新无标记基因敲除系统的构建
基因敲除技术的方法
基因敲除技术的方法
基因敲除技术是一种利用CRISPR-Cas9系统对细胞基因进行定向编辑和删除的新技术。
该技术可以帮助研究人员研究基因功能和疾病发生机制，以及开发新的治疗方法。
基因敲除技术的方法主要包括以下几个步骤：
1. 设计sgRNA：首先需要选择待敲除的基因，然后设计合适的sgRNA序列。
sgRNA是一种小RNA分子，能够将Cas9蛋白精确地指向目标基因，并切割该基因的DNA序列。
2. 转染sgRNA和Cas9：将sgRNA和Cas9蛋白导入目标细胞中。
通常采用的方法有脂质体转染、电穿孔转染等。
3. 筛选细胞：利用细胞内的修复机制，CRISPR-Cas9系统会在目标基因处切割DNA序列，并引起细胞的修复。
通过筛选，可以获得已经敲除目标基因的细胞。
4. 鉴定敲除效果：可以采用PCR、Western blot、qPCR等技术检测目标基因是否已被完全删除。
通过基因敲除技术，研究者能够研究目标基因对某种生物功能的影响，以及对疾病发生的贡献。
这一技术被广泛应用于生命科学研究领域，并在基因治疗等领域也具有广阔的应用前景。
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基因敲除沉默细胞构建流程
基因敲除沉默细胞构建流程一、细胞选择。
咱得先挑个合适的细胞呀。
就像挑衣服一样，得根据自己的需求来。
如果是研究某种疾病相关的基因，那可能就选和这个疾病有联系的细胞类型。
比如说要是研究癌症相关基因，癌细胞系就比较合适啦。
这个细胞呢，还得状态好，要是细胞本身就病恹恹的，那后面的实验肯定也不好做。
而且细胞的来源也要靠谱，可不能随便找个不明不白的细胞就开始做实验呀。
二、基因敲除工具选择。
接下来就是选个厉害的基因敲除工具啦。
现在有好多选择呢，像CRISPR - Cas9就超级火。
它就像是一把精准的小剪刀，可以在基因组上特定的位置把基因剪掉。
不过使用这个工具的时候也要小心哦，就像拿着小剪刀不能乱剪东西一样。
还有TALEN 之类的工具，它们也各有各的优缺点。
在选择的时候，得看看自己的实验条件、对敲除效率的要求以及成本之类的因素。
三、设计向导RNA（gRNA）要是选了CRISPR - Cas9系统呢，向导RNA的设计可太重要了。
这就像是给小剪刀指个路，告诉它要去剪哪里的基因。
这个gRNA的设计要尽量特异性强，可不能让它乱指一通，把不该剪的地方给剪了。
得根据基因的序列信息，精心设计这个小向导。
而且设计好之后还要验证一下，看看它是不是真的能准确地找到目标基因，就像考试之前要检查自己有没有带齐东西一样。
四、基因敲除操作。
然后就开始正式的基因敲除操作啦。
把细胞和设计好的基因敲除工具放在一起，让它们相互作用。
这个过程就像是一场小小的战斗，细胞在那里努力地维持自己的状态，而基因敲除工具则在想办法对基因进行改造。
在这个过程中，实验条件要控制好，温度呀、培养基的成分呀之类的，就像照顾小婴儿一样细心。
如果条件不合适，细胞可能就不高兴了，不按照我们预期的那样进行基因敲除。
五、筛选沉默细胞。
基因敲除之后，就要把那些成功被敲除基因的细胞筛选出来啦。
这就像在一群小朋友里面找出那些做了特定动作的小朋友一样。
可以利用一些筛选标记，比如抗生素抗性之类的。
基因敲除沉默细胞构建流程
基因敲除沉默细胞构建流程基因敲除沉默细胞构建，那可真是个超有趣又有点小复杂的事儿呢。
一、细胞选择。
咱们得先挑个合适的细胞呀。
就像挑水果一样，得找那种健康又有代表性的细胞。
这个细胞得对咱们要做的基因敲除有意义，比如说如果是研究某种疾病相关的基因，那就得找那种和这个疾病相关的细胞系。
而且细胞的状态也很重要哦，要是细胞本身就病恹恹的，那后面的构建肯定会出问题的。
这就好比要盖房子，得先选一块好地基一样。
二、基因敲除工具的准备。
三、转染细胞。
然后就到了把这个基因敲除工具送进细胞里的时候啦，这个过程叫转染。
这就好比是给细胞送快递一样。
有不同的转染方法呢，像脂质体转染就像是把工具包裹在一个小泡泡里，然后这个小泡泡和细胞融合，就把工具送进去了。
