基因工程 期末复习题及解答

名词解释:基因工程:是以分子遗传学理论为基础,以分子生物学和微生物学的现代方法为手段,将不同来源的基因(即DNA 分子),按照人们预先设计的蓝图,在体外构建重组DNA 分子,然后导入活细胞,有目的改造生物原有的遗传特性,获得新品种,生产新产品,或是研究基因的结构和功能.同裂酶(isoschizomers)(同切点酶):有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列,这类酶特称为同裂酶.同尾酶(isocaudamer):与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同,识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶. 星号活性(star activity):在“非最适的”反应条件下(包括高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等),有些限制性核酸内切酶识别序列的特异性便会发生“松动”,从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子.这种特殊的识别能力,通常叫做星号活性,以EcoRI*表示.测序酶是经修饰过的T7噬菌体DNA聚合酶,是采用缺失的方法,从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸,这样使得T7DNA聚合酶完全失去了3′-5′外切酶活性,只有5′-3′聚合酶活性,而且聚合能力提高了3-9倍,测序时常用此酶.限制性内切酶也是一种水解酶,主要从细菌中分离得到.在细菌体内的作用是水解“入侵

”的外源DNA 序列而保护自身DNA.水解后产生的DNA 产物是带有5′-P 和3′-OH的.限制性核酸内切酶:是一类能识别和切割双链DNA 分子中特定碱基顺序的核酸水解酶.限制-修饰系统:指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用,破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等),使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制; 而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后,通过修饰酶的作用,在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰,可免遭自身限制性酶的破坏,这样形成的就是限制-修饰系统.限制性片段长度多态性(RFLP) 当DNA序列的差异发生在限制性内切酶的识别位点时,或当DNA片段的插入、缺失或重复导致基因组DNA经限制性内切酶酶解后,其片段长度的改变可以经过凝胶电泳区分,出现的这种DNA多态性称RFLP.载体(vector):在基因操作中携带外源基因进入受体细胞的工具.克隆载体:主要用于扩增或保存DNA片段,是最简单的载体.穿梭载体:能在两类不同宿主中复制、增值和选择的载体.表达载体是可携带外源基因进入宿主细胞进行复制并进行转录、翻译的载体.YAC 人工染色体载体是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体,其工作环境也是在酿酒酵母中.YAC基本特点:YAC 载体为能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要,必须含有以下元件:端粒重复序列(telomeric repeat,TEL):定位于染色体末端一段序列,用于保护线状的DNA不被胞内的核酸酶降解,以形成稳定的结构.着丝粒(centromere , CEN):有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点,使染色体在分裂过程中能正确

分配到子细胞中.在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用.自主复制序列(autonomously replication sequences,ARS):一段特殊的序列,含有酵母菌中DNA进行双向复制所必须的信号.细菌人工染色体载体(Bacterial artificial chromosom

es,BACs):是基于大肠杆菌的F质粒构建的、高通量底拷贝的质粒载体.卸甲载体:将Ti质粒上的T-DNA的致瘤基因全部去掉,仅保留其两边界即与T-DNA转移所必需的25bp序列而构建成的载体.一元载体:含目的DNA的中间表达载体与改造后的受体(Ti质粒)通过同源重组所产生的一种复合型载体.双元载体:是指由两个分别含有T-DNA和vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统.Ti质粒(tumor inducing plasmid)是根癌农杆菌中发现的可引起植物产生冠瘿瘤的质粒.T-DNA区: 即转移DNA,能转移并整合在植物细胞核基因组上的、决定植物形成冠瘿瘤的一段DNA.LTS和RTS对于T-DNA的转移和整合是不可缺少的.α-互补;指lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,由1024个氨基酸组成)阴性的突变体之间实现互补.探针(probe):指用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA、RNA或瓜核酸序列.这些序列在使用之前需标记.基因探针:指用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA、RNA或寡核苷酸序列,这写序列在使用之前,需要进行标记.COS位点:当λDNA进入细菌细胞后,便迅速粘性末端配对形成双链环状DNA分子,这种粘性末端结合形成的双链区域叫做COS 位点.凝胶阻滞试验:(gel retardation assay):又叫DNA迁移率变动试验(EMSA),是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术.盒式诱变(cassette mutagenesis):就是用一段人工合成具有突变序列的DNA片段,取代野生型基因中的相应序列.这就好象用各种不同的盒式磁带插入收录机中一样,故而称合成的片段为“盒”,这种诱变方式为盒式诱变.酵母双杂交体系( Yeast two－hybrid system):也叫相互作用陷阱(interaction trap),是20世纪90年代初发展起来的分离新基因的新方法,可用于分离能与靶蛋白相互作用的基因,也是直接在细胞内检测蛋白－蛋白交互作用的灵敏度很高的遗传学新工具.酵母单杂交体系(yeast one-hybrid system)常用于研究DNA-蛋白质间的相互作用.酵母单杂交体系可识别稳定结合于DNA上的蛋白质,可在酵母细胞内研究真核DNA-蛋白质间的相互作用,并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因.也可用于分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作用.cDNA末端的快速扩增 / RACE (rapid amplification of cDNA ends)是用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法,它根据已知序列设计基因片段内部特异引物,由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列.用于扩增5’端的方法称为5’RACE,用于扩增3’端的称为3’RACE.基因文库:是指利

用重组DNA技术将生物细胞的染色体DNA所有片段随机地连接在基因载体上,然后转移到适当的寄主中,通过细胞增殖而构成各种片段的无性繁殖系.这种包含某种生物全部基因的一系列无性繁殖系称为该种生物的基因文库.(分为:基因组文库和cDNA文库.)cDNA文库:将一种生物mRNA,经反转录产生cDNA,以cDNA构建的克隆群体叫做该种生物的cDNA文库.cDNA差示分析法(representational difference analysis,RDA)是利用PCR能以指数形式扩增双链DNA模板,而仅以线性形式扩增单链模板的特性,通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法,特异性的扩增目的基因片断.融合基因:是指应用DNA 体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因.

