查，确保菌株没有受到污染。
在无菌条件下，用移液器将菌株转移到新的培养皿中。
将培养皿置于振荡器中，以帮助分离真菌的原生质体。
过一段时间后，观察原生质体的形成情况。
原生质体再生：
将形成的原生质体转移到含有适宜培养基的培养皿中。
在适宜的温度（一般为25-30摄氏度）下，进行培养。
定期观察并记录原生质体再生的过程。
根据需要，可以进行进一步的培养和分离。
水稻原生质体制备及转化方法
原生质体制备及转化1.去皮的日本晴种子在75%的酒精中消毒1 min。
然后用2.5%的次氯酸钠消毒20 min。
用无菌水洗至少5次，然后在1/2 MS培养基上，12 h光照（大约150umol m-1 s-1）十二小时黑暗，26 ℃培养7-10天，提前一天烧好去尖的黄蓝枪头备用。
2.取40-60棵水稻幼苗的茎和叶鞘的绿色组织。
3.将一捆水稻植株（大概10棵幼苗）用剃刀一起切成大约0.5 mm的小段。
4.将小片段立刻放进0.6 M的甘露醇中，黑暗中放置10 min。
5.用100目钢制滤网去掉甘露醇，将小片段放在加入15mL酶液的25mL锥形瓶中，（1.5% Cellulase RS，0.75% Macerozyme R-10，0.6 M甘露醇，pH5.7的10mM MES，10mM CaCl2，0.1% BSA），28℃摇床中轻轻摇晃（50rpm），黑暗孵育4-6 h。
6.此时配置40%的PEG4000，酶消化后，分三次加入等体积15mL的W5溶液（154 mM NaCl，125mM CaCl2,5 mM KCl，pH 5.7的2mM MES）。
用手充分摇晃10s。
7.用400目钢制滤网过滤得到原生质体在圆底管中。
8.80g离心（升降速度设为1档）5min，缓慢吸走上清液。
9.沿壁缓慢加入4mL W5溶液，轻轻悬浮，再离心80g，5min，弃上清10.沿壁缓慢加入4mL Mmg溶液，离心80g，5min，弃上清11.再加Mmg溶液，补至每个样品100μl原生质体12.分装2mL离心管，每100μl原生质体，加入20μl质粒和120μl新鲜制备的40%的PEG4000，混匀13.28℃避光静置转化20--25min14.加1.5 mL W5溶液混匀，80g离心3min，弃上清。
15.重复步骤1416.加2mL W5溶液重悬，轻轻混匀，移到细胞培养板，锡箔纸包裹避光28℃避光静置培养15-20小时17.培养完成后，将培养板中沉淀的原生质体轻轻混匀，吸到2 mL离心管中，80g离心3min，弃上清，保留100μl上清液18.共聚焦显微镜观察拍照配制溶液方法：酶液W5溶液MMG溶液PEG(5mL)。
原生质体制备
原生质体的制备：1、选取3-4周长势良好的植株的展开叶片（通常选取第5~7片真叶）。
2、用新的锋利的刀子从叶片的中部切0.5-1 mm叶条，比较理想的情况下，每克新鲜叶片中大约含有107个原生质体（大约100-150个叶条在5-10 ml酶溶液中消化）。
对于常规实验，10-20个叶条消化在5-10 ml酶溶液中将得到0.5-1×106个原生质体，足够25-100个样品使用。
3、快速而温柔的转移叶条到准备好的酶溶液中（10-20叶条在5-10 ml酶液中），用平头镊子将叶条完全淹没。
4、用真空泵将叶条在黑暗中真空30 min。
5、室温下在黑暗中至少消化3 h（继续消化，不要摇晃）。
经过轻微转动后酶溶液应该变成绿色，这表明原生质体已经被释放。
6、用显微镜检查原生质体的释放（拟南芥叶肉的原生质体的大小大约为30-50μm）。
7、用等体积的W5溶液稀释酶溶液，通过过滤去除没有消化的叶片组织。
8、用水洗去75 μm尼龙过滤器中的酒精（通常浸泡在95%乙醇中）并去除过量的水，用W5溶液润洗过滤器后过滤原生质体。
9、将原生质体溶液转移到30 mL圆底离心管中，100×g离心5 min，尽可能的去除上清液。
10、用计数板进行细胞计数，每2×105个原生质体加入1 mL W5溶液，在冰，上静置30 min。
11、室温下沉降原生质体15 min，去除W5溶液，每2×105个原生质体加入1 mL MMG溶液重悬浮。
12、在2 mL离心管中分别加入10 mL DNA（5-10 kb的质粒DNA 10-20 mg）和100 mL原生质体（2×104个原生质体细胞），轻轻混匀。