还有电穿孔法，这个就比较猛啦，用电来在细胞上打个小通道，让工具进去。
不过不管用哪种方法，都要把握好度，不能把细胞给弄伤了，要是细胞被弄得太惨，那它就没办法好好进行基因敲除的后续工作啦。
四、筛选敲除成功的细胞。
转染之后呢，并不是所有的细胞都成功地被敲除了基因哦。
所以咱们得把那些成功的细胞挑出来。
这就像是在一群小动物里找到咱们想要的那几只特别的小动物一样。
通常会用一些筛选标记来做这个事儿。
比如说如果给基因敲除工具带上一个抗药性的标记，那把细胞放到含有相应药物的培养基里，那些没有敲除成功的细胞就会被药物杀死，剩下的就是咱们成功敲除基因的细胞啦。
不过这个过程也得小心呢，有时候细胞会很调皮，会出现一些假阳性或者假阴性的情况，得仔细地去分辨。
五、验证基因敲除。
最后呀，可不能就这么轻易地相信细胞已经成功敲除基因了。
咱们得验证一下。
可以用好多方法来验证呢，比如PCR（聚合酶链式反应），这个方法就像是给基因做个小检查，看看那个基因是不是真的被敲掉了。
还有Western blot（蛋白质印迹法），这个是从蛋白质水平来看看那个基因对应的蛋白质是不是消失了。
只有经过这些验证，咱们才能真正确定构建出了咱们想要的基因敲除沉默细胞呢。
cas9 构建基因敲除细胞系 步骤
cas9 构建基因敲除细胞系步骤1. 设计gRNA序列需要设计合适的gRNA（guide RNA）序列。
gRNA是一种由RNA和DNA组成的分子，在CRISPR-Cas9系统中起到引导Cas9蛋白识别和切割目标DNA的作用。
gRNA序列应当与目标基因的特定区域互补，并且要避免与其他基因的序列相互匹配。
2. 合成gRNA和Cas9蛋白合成设计好的gRNA序列，并将其与Cas9蛋白结合。
Cas9蛋白是CRISPR-Cas9系统中的核酸酶，能够与gRNA一起识别目标DNA 序列，并在其靶向区域引发双链断裂。
3. 转染细胞将gRNA和Cas9蛋白复合物转染到目标细胞中。
转染可以使用多种方法，如化学法、电穿孔法或病毒载体介导的转染等。
转染后，gRNA和Cas9蛋白会进入细胞质，并寻找目标基因。
4. 筛选敲除细胞系根据需要敲除的基因，选择适当的筛选方法来鉴定敲除细胞系。
常用的筛选方法包括PCR、Western blot和细胞克隆等。
通过这些方法，可以检测到目标基因的敲除情况。
5. 确认敲除细胞系对筛选出的细胞系进行进一步的确认。
可以使用DNA测序技术对目标基因的敲除位点进行测序验证。
此外，还可以通过功能实验来验证目标基因的敲除效果。
6. 存储和维护敲除细胞系成功敲除目标基因后，需要对敲除细胞系进行存储和维护。
细胞系应当保存在液氮中，以确保其长期保存和使用的稳定性。
同时，细胞系也需要定期培养和检测，以确保其生长状态和敲除效果。
以cas9构建基因敲除细胞系的步骤包括设计gRNA序列、合成gRNA和Cas9蛋白、转染细胞、筛选敲除细胞系、确认敲除细胞系以及存储和维护敲除细胞系。
这些步骤需要在实验室中进行，确保操作的准确性和稳定性。
基因敲除细胞系的建立为研究基因功能和疾病机制提供了有力的工具，对于深入理解生命活动和疾病发生发展具有重要意义。
CRISPR-Cas9精细原理：基因敲除、点突变、基因插入
1.2CRISPR-Cas系统的结构 CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列
R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排 列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列 CRISPR 相关蛋白基因cas。
Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在 guide RNA引导下对靶位点进行切割。它 与folk酶功能类似，但是它并不需要形 成二聚体才能发挥作用。
真核细胞的转录激活因子可通过将ｄCas9与单纯疱疹病毒转录激活子 ＶＰ16结合获得。
3、CRISPR-Cas9技术的优势与前景
3.1CRISPR-Cas9技术的优势