抑制性消减杂交(Suppression Subtractive hybddization,SSH):是一种比较和分离不同细胞或同一细胞在不同状态下差异表达基因的方法.转化(transformation):把重组质粒DNA导入受体细胞(大肠杆菌、酵母、动植物细胞等),使其遗传性状改变的过程. 感受态(competence):作为受体细胞的细菌经一定处理(如冰冷的CaCl2溶液)后处于易于接受外源DNA的状态.衔接物是指人工合成的由10~12nt组成的、具有一个或数个在其要连接到的DNA上并不存在的限制性内切酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段. DNA接头(人工接头)是指人工合成的含有限制酶识别顺序的核苷酸片段.转化子(transformant):经转化获得外源遗传物质/DNA的细胞:是向有功能缺陷的细胞补充相应功转染(transfection)把重组的噬菌体或病毒导入受体细胞的过程.选择(selection)是指通过某种外来附加压力(或因素)的辨别作用,呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法.筛选(screening)是指通过某种特定的方法,从被分析的细胞群体或基因文库中,鉴定出真正具有所需要重组DNA分子的特定克隆的过程.沉默子(silencer):是参与基因表达负调控的一种元件(降低转录效率的一段DNA)绝缘子(insulator):既是基因表达的调控元件也是一种边界元件.绝缘子本身对基因的表达既没有正效应,也没有负效应,其作用只是不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用.衰减子(attenuator):衰减发生处的一种内部终止子序列.衰减子结构本身不能实现衰减作用,必须借助核糖体与前导序列的结合来发挥其作用. 终止子(terminator):为转录提供终止信号的一段DNA序列,是基因表达的顺式负调控元件.电转化法(electroporation)也叫电穿孔法或电击法,是一种将极性分子穿过细胞膜导入细胞的一种物理方法,在这个过程中一个较大的电脉冲短暂破坏细胞膜的脂质双分子层,从而允许DNA等分子进入细胞.菌落原位杂交:将菌落或噬菌斑转到固相膜上,原位裂解细胞后使核酸固定在膜上,然后与探针杂交.目的基因:指那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA 片段.报告基因:是指编码产物能够被快速测定、常用于判

断外源基因是否成功地导入受体细胞(器官或组织),是否表达的一类特殊用途的基因.

报告基因与选择基因的区别:选择基因往往要与外界存在的筛选压力如抗生素等相互作用,以筛选出被转化的细胞;而报告基因是提供一种快速测定外源基因是否成功导入的检测手段,它的应用不依赖于外界选择压力的存在. 原位PCR:是指对组织、细胞中特异DNA或RNA进行扩增,然后再用原位杂交对扩增产物进行定量分析的一种方法.转基因动物:指用人工的方法将外源基因导入动物受精卵或早期胚胎细胞,使外源基因与动物本身的基因组整合,并随细胞的分裂而增殖,从而将外源基因稳定地遗传给下一代的工程化动物.基因工程疫苗:疫苗一般是由灭活或减毒的病原体做成的可预防相应病原物引起疾病的药物, 通过接种人或动物在其体内建立抗感染免疫反应而产生保护作用. 将基因工程技术应用于疫苗生产所得的疫苗即为基因工程疫苗.亚克隆:对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆,即将已克隆的DNA片段从一载体向另一载体的转移的过程.目的在于对目的DNA进行进一步分析,或者进行重组改照等.核酸疫苗:核酸疫苗又称基因疫苗或DNA疫苗,是利用基因重组技术将编码抗原的基因装入载体,然后直接导入动物体内,通过机体细胞的转录系统合成蛋白,产生的蛋白作为抗原诱导免疫系统产生免疫应答,即通过细胞和体液免疫反应产生抗体,从而达到预防和治疗疾病的目的.动物生物反应器:从转基因动物体液或血液中收获基因产物即是所谓的动物生物反应器质粒的不相容性:两个质粒在同一宿主中不能共存的现象.他们常常共用同一个复制系统.转化:指将质粒DNA或以它为载体构建的重组质粒导入受体细胞中的过程.转染把重组的噬菌体或病毒导入受体细胞的过程.基因治疗能基因,以纠正或补偿其基因缺陷,达到治疗目的的方法.转座子标签技术/T-DNA标签技术:当转座子或T-DNA转入生物基因组,整合到染色体上的时候,有可能是插入到染色体上的某个基因中,这时会破坏该基因的结构,从而引起表型变异,把变异个体的DNA提取出来,构建成基因组文库,再用转座子或T-DNA为模板制备探针,克隆出该突

第一章1.基因克隆.基因操作.基因重组.基因工程的概念及其相互关系?基因克隆:在一定程度上等同于基因分离.基因工程:通过基因操作来定向改变或修饰生物体或人类自身,并具有明确应用目的活动称为基因工程.基因操作:对基因进行分离.分析.改造.检测.表达.重组和转移等操作的总称.基因重组:不同来源DNA分子通过共价连接(磷酸二酯键)而组合成新的DNA分子的过程.关系:基因工程是通过基因重组实现的,但基因重组并不都是严格意义上的基因工程,基因重组是基因操作范畴的概念,包括实验研究和生物技术的基因重组事件,而基因工程则专指为实践应用而进行

的重组事件.2.试述基因工程技术的发展给人类带来的影响?①.在工业领域的应用(第四次工业大革命)②.在农业领域的应用③.在医药领域的应用(第二次医学大革命)3.试述基因工程技术的发展方向?生物的遗传改良,生物反应器.基因治疗和基因疫苗等.4.简述基因工程的基本过程?①.提取目的基因②.目的基因与运载体结合③.将目的基因导入受体细胞④.目的基因的检测和表达

第二章1.切口平移标记DNA前,用DNaseI处理DNA时应注意什么?应注意Mg2+离子浓度和处理时间及温度.2.DNA聚合酶有哪些类型,各有什么活性?①.E.coliDNApolI 5’-3’DNA聚合酶活性.5’-3’DNA外切酶活性.3’-5’DNA外切酶活性②.E.coliDNApolI大片段(Klenow酶)5′→3′DNA 聚合酶活性.3′→5′外切酶活性③.T4噬菌体DNApol5′→3′DNA聚合酶活性(与Ｋlenow酶相似)3′→5′外切酶活性(Ｋlenow酶×200):在无dNTP时只有该活性.常用于填平dsDNA的3′缩进末端及水解dsDNA的3′突出末端④.T7噬菌DNApol及测序酶5′→3′DNA聚合酶活性

.3′→5′外切酶活性(Ｋlenow酶×1000)⑤.耐热DNA聚合酶在高温下仍具活性的DNA聚合酶⑥.反转录酶(依赖于RNA的DNApol)5’→3’DNA聚合酶活性(需Mg2+)RNaseH活性(5’→3’及3’→5’RNA外切核酸酶活性)⑦.末端转移酶(terminaltransferase)不依赖于模板的DNA聚合酶,在二价阳离子存在下,催化dNTP加在DNA分子的3′-OH端.