13、加入110 mL PEG溶液，轻弹试管完全混匀。
14、室温下孵育转染混合物15 min（反应5 min足够）。
15、室温下，用400-440 mL W5溶液稀释转染混合物，轻轻摇动或倒置离心管混匀来停止转染过程。
原生质体的制备
原生质体的制备
稳渗剂：0.6 mol/L甘露醇，121 ℃高温高压灭菌20 min后备用。
2%溶壁酶：在无菌操作台中称取溶壁酶（广东省微生物研究所生产），加入灭菌过的稳渗剂（甘露醇0.6 mol/L），最终使酶液浓度达到2%，再用0.22 µm 滤膜过滤除菌待用。
（观察锁状联合）乳酸石炭酸棉蓝染色液：石炭酸10 g，棉蓝0.02 g，甘油20 mL，乳酸10 mL，蒸馏水10 mL，将石炭酸加入蒸馏水中加热融化，之后加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解备用。
原生质体制备
(1)将杏鲍菇菌丝接种于固体PDA培养基中，25℃培养5-7 d。
(2)活化后的菌丝接入液体PDA培养基中，25℃，120 rmp摇床培养5-6 d。
(3)将菌丝球倒入50 mL离心管中，10000 rpm 离心10 min，倒去上清液，再用无菌水、甘露醇各离心清洗一次。
(4)用灭菌滤纸吸干菌丝水分，称取0.2 g 菌丝放入10 ml 离心管中，再加入2 mL 2％浓度的溶壁酶，30℃水浴2-2.5 h，每隔1 h镜检破壁情况。
(5) 加入6mL甘露醇混匀，终止酶解。
800 rpm离心5 min，用移液枪小心转移上清酶液至新的10毫升离心管，再用0.6 mol/L甘露醇离心离心清洗一次（4000 rpm，15 min），液体再生培养基离心清洗一次（4000 rpm，15 min）。
植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理是利用生物学方法将植物细胞的质膜和细胞壁打破，使得细胞质与细胞器分离，获得纯净的细胞质。
具体制备原理如下：
1. 选择新鲜的植物组织，例如嫩叶片、根尖等，并将其切碎。
2. 将切碎的组织置于适当的缓冲液中，缓冲液中含有维持细胞渗透压的某些成分，如蔗糖。
3. 经过一定时间的培养，细胞内的质膜和细胞壁会被渗透液逐渐分解，从而使细胞质暴露在外。
4. 使用过滤纸或细孔滤网将悬浊液过滤，以去除细胞壁碎片和其他杂质。
5. 对滤液进行离心，以分离更纯净的细胞质。
6. 最后，将分离得到的细胞质保存在低温条件下，或进行后续的实验操作。
通过上述步骤，就可以制备得到植物原生质体，供后续的生物学研究和实验使用。
一种酵母原生质体的制备方法
一种酵母原生质体的制备方法
酵母原生质体是指从酵母细胞内部提取出来的膜包裹的细胞质部分，它是细胞质膜结构和功能的重要载体，可以用于进行酵母细胞的功能研究和酵母基因工程。
酵母原生质体的制备方法主要包括以下几个步骤：
1.酵母培养
首先，选择合适的酵母菌株进行培养，培养条件包括适宜的培养基、温度和营养条件。
常见的酵母菌株包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和模式酵母(Schizosaccharomyces pombe)等。
2.酵母细胞收获
当酵母菌培养到合适的生长阶段时，可以通过离心的方法将酵母细胞从培养液中分离出来。
离心一般使用低速(1000g)离心5-10分钟，沉淀下的酵母细胞就是我们需要的起始材料。
3.细胞破碎
将收获的酵母细胞重悬于适量的缓冲液中，如Tris-HCl缓冲液。
加入几滴苯甲酸醛溶液，使酵母细胞变性，同时加入玻璃珠或砂石进行机械破碎。
破碎条件可以根据不同的酵母菌株进行优化，一般破碎时间为5-15分钟。
4.细胞裂解
5.膜分离
将第二次离心得到的沉淀进行再次重悬于适量的缓冲液中，加入适量的D-葡萄糖和抗生素等，使其在37摄氏度下进行孵育。
由于酵母细胞的膜是整个原生质体的重要组成部分，通过孵育使得母细胞膜融合，形成完整的原生质体。
孵育时间一般为30-60分钟。
6.原生质体提取
需要注意的是，上述制备方法中的条件和步骤可以根据不同的实验目的进行优化和调整。
此外，酵母原生质体的制备是一个相对复杂的过程，对实验技术要求较高，需要注意避免样品污染和抗体交叉反应等问题。
植物原生质体的制备