而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因 为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要 替换20个核苷酸就行。
只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不 具特异性。
编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构TALENs和ZFNs更简单 方便。
较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复TALENs编码载体带来 的并发症。
CRISPR-Cas9大PR-Cas系统简介
1.1 CRISPR-Cas系统的研究历史
1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间 隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002 年， 正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列
2.2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活
CRISPR／Cas9系统用于转录抑制需要PAM（３bp）和至少12bp的gRNA－ ＤＮＡ配对
利用crＲＮＡ介导dCas9能够精确识别靶基因的特点，将ｄCas蛋白与 具有转录激活的蛋白质功能域融合则可构建具有转录激活活性的 CRISPR－on系统。
基因敲除载体的构建步骤
基因敲除载体的构建步骤一、基因敲除载体构建的基础知识基因敲除载体的构建就像是搭积木，不过这个积木超级复杂。
我们得先知道啥是基因敲除载体，简单说呢，它就是一种工具，能帮助我们把生物体内某些我们不想要的基因给去掉或者改变。
这就好比是在一个精密的机器里，把一个不太合适的小零件拿掉或者换成新的。
这载体就像是一个小货车，能把我们想要的东西（比如特定的酶或者基因片段）运到我们想要的地方（细胞里面的特定基因位点）。
二、构建基因敲除载体的材料准备1. 首先得有合适的质粒。
质粒就像是一个小小的环状的DNA仓库，我们可以把我们想要的基因片段存放在里面。
这个质粒得根据我们要敲除的基因以及要在什么生物里敲除来选择。
比如在细菌里用的质粒和在植物或者动物细胞里用的质粒就可能不一样。
2. 还需要各种酶。
像限制性内切酶，这可是个超级厉害的小剪刀，它能在特定的位点把DNA剪断。
还有DNA连接酶，它就像是胶水，能把我们剪断又重新组合的DNA片段粘起来。
3. 当然，我们还得有目标基因的相关信息。
比如说这个基因的序列是啥样的，它在染色体上的位置在哪里等等。
这就好比我们要去一个地方，得先知道这个地方在哪里，周围有啥标志性建筑一样。
三、构建基因敲除载体的实际操作步骤1. 设计引物我们要根据目标基因的序列设计引物。
引物就像是导航的起点，它能告诉酶从哪里开始工作。
这个引物设计可不能马虎，要保证它的特异性，就像钥匙要能精准地开一把锁一样。
如果引物设计错了，那后面的工作可能就全乱套了。
2. 扩增目标基因片段利用我们设计好的引物，通过PCR（聚合酶链式反应）技术来扩增目标基因片段。
这个过程就像是复印机复印文件一样，不过是在微观的DNA世界里。
通过不断地循环，我们能得到很多很多我们想要的基因片段。
3. 对质粒进行酶切用限制性内切酶对我们选好的质粒进行酶切。
这就像是在质粒这个小仓库的墙上开个门，这样我们才能把新的东西（扩增好的基因片段）放进去。
要注意选择合适的酶切位点，不然这个门开得位置不对，东西就放不进去了。
基因敲除细胞系构建流程
基因敲除细胞系构建流程
基因敲除细胞系构建流程通常包括以下步骤：
1. 确定目标基因：选择需要敲除的目标基因。
2. 基因敲除设计：设计合适的靶向序列，该序列将在基因敲除过程中与目标基因发生特异性的DNA双链断裂。
3. CRISPR-Cas9系统构建：构建CRISPR-Cas9系统，其中包