3.生产限制性内切酶的细菌如何保护自己的DNA不被降解?通过限制与修饰系统保护自己的DNA不被降解.不同种的细菌或不同的细菌菌株具有的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统.修饰的本质是通过甲基化酶将DNA中某些碱基进行甲基化修饰,由于宿主自身DNA上的这些位点进行了修饰,限制酶就不能进行切割.由于外来的DNA在相应的碱基上没有被甲基化,宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我,并将入侵的外来DNA分子降解掉.所以DNA限制作用和修饰作用为细胞提供了保护.

4.按适当的顺序,列出将一种mRNA的cDNA克隆到表达载体所用到的酶有哪些?①反转录酶以mRNA为模板复制出单链cDNA;②DNA聚合酶以单链cDNA为模板合成双链DNA;③S1核酸酶切割双链DNA形成平末端;④用限制性内切酶切割载体;⑤用DNA连接酶将cDNA插入载体.

5.某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时出现了星号活性,分析可能的原因?

(1)高甘油含量(>5％,v/v);(2)限制性内切核酸酶用量过高(>100U

/ugDNA);(3)低离子强度(<25mmol/

L);(4)高pH(8．0以上);(5)含有有机溶剂,如DMSO,乙醇等;(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+,

Cu2+,C02+,Zn2+等).6.为什么反转录酶在聚合反应中会出错?因为反转录酶无3′→5′外切酶校正作用,在高浓度的dNTP和Mn2+存在时错误率为

1/500b;7.Mn2＋.Mg2＋对DNaseI的活性有什么影响?

DNaseI在基因工程中有什么作用?在Mg2＋存在下,独立作用于每条DNA 链,且切割位点随机;在Mn2＋存在下,可在两条链大致同一位置切割dsDNA,产生平末端或1～2nt突出的DNA片段.切口平移标记时在dsDNA 上产生随机切口;在闭环DNA上引入单切口;在DNA酶足迹法中分析蛋

白/DNA复合物;去除RNA样品中的DNA.8.限制性内切酶反应的影响因素:1.酶的纯度:不应存在其他的酶污染2.DNA的纯度:限制性核酸内切酶消化DNA底物的反应效率,在很大程度上是取决于所使用的DNA本身的纯度.污染在DNA制剂中的某些物质,例如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS(十二烷基硫酸钠)、以及高浓度的盐离子等,都有可能抑制限制性核酸内切酶的活性.3. DNA的甲基化程度:限制性核酸内切酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分,因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用,便会强烈地影响酶的活性.为避免产生这样的问题在基因克隆中使用的是失去甲基化酶/M- 的E.coli 菌株制备质粒DNA.9.克服星号活性的方法:维持反应体系适当的离子强度、较低的温度或酶浓度,尽可能缩短反应时间或DNA 样品的重新处理等.

10.DNA连接酶:作用:催化dsDNA分子中相邻碱基的5’-P与3’-OH间连接成磷酸二酯键1)大肠杆菌DNA连接酶:作用:只能催化黏性末端间的连接,需NAD＋提供能量.

2)T4噬菌体DNA连接酶:作用:催化黏性末端或平末端间的连接,连接反应需ATP.11.脱氧核糖核酸酶(DNase I):为内切核酸酶,可优先从嘧啶核苷酸的位置水解ds DNA或ss DNA.在Mg2＋存在下,独立作用于每条DNA链,且切割位点随机;在Mn2＋存在下,可在两条链大致同一位置切割dsDNA,产生平末端或1～2nt突出的DNA片段. 作用:切口平移标记时在dsDNA上产生随机切口;在闭环DNA上引入单切口;在DNA酶足迹法中分析蛋

白/DNA复合物;去除RNA样品中的DNA.12.如何制备平末端？(工具

酶:T4聚合酶,Klenow片段)当3’端突出,5’端凹时,不加dNTP,用T4聚合酶的3′→5′外切酶活性,切去3’端;当5’端突出,3’凹时,加T4聚合酶或Klenow片段和dNTP,补平5’端对应的3’端.13.如何利用T4 DNA聚合酶进行双链DNA的3’ 末端标记:利用T4 DNA pol的3’ →5’外切核酸酶活性在无dNTP 的条件下切割dsDNA,产生5‘突出端,然后加入放射性标记的dNTP,利用其聚合酶活性进行填补合成,得到两端的3’端都是带标记的dsDNA.14.S1核酸酶:是一种单链核酸酶,降解DNA或RNA.作用:主要用于去除DNA片段粘末端而产生平端;打开ds cDNA合成中产生的发夹结构.S1核酸酶作图法,在测定杂交核酸分子(DNA:DNA或DNA:

RNA)的杂交程度、RNA分子定位,确定真核基因中内含子的位置、内含子与外显子剪切位点的定位、转录起始位点与终止位点的测定中,S1核

酸酶都是十分有效的工具.