在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。
常用的两种系统为：①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0．40～0．80mol／L。
本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；②盐溶液系统：包括KCL、MgSO4和KH2PO4等。
其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。
另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。
近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。
通常在酶液中使用的等渗剂为0．55～0．6mol甘露醇。
原始pH值提高到7．0时生活的原生质体数量进一步增加，损伤的原生质体也少得多。
原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法，步骤大致如下：
1．将原生质体混合液经筛孔大小为40－100um的滤网过滤，以除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤液。
2．将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬浮在上清液中为准，一般以500r／min离心15min。
用吸管谨慎地吸会上清液。
3．将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中（除不含酶外，其他成分和酶液相同），再次离心，去上清液，如此重复三次。
4．用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进行培养。
一般原生质体的培养密度为104～106／ml。
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原生质体制备方法
培养基：
①PDA：200g土豆、20g葡萄糖、20g琼脂、1L水
②MYG液体培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、1L水、
③MYG液体再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、蔗糖、1L水、
④MYG软再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡糖糖、8g琼脂粉、蔗糖、试剂：
①1mol/L MgSO4
②L MgSO4
③STC：山梨醇、50mM Tris-Hcl（）、50mM CaCl2
④肝素
⑤SPTC：山梨醇、40% PEG、50mM Tris-Hcl（）、50mM CaCl2
⑥无菌水
操作步骤：
①倒若干PDA平板，将GF-WT接入PDA平板，23℃，活化5-7days
②用无菌黄枪头在GF-WT平板上打孔，用长牙签挑出4个菌饼接入50ml/瓶的MYG
液体培养基中，120rmp，28℃，12h
③以10%的接种量接5瓶以上50ml/瓶的MYG液体培养基中，60rpm，28℃，16h
④混有大量悬浮菌丝的培养基用无菌的带有三层擦镜纸的漏斗过滤下来，用无菌
水和1mol/L MgSO4各冲洗三次，菌丝发白即可，冰上备用
⑤酶解体系的配制：取Dryslase 45mg+Yartlase105mg至无菌量管中，用10ml
1mol/L MgSO4溶解彻底，用无菌滤头和针筒过滤除菌，滤液保存于冰上
⑥1g菌丝加入到10ml酶解体系中，于无菌三角瓶中进行酶解反应，30℃，60rpm，
3h
⑦用带有无菌滤布的漏斗过滤酶解液，滤液用无菌50ml大管收集，用20ml L MgSO4
冲洗三角瓶和漏斗，3500rpm，10min，取上清
⑧沉淀用20ml STC溶解悬浮，3500rpm，10min，取上清
⑨沉淀下来的原生质体用800μL STC溶液悬浮，并加入200μL的SPTC溶液，加
入SPTC时一滴一滴加，混匀后镜检计数，大于107可用，冰上备用。