括Cas9核酸酶和相应的靶向RNA（sgRNA）。
4. 细胞系培养：培养适合的细胞系，如细胞株或原代细胞。
5. 转染：将CRISPR-Cas9系统转染到细胞中，可以使用化学
转染、电转染或病毒载体转染等方法。
6. 筛选敲除细胞：在转染后的细胞中，通过添加选择性抗生素或使用基因标记物等方法，筛选出含有目标基因敲除的细胞。
7. 制备克隆：将筛选出的细胞进行单细胞克隆，并培养扩增。
8. 确定敲除效果：通过PCR、Western blot、流式细胞术或其
他适合的实验方法检测敲除细胞的基因表达水平和蛋白质表达。
9. 验证敲除细胞的功能：通过细胞功能实验，如细胞增殖、凋亡、迁移等实验，验证目标基因敲除对细胞功能的影响。
注意：以上流程是一般化的基因敲除细胞系构建流程，具体步
骤和条件可能因实验目的、细胞类型、基因敲除方法等而有所不同。
敲除基因的sgrna的构建
敲除基因的sgrna的构建一、啥是基因敲除呀。
基因敲除就像是给基因来一场超级大改造。
咱们都知道基因就像身体里的小指挥官，管着好多事儿呢。
基因敲除呢，就是让某个基因不再起作用啦。
这就好比在一个超级复杂的机器里，把某个小零件给拿掉，看看整个机器会有啥不一样的反应。
那sgrna在这个基因敲除的大工程里可是超级重要的小助手哦。
二、sgrna是个啥。
sgrna呀，它全称是单向导RNA（Single guide RNA）。
这小家伙别看它小，本事可大着呢。
它就像一个小导航，能够带着一种叫Cas9的蛋白准确地找到目标基因，然后Cas9蛋白就像一把小剪刀，“咔嚓”一下把目标基因给剪断啦。
这一剪断，基因就不能正常工作啦，也就达到了敲除的效果。
它的结构也很有趣呢，有一部分能够识别目标基因，就像一把特制的钥匙，只能开特定的锁，也就是只能找到特定的基因序列。
三、构建sgrna的前期准备。
要构建这个sgrna呀，得先做好一些准备工作。
咱们得知道要敲除哪个基因吧，这就像要去打仗，得先知道敌人在哪里一样。
得先对这个基因进行详细的研究，知道它的序列信息，就像知道敌人的长相和习惯一样。
然后呢，还得准备好各种实验材料，像一些特殊的酶呀，这些酶就像小工匠，能把各种材料拼接起来。
还有一些载体，这个载体就像小货车，可以把我们构建好的sgrna运到细胞里面去呢。
四、构建的具体步骤。
1. 设计sgrna序列。
这可是个技术活。
根据要敲除的基因序列，按照一定的规则来设计sgrna的序列。
这个规则就像是游戏里的攻略一样，不能乱了套。
要保证设计出来的sgrna能够准确地识别目标基因，而且效率还得高。
有时候可能要设计好几个不同的序列，就像准备好几套方案一样，然后从中挑选出最好的那个。
2. 合成sgrna。
设计好序列之后呢，就可以合成sgrna啦。
这个过程就像是按照设计图盖房子一样。
现在有很多先进的技术可以帮助我们合成sgrna，不过在合成的过程中也要小心哦，要保证合成的质量，不能有差错，就像盖房子不能偷工减料一样。
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新无标记基因敲除系统的构建原理是：
引入分枝杆菌噬菌体高效同源重组蛋白che9c60和61，以加强分枝杆菌发生同源重组的能力；
引入Xer剪切重组系统，用于切除抗性标记基因，以实现无抗性基因引入；
che9c60、61蛋白在提高分枝杆菌的同源重组效率的同时会毒害分枝杆菌的生长，为此我们设计了条件可控表达系统——四环素诱导可控表达系统。
Xer剪切重组系统的工作机理是：
分枝杆菌自身具有的Xer内源重组酶能够识别28bp的dif位点，并切除其包含的基因，将抗性基因两端连接上dif序列，即可用于切除抗性标记基因。
四环素诱导可控表达系统的工作机理是：
使che9c60、61蛋白表达受tetO启动子控制，在未加诱导剂时tetO启动子受tetR阻遏蛋白抑制，从而阻止che9c60、61蛋白的表达，降低che9c60、61蛋白对菌体毒害，当加入诱导剂——脱水四环素，tetR阻遏蛋白则结合四环素分子，tetR从tetO启动子上脱落，从而使重组蛋白gp60和gp61得到表达。