15.反转录酶(依赖于RNA的DNA pol)1)5’→3’DNA聚合酶活性(需Mg2+):底物为RNA或DNA模板及带有3’-OH 的RNA引物或DNA引物.2)RNase H 活性(5’→3’及3’→5’ RNA外切核酸酶活性) : 能持续地特异地降解RNA/DNA杂交体中的RNA .3)主要用途:将mRNA反转录成cDNA.注: 无3′→5′外切酶校正作用,在高浓度的dNTP和Mn2+存在时错误率为1/500b;为防新合成的DNA提前终止,反应需高浓度的dNTP;该酶可用于单链复制也可合成双链(自身序列为引物但效率低).16.分子杂交时探针的标记法答:A末端标记:①3’末端标记:利用末端转移酶,不依赖于模板的DNA聚合酶,在二价阳离子存在下,催化dNTP加在DNA分子的3′-OH 端.即用标记的NTP、dNTP或ddNTP来标记DNA片段的3′末端.②5’末端标记:T4多核苷酸激酶催化ATP的γ-磷酸基转移到DNA或RNA的5’-OH末端,使已经脱磷酸化的5’末端重新磷酸化.当过量ADP存在时,DNA分子的5’-P转移给ADP,而脱磷酸化的DNA分子再从γ-32P的ATP中获得γ-32P基团,重新磷酸化的DNA分子即获得了32P同位素标记,此反应过程需Mg2+.B均匀标记:①切口平移法:用DNA酶Ⅰ对DNA分子产生随意的切口,利用4种dNTP 中的一种标记,加入DNA聚合酶Ⅰ,利用5’-3’外切酶活性从断裂处的5’端除去一个核苷酸,再利用它的5’-3’聚合酶活性讲带标记的dNTP连接到断裂处的3’端.由于DNA聚合酶Ⅰ不能使断裂处的5’-P和3’-OH形成磷酸二酯键重新连接,随着反应进行形成带标记的探针.②随机引物法:利用随机的寡核苷酸引物与变性的dsDNA模板随机退化,在存在标记的dNTP的情况下用Klenow酶进行延伸,产生均匀标记探针.第三章1.质粒的基本特性: 1)质粒的复制:只能在宿主细胞中进行复制2)质粒的拷贝数:拷贝数相对稳定,分为严谨型与松驰型3)质粒的不相容性:两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性(incompatibility),源于共用同一复制系统. 4)转移性:质粒具转移性是指在自然条件下,很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内.不含tra基因的质粒则不具备转移性.2.质粒载体的构建:1)选择合适的复制起始位点 (松散型质粒复制起始位点);2)缩短长度:切去不必要片段,提高转化宿主细胞的效率,提高外源DNA片段的装载量;3)增加或减少酶切位点:单一酶切位点数量越多越便于多种类型末端的DNA插入;或在特定部位组装MCS;4)加入合适的选择标记.3.野生型λ噬菌体必须经过改造才适用于基因克隆的载体:(5个Eco RI和7个Hind III酶切位点;1/2为非必需基因,该区段缺少或在此段插入外源DNA 片段将不影响λ噬菌体的增殖:作为基因工程载体的一个重要依据)λ噬菌体只有进入裂解循环,才能大量扩增.因此,λ噬菌体只有在特定的E.coli中烈性生长,才能用作载体.这就决定了λ噬菌体载体必须含有裂解生长所必需的基因或DNA片段.去掉一部分对裂解生长非必需的DNA片段后,可用

来装载外源DNA片段.4.用SalⅠ切割从噬菌体J2分离的DNA时,得到8个片段,分别是1.3.2.8.3.6.5.3.7.

4.7.6.8.1和11.4kb.但是,用SalⅠ切割从被感染的寄主细胞中分离到的J2噬菌体DNA时,只得到7个片段,分别是:1.3.2.8.7.4.7.

6.8.1.8.9和11.4kb.根据这些结果,你得到哪些信息?(1)J2噬菌体是一种双链线性的DNA分子;(2)基因组全长是47．5kb;(3)进入宿主后成环状; (4)5．3和3．6kb的片段分别位于线性DNA的两端.5.从噬菌体MS2中提取出来的裸露染色体可以感染大肠杆菌的原生质球(去除胞壁的细菌),这会产生和具感染能力的噬菌体一样的噬菌体颗粒.如果染色体先用RNA 酶处理,就失去感染能力;如果标记感染的RNA,在子代中不出现标记.解释这些现象.MS2噬菌体的染色体为单链(+)RNA,它的复制过程如下:(1)以(+)链作为模板合成一个碱基互补的(-)链;(2)以这条(-)链作为模板合成大量的(+)病毒链.原始的(+)链被完全保留.相应的酶是RNA复制酶,它是MS2一个基因的产物.6.以置换型λ噬菌体作为载体进行克隆时,为什么说能够形成噬菌斑的就一定是重组体?改造的置换型噬菌体载体,重组人外源片段之后,总体积不能超过λ基因组的105％,不能少于λ基因组的75％.以置换型λ噬菌体DNA作为载体,首先要分离左.右两臂同外源DNA重组.如果没有外源片段,仅是两臂连接,长度短于λ基因组的75％,不能被包入噬菌体颗粒,就不能感染寄主,也就不能形成噬菌斑.如果插入了外源片段后,总长度超过丸基因组105％后,也不能包入噬菌体颗粒,自然不能形成噬菌斑.

7.某同学计划以细菌质粒DNA为载体克隆一个编码大鼠生长激素的基因,并转化到细菌中进行表达.运用所学知识,请帮该同学分析一下在实验中可能遇到哪些问题?要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达,通常遇到的问题有:(1)细菌的RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子.(2)大多数真核基因有内含子,这些内含子在转录后从前体mRNA中被切除而形成成熟mRNA.细菌细胞没有这样的机制来去除内含子.(3)有些真核生物的蛋白质是通过前体分于加工而来的,例如胰岛素就是通过加工去除前体分子内部的33个氨基酸残基而来,剩下的两段肽链分别形成胰岛素的a.b 链.(4)产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解.

8.以Ecoli为例,表达载体比克隆载体多了哪些功能原件,各有什么生物学功能?(1)启动子转录是由RNA聚合酶在启动子部位启动RNA转录的过程.

(2)终止子转录启动以后的转录过程并不是永无止境的,会受到模板DNA 序列结构的影响,当遇到经环结构时转录便会终止,或遇到ρ因子介导的终止信号转录也会终止.(3)核糖体结合位点转录出来的mRNA可在宿主细胞的翻译机器作用下翻译出目的蛋白.9.简述利用YAC克隆载体构建基因文库的原理.当用BamHⅠ切割成线状后,就形成了一个微型酵母染色体,

包含染色体复制的必要顺式元件,如ARS.着丝粒和位于两端的端粒.当再用EcoRⅠ或SmaⅠ切割抑制基因sup4内部的位点后形成染色体的两条臂,与外源大片段DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体,通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制,并随细胞分裂分配到子细胞中去,达到克隆大片段DNA的目的.装载了外源DNA片段的重组子导致sup4插入失活,从而形成红色菌落;而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落.这些红色的装载了不同外源DNA片段的重组酵母菌菌落的群体就构成了YAC文库.

10.BAC克隆载体有哪些显著的优点?BAC载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生,并且还可以减少外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用.BAC载体可以通过α-互补的原理筛选含有插入片段的重组子,并设计了用于回收克隆DNA的NotI酶切位点和用于克隆DNA片段体外转录的SP6启动子和T7启动子.BAC与YAC和PAC相似,没有包装限制,因此可接受基因组DNA大小也没有固定的限制.

11.何为α-互补,如何利用α-互补来筛选插入了外源DNA的重组质粒?a-互补是指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的b-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补.a-互补是基于在两个不同的缺陷b-半乳糖苷酶之间可实现的功能互补而建立的.将缺失编码第11-41位氨基酸的β-半乳糖苷酶基因称为lacZΔM15基因而将半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和编码β-半乳糖苷酶N端140个氨基酸的序列称为LacZ'.这两个基因的产物单独存在时都无酶学活性,但混合在一起时却有酶学活性.所以在载体上加lacZ'/(MSC),并在受体菌中引入lacZΔM15即可实现a-互补.IPTG是lac操纵子的诱导物,底物X-gal被b-半乳糖苷酶分解后可以产生兰色产物,使菌落呈现兰色.如果质粒载体中插入了外源DNA,lacZ'的产物则不能与lacZΔM15的产物实现a-互补,在IPTG诱导下不能产生有活性的b-半乳糖苷酶,菌落便不可能呈现兰色.白色菌落便是含有插入了外源DNA的重组质粒.因此可利用菌落颜色变化来筛选插入了外源DNA的重组质粒.15.Ti质粒为什么可以作为植物的表达载体:T-DNA 区只存在于植物细胞核中,占Ti质粒DNA总长度的10％左右,而且已知植物冠瘿瘤细胞中冠瘿碱的合成和不依赖于植物激素的生长能力,都是由编码在T-DNA上的基因控制的.显而易见,根瘤土壤杆菌通过Ti质粒的转化作用实现了植物基因的遗传转移,所以Ti质粒有可能用作植物基因克隆的载体.

12.核酸分子标记的方法,各有何特点1)放射性标记.是最早使用的核酸分子标记,检测灵敏度高,但因为有放射性,对操作人员危害大.2)非放射性标记,包括生物素和地高辛.使用安全、方便,标记的探针可保存并可重复使用、便于控制显色反应、显色后的杂交膜可长期保存、杂交信号的灰度

明显(特别是菌落杂交中易于辨别真假阳性).但其检测灵敏度不够高,而且杂交膜不易二次或多次杂交.12.一个具有卡那霉素(Kan)和氨苄青霉素(Amp)抗性基因的质粒,BglII酶切位点在Ampr基因中.将BglII酶切质粒DNA和BglII酶切的果蝇(Drosophil

a)DNA进行退火,然后转化大肠杆菌中,回答下列问题:①在培养基中需要加入哪种抗生素才能保证筛选出含有质粒的克隆?(卡那霉素)②在平板上生长的菌落是具有哪种抗生素抗性的?(卡那霉素)③DrosophilaDNA具有哪种表型?如何筛选具有这一表型的克隆?DrosophilaDNA具有卡那霉素抗性,没有氨苄青霉素抗性.可以将在卡那霉素培养基平板上的菌落影印到氨苄青霉素培养基平板上.能同时在两种培养基中生长的为含有空质粒的大肠杆菌,能在卡那霉素培养基平板上生长而不能在氨苄青霉素培养基平板上生长的为DrosophilaDNA的克隆. 14.酵母表达载体(均为E.coli 和酵母菌的穿梭载体):细菌部分(原核构件):质粒Ori、特定的抗生素抗性基因(ampr、tetr).酵母部分(真核构件):与宿主互补的营养缺陷型基因(his3、leu2、trp1)或特定的抗生素抗性基因(Zeocinr)、编码特定蛋白(AOX1)的启动子和终止子序列16.哺乳动物表达载体的条件:①具有哺乳动物细胞的复制起始点,使表达载体能在细胞内复制,从而增加外源基因表达拷贝数;②具有可供选择的标记基因,筛选出转染有表达载体的转化克隆;③具有外源基因表达所必需的全部顺式结构,包括启动子、增强子、内含子剪切位点,转录终止子,多聚腺苷酸信号;④在启动子下游有多种单一内切酶位点,可供插入外源基因;⑤含有细菌质粒复制起点和抗性基因以便能在细菌中扩增和选择18.pBR322 质粒载体:特点:人工构建;带有多种抗药性标记;低Mr;高拷贝;外源DNA插入不影响复制功能的多种限制性核酸内切酶单切割位点.组成:pSF2124质粒Tn3的ampr;pSC101质粒的tetr;Col E1的派生质粒pMB1 的质粒ori19.pUC质粒载体:组成:pBR质粒的ori; ampr基因;lacZ′基因;位于lacZ′基因靠近5′-端的一段多克隆位点(MCS)区段.特点:更小的相对分子质量和更高的拷贝数;可用组织化学方法检测重组体(α-互补筛选);具有多克隆位点MCS区段,可把两种不同粘性末端的外源DNA片断直接克隆到上面20.以pB322质粒为载体,从四环素抗性基因(tetr)区克隆外源DNA时,可采用环丝氨酸富集法筛选重组体,请说明其基本原理和基本操作过程？答:基本原理:由于四环素的作用是抑制细菌蛋白质的合成,而不是杀死细菌;而氨基酸类似物环丝氨酸如果掺入蛋白质,则是致命的.因此再有四环素的条件下,环丝氨酸能够杀死tetr而不杀死tets的细菌.经过环丝氨酸处理后,存活的细胞中tets型得到很大的富集,而经过若干次连续处理,既能获得在基因内含有插入物的质粒的细胞.基本操作:①转化后有三种表型的细菌,其中只有一种是重组体AprTcs.②用重组DNA转化受体菌后,将受体菌培养在加有四环素和环丝