为了工作方便起见，我们采用二元质粒体系，pFQ作为helper质粒用于条件表达che9c60、61蛋白，pFQ-xer则用于基因打靶和抗生删除。
6.3实验方法
6.3.1提高同源重组效率的pFQ质粒构建
质粒pFQ构建流程如图6.1所示。
6.3.1.1 Pimyc-tetR阻遏蛋白和Che9c gp60-61重组蛋白基因钓取
依据6.2.6所设计的引物，运用PCR分别扩增出Pimyc-tetR和Che9c gp60-61目的基因。
目的基因结构示意图6.2所示。
6.3.1.2 pFQ质粒的构建
参照图6.1的pFQ质粒构建流程图，依次Pimyc-tetR、Che9c gp60-61和pSEl00质粒进行扣应醜切、纯化、连接、转化DH5a大肠杆謝验证等分子生物学操作，将它们依次整合，完成对pFQ质粒的构建。
pSE100质粒线性结构如图6.3所示，完整的pFQ质粒如图6.4。
6.3.2.1 dif+kan抗性基因和Hsp60启动子基因的钓取
依据6.2.6所设计的引物，运用PCR分别扩增出dif+kan和Hsp60启动子目的基
因。
基因结构示意图如下：
参照图6.1的PFQ质粒构逮流程图，将dif+kan、Hsp60启动子进行相应酶切、纯化、连接、转化DH5a大肠杆菌验证等分子生物学操作，将它们连接整合，
完成对pFQ-Xer质粒的构建。
pFQ-Xer质粒如图6.4。
6.3.3同源组片段的构建同源重组片段构建流程如图6.8所示。
6.3.3.1 kstR3同源臂构建于puc-19T载体上
首先先将上游同源臂kstR3-up和下游同源臂kstR3-Down分别插入至puc-19T通用质粒载体上，获得kstR3-up+puc-19T和kstR3-Down+puc-19T重组
质粒并完成电泳验证和测序验证。
而后，选用Pstl和HindⅢ双酶切上述获得的
重组质粒，酶切产物纯化后，利用Fermentas T4 ligase进行连接，获得构建于puc-19T载体上的同源片段的上下游基因片段，如图6.9。
6.3.3.2 kstR3同源重组片段构建
参照图6.8的同源重组片段构建流程示意图，将dif+kan、Hsp60启动子进行相应酶切、纯化、连接、转化DH5a大肠杆菌验证等分子生物学操作，将它们连接整合，完成对携带kstR3同源重组基因片段的kstR3-pUC-19T重组质粒的构建
并进行酶切验证。
选用SacI和HindⅢ对上述验证正确的重组质粒进行酶切，酶
切液采用1%琼脂糖凝胶电泳分离后，获得kstR3同源重组基因片段悬液。
kstR3同源重组基因片段如图6. 10。
6.3.4无标记敲除系统的构建与验证
无标记基因敲除系统的构建与验证方案如图6.1丨所示。
6.3.4.1构建pFQ-MS 工程菌预先制备分枝杆菌MS感受态（见第三章），提取验证正确的电转质粒pFQ，借助MicroPulser电转化仪将pFQ质粒电转化导入新金分枝杆菌MS中，并利用潮霉素抗性进行筛选，获得携带pPFQ质粒的pFQ-MS工程菌。
（具体电转化操作方法见第三章）
6.3.4.2 kstR3同源交换重组工程歯蹄选
将6.3.3.2构建获得的kstR3同源重组基片段，参照第三章采取电转化方式入PFQ-MS工程歯感受态，进行kstR3基因的同源重组交换。
采用kanamycin抗性对kstR3 同源交换重组成功的工程闲进行筛选，获得kstR3基因删除，插入携带kanamycin抗性的目的工程菌。
最后运用PCR扩增目的基因kstR3，进行1%琼胎糖凝胶电泳初步验证和测序验证序列比对。
6.3.4.3 kanamycin抗性删除的工程萌蹄选
kanamycin抗性删除的工程菌筛选，我们采用无抗性培养，在实验设计的Xer剪切重组系统的作用下，以自然丢失的方式进行。
6.3.4.2获得的成功进行同源交换的工程菌，首先进行2-3轮的无抗性传代培养，而后稀释涂布无抗性LB 平板培养。
最后，在之前无抗性.LB板上生长的单菌落中选取若干，标记对应转移至kanamycin抗性的LB板上划线培养分析。
若单菌落仅能在无抗性的LB板上生长，则为目的菌株，即：获得成功进行无抗性标记的kstR3基因删除菌。
参照如图6.12。