氨酸的培养液中培养,此时只有非重组的双抗性菌可以生长,其他都被抑制.③由于有环丝氨酸的存在,AprTcs表型的菌生长到一定程度就会死亡.④由于四环素只有抑菌而无杀菌的作用,此时若解除四环素(离心洗涤),加入氨基苄青霉素继续培养,则可使重组体大量生长.第四章1.同其他蛋白酶相比,使用蛋白酶K的优点在哪里？蛋白酶K可以水解范围广泛的肽键,尤其适合水解羧基末端至芳香族氨基酸和中性氨基酸之间的肽键.可有效降解内源蛋白,能快速水解细胞裂解物中的DNase和RNase,常用于去除残留的酶类及样品中的蛋白质.在SDS和EDTA中仍保持高活性,可以同SDS和EDTA同时使用2.在提取过程中应如何避免大分子DNA的降解和断裂？1)添加酶抑制剂抑制核酸酶活性,如EDTA等,可以同Mg2+螯合,使核酸酶失去作用的辅助因子,而被抑制活性.2)温和操作. 3)加保护剂,如蔗糖可增加缓冲液的黏度,保护DNA不易断裂.3.用酚/氯仿抽提DNA时,通常要在氯仿或酚/氯仿中加入少许异戊醇,原因是什么？异戊醇是一种有机试剂,可以降低表面张力,从而减少气泡产生.另外,异戊醇有助于分相使离心后的上层含DNA的水相,中间的性变蛋白质相及下层有机溶剂相维持稳定.4、酚与氯仿联合使用的好处？原因是酚和水有一定程度的互溶,所以单独使用酚抽提DNA,最终不能除去酚,残留的酚会使起切割和连接作用的限制性内切核酸酶和连接酶变性.氯仿也是蛋白质变性剂,它不与水互溶,但是能够同苯酚互溶.这样,酚和氯仿联合使用,就可以带走残留的酚.

1.印迹分子杂交有哪些种类,并说明在什么情况下需要使用这些方法.答:Southern杂交是以DNA或RNA为探针,检测DNA链,用于外源基因整合的鉴定及分析.Northern杂交是以DNA或RNA为探针,检测RNA链,用于外源基因转录产物特异mRNA的检测.Western杂交是利用抗原与抗体的特异结合的原理检测外源基因表达产物特异蛋白质的生成

2.基因定点诱变有哪些种类,各有何特点:基因定点突变(包括:盒式诱变、寡核苷酸引物诱变、PCR诱变:重叠延伸PCR和大引物PCR) (site-directed mutagenesi

s)是使已克隆基因或DNA片段中任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失突变的过程.1)盒式诱变:简单易行,突变效率高,但在靶DNA区段的两侧需存在一对限制性内切核酸酸酶单切点2)寡核苷酸介导的定点诱变:寡核苷酸介导的定点诱变可以在任何感兴趣的位置加上限制性内切酶位点;能够把一个自然条件下从未被发现的突变精确放置在靶基因的特定位置.3)PCR介导的定点诱变:优点:①突变体回收率高;②快速简便;③高温度的利用,可降低模板形成二级结构的几率;④几乎所有的反应可以在同一只试管中进行缺点:①PCR会产生一定程度的错配(非预定的)②Taq 酶常在末端加一个A ③对每套引物和模板需优化PCR条件④标准PCR不能有效扩增>3kb的DNA片段3.在做Southern印迹分析时,有同学为了节省时间,

做完凝胶电泳这一步,没有根据方案用NaOH溶液浸泡凝胶使DNA变性为单链,而是略过了这一步直接将DNA从凝胶转移至NC膜上,然后用标记探针杂交,最后发现放射自显影胶片是空白的.试分析该同学错在哪里?杂交探针是双链的,可能因为在加人杂交混合物之前忘记将探针变性而得到空白的放射自显影结果.4.建立了一个文库后,如何鉴定一个携带目的基因的克隆?带有某一细菌基因的克隆通常可以直接看出来,因为基因表达引起了宿主细胞表型的可见变化.然而,真核生物的基因不都表达,则需用相应的方法来找出带有所需基因特定克隆.一个常用方法是杂交(1)从不同的克隆提取DNA,固定于硝酸纤维素滤膜上,然后用NaOH使之变性(2)探针必须能与所需的基因互补且被32p标记.探针可以是来自另一不同生物体的相关的基因,或是依据与基因特异相关蛋白质的氨基酸序列设计并经化学合成的一小段DNA分子(3)探针只会与特定基因进行碱基配对(杂交),冲洗滤膜后,未结合上的标记探针会被除去(4)烘干滤膜后进行放射自显影后,所需的克隆就以一个黑点在胶片上显示出来,这就是菌落或原位杂交分析.5.单核苷酸置换插入或缺失中,引物设计的要求? 5’端完全配对,使得上游(引物)起始的DNA合成不容易将诱变寡核苷酸取代,约需8-10bp.3’端所形成的杂交体足以引导DNA合成.如果错配核苷酸太靠近3’端,3’端将不能形成稳定的杂交体,易被外切活性降解.所以3’端需有9bp 完全配对.为便于筛选,应选用可形成稳定杂交体而长度最短的诱变寡核苷酸.一般17-19bp,错配在中央,使得完全配对的杂交体与错配杂交体之间的热稳定性差异足够大.6.DNA诱变有哪些种类,各有何特点?⑴随机诱变:目的基因的DNA片段中引入了大量的序列多样性,得到的具体突变体可以是单点突变也可能是多点突变. ⑵寡核苷酸介导的定点诱变:寡核苷酸介导的定点诱变可以在任何感兴趣的位置加上限制性内切酶位点;能够把一个自然条件下从未被发现的突变精确放置在靶基因的特定位置.

7.DNase I足迹试验主要步骤:①用32P标记DNA双链末端,并用RE切去一端;②加入细胞特定周期蛋白质提取物,温育;③加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶,使DNA链发生断裂.这一反应中,DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键,要保证一条DNA链只发生一次断裂;④沉淀DNA(包括与DNA相结合的蛋白质);⑤进行DNA凝胶分析.

第五章1.简述以质粒为载体构建基因文库的基本步骤?①总DNA的提取;②载体的制备.纯化;③基因组DNA的不完全消化;④载体与外源DNA 片断的连接;⑤转化受体菌,然后在有选择压力的平板上培养转化了外源基因的受体菌;⑥重组子的鉴定;⑦外源DNA进行分析.2.构建了基因文库后,有哪些方法可以筛选或鉴定出哪一个克隆可能含有目的基因?①表型筛选法:是在宿主菌(大肠杆菌)中表达目的基因,使宿主产生新的表型或使宿主恢复其突变基因的表型来筛选目的基因.

②用核酸探针筛选目的cDNA(基因):对欲克隆的基因序列了解时,以目的基因的部分序列(DNA片段)制备探针,对文库进行筛选.③免疫筛选(抗体筛选)目的基因:如果能够得到目的基因产物的抗体,就可以通过免疫学的方法来筛选目的基因.其使用的探针不是核酸,而是特异性抗体.④利用数据库鉴定基因:将DNA序列输入GenBank与已知的基因序列进行比较.⑤酵母双杂交系统鉴定基因:是根据真核生物转录调控特点创建的一种体内鉴定基因的方法,其筛选的基因不是“探针”的直接编码产物,而是能够与其相互作用的蛋白质的编码基因,即筛选与已知基因产物发生相互作用的蛋白的编码基因.3.在基因工程中,为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物,为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA?为什么要在cDNA 前加上细菌的启动子?cDNA是mRNA的反转录产物,与基因组DNA相比,没有了启动子和内含子.因为细菌没有内含子剪接系统,并且不能识别真核生物的启动子,所以要使用cDNA.有因为cDNA上没用启动子,所以要加上细菌的启动子,保证其能正确转录.5.扣除杂交?其基本原理是?概念:将含目标基因的组织或器官的mRNA 群体作为待测样本(Tester),将基因表达谱相似或相近但不含目标基因的组织或器官的mRNA 群体作为对照样本(Driver),将Tester 和Driver 的cDNA 进行多次杂交,去掉在二者之间都表达的基因,而保留二者之间差异表达的基因. 原理:一种细胞的总 mRNA 反转录制备的 cDNA 与另一细胞的总 mRNA 混合形成 cDNA-RNA 杂交分子通过羟基磷灰石柱被扣除,未杂交的单链cDNA 流出柱子外,其对应的低丰度mRNA 得以克隆.11.如何以E.coli质粒DNA为载体克隆一个编码动物激素的基因并使之在E.coli中进行表达?简要说明实验中可能遇到的问题及可能的解决办法?要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达,通常遇到的问题有:(1)细菌的RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子.

(2)大多数真核基因有内含子,这些内含子在转录后从前体mRNA中被切除而形成成熟mRNA.细菌细胞没有这样的机制来去除内含子.(3)有些真核生物的蛋白质是通过前体分于加工而来的,例如胰岛素就是通过加工去除前体分子内部的33个氨基酸残基而来,剩下的两段肽链分别形成胰岛素的a.b链.(4)产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解.

针对上述可能出现的问题,建议在克隆的过程中采取以下措施:①应将激素的编码序列置于含有核糖体结合位点和起始密码子ATG的细菌强启动子的附近②可以以激素的mRNA为模板用反转录酶合成激素的基因.这种DNA不含内含子可插入到载体中进行克隆.此外,如果蛋白质序列短则可通过化学合成得到该基因.合成的基因应含起始密码ATG.通过该激素蛋白的氨基酸序列推测而来的编码序列,以及1—2个终止密码:ATG——编码序列——TGATAG.现在,这个合成基因可被插入载体中.③有时加工过

程可以在离体条件下进行.如果加工有困难,可以用合成基因,从而免除加工过程.④选用合适的突变型宿主从而防止蛋白酶水解.如果用酵母作为宿主上述许多问题都可以较容易地解决,尤其是现在有既能在大肠杆菌中又能在酵母中复制的穿梭质粒载体.基因组文库,构建文库的要求: (1)DNA的纯度要比较高.如果DNA含杂质多,会严重影响后面的内切酶消化.(2)要求制备的DNA片段要达到50～100kb,然后用内切酶切成10～

20kb的片段,以保证基因的完整和基因两端有内切酶位点,切割后出现粘性末端,便于连接.(3)要求有较大数量的克隆,才能保证每一个基因都包含在文库中,25．建立cDNA文库的步骤答:细胞总RNA的制备及mRNA的分离、cDNA第一条链的合成、双链cDNA的合成、双链cDNA与载体的连接和噬菌体颗粒的包装及感染宿主细胞.通过一系列酶催化作用,Poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上,转化大肠杆菌寄主细胞,构成包含所有基因编码序列的cDNA基因文库.

第六章1.重组DNA导入真核细胞1)重组DNA导入酵母菌细胞(1) 原生质体转化法:早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法,在Ca2+和PEG的存在下,转化细胞可达原生质体总数的1-2%.但该程序操作周期长,而且转化效率受到原生质再生率的严重制约.原生质体转化法的一个显著特点是,一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子,而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%(2)碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化:酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子(如Li+等)、PEG、热休克处理后,也可高效吸收质粒DNA,而且具有下面的特性:吸收线性DNA的能力明显大于环状DNA,两者相差80倍;共转化现象极为罕见(3) 酵母菌电击转化法:酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA,但在此过程中应避免使用PEG,它对受电击的细胞具有较很大的负作用.电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广,而且转化率可高达105 / mg DNA.2、如何将一平末端的DNA片段与EcoRI形成的黏性末端连接？答:平末端可调整反应条件用DNA连接酶实现片段之间的连接.非互补的粘性末端的连接须修饰成平端,再按平端连接法连接1.同聚物加尾法:利用末端转移酶可催化dNTP加到ssDNA或dsDNA 3′-OH,在外源DNA和载体3′-末端加上互补的同聚物尾巴.2.衔接物连接法.3.接头分子连接法:将具有平末端的外源DNA片段与人工接头分子在T4 DNA连接酶的作用下连接起来;然后与具有同样粘性末端的载体DNA分子在T4 DNA连接酶作用下连接成重组体(我以为以上方法皆可,也可将粘性末端平移成平末端)3、通过插入失活可以初步筛选重组子,但筛选到的克隆是否插入了正确的片段,还需要进一步的鉴定,鉴定的方法主要有哪几种？答:1 限制性内切酶法:外源片段通过特定的酶切位点插入到载体上,因此,可以通过这些限制性酶酶切重组质粒,电泳

分析插入片段长度是否正确.2 PCR法:如果已知插入DNA片段的某些序列,就可以通过PCR的方法进行鉴定.3 菌落原位杂交法.4 基因产物检测法:如果使用的是表达载体,那么就可以通过鉴定基因产物的方法鉴定正确的克隆.4、在重组DNA操作中为了提高连接效率常常将非互补的黏性末端修饰成平末端之后再进行连接.请问将黏性末端变为平端的方法有哪些？答:(1)5’-突出粘性末端的补平,一般选择大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段聚合酶进行填补;(2)3’-突出粘性末端的切平,一般使用T4噬菌体DNA聚合酶或单链DNA的S1核酸酶切平.变成平末端之后,同样可用DNA连接酶进行有效的连接.27. 重组DNA导入原核细胞(大肠杆菌)的方法①CaCl2法制备感受态细胞②电转化法③PEG介导的原生质体转化法④结合转化法28.重组DNA导入真核细胞(酵母菌细胞)的方法与特点⑴重组DNA导入酵母菌细胞:特点是,一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子,而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%.⑵碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化:特点:吸收线性DNA的能力明显大于环状DNA,两者相差80倍;共转化现象极为罕见⑶酵母菌电击转化法:优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广,而且转化率可高达105 / mg DNA.29.重组DNA导入植物细胞的方法⑴原生质体转化法(聚乙二醇(PEG)法):宿主细胞为原生质体比较适宜⑵电击穿孔法:操作简便,导入效率较高⑶基因枪法:优点可用于愈伤组织、叶片、茎尖等组织的转化,而不必是原生质体;缺点是转化率不高.⑷花粉管通道法:可避免植物组织培养步骤.⑸超声波法⑹农杆菌介导法:利用农杆菌T-DNA可自动转移并整合到植物细胞基因组中的特性,将外源目的基因导入植物细胞的方法.30.重组DNA导入动物细胞的方法1)显微注射法2)逆转录病毒法3)胚胎干细胞法:优点是通过同源重组构建的转染能够进行打靶即在体外就能确定整合的位点,克服了显微注射无法解决的随机整合问题.第七章(一)真核生物基因表达载体的组成特征①原核DNA序列:包括能在大肠杆菌中复制的Ori以及便于筛选的细菌抗生素抗性基因和便于目的基因插入的多克隆位点MCS.②启动子与增强子:启动子分为组成型启动子

、组织特异性启动子、诱导型启动子. 增强子对于异源启动子控制下的外源基因也具有增强转录的作用,因此,启动子和增强子的联合使用可大大提高外源基因的转录水平.大多数增强子具有组织特异性,在构建表达载体时使用宿主细胞相应组织部位的增强子以激活外源基因的表达,提高表达效率. ③终止子:不同来源的终止子对外源基因的表达有很大影响,它不仅决定外源基因转录活性也决定mRNA在细胞中的稳定性,从而影响mRNA的翻译.④内含子剪接信号:虽然许多基因的的cDNA转入哺乳动物细胞后,其表达不受有无内含子的影响,有些基因的表达需要内含子的存在.一般来说,在哺乳动物细胞的表达载体中最好有一段内含子序

列包括剪接信号以提供外源基因cDNA表达的需要.⑤polyA加尾信号: polyA可防止核酸酶对mRNA 3’末端的降解,增加mRNA在细胞中的稳定性.RNA聚合酶II 穿过poly A位点,直到成熟mRNA 3’端的下游才终止转录.当表达载体缺少poly A位点的序列时,外源基因的表达下降10倍以上.⑥选择标记基因与报告基因:在选择压力下,选择标记基因可以使少量的转化细胞从未转化的细胞中分离出来.但选择标记基因的应用也有其自身无法克服的缺陷.2.启动子和增强子的异同点:启动子:是RNA聚合酶识别和结合的一段DNA序列,位于基因的上游.是基因表达调控的重要顺式元件,具有以下特征:①序列特异性;②方向性;③位置特异性;④种属特异性增强子(enhancer):是能够增强启动子转录活性的一段DNA序列,由多个元件组成,每一个元件可以与一种或多种转录调控因子结合.特点:双向作用,无位置效应;提高转录效率;远距离起作用;组织特异性(可能特定组织才有识别并结合的反式作用因子)无基因特异性(同源基因异源基因均可)3、影响外源基因表达的因素有哪些？它们是如何影响外源基因表达的:(一)阅读框架对转化基因的影响:阅读框架是基因的编码区,包含从ATG到TAA之间的cDNA序列.外源基因的编码区只有与表达载体DNA的起始密码子相吻合时才能正确的翻译出蛋白质.(二)基因表达的调控元件:包括启动子、增强子、沉默子、终止子和衰减子.(三)翻译过程对基因表达的影响:影响因素包括翻译起始区、密码子(起始和终止)、mRNA的二级结构(四)表达系统对基因表达的影响:外源基因表达系统泛指目的基因与表达载体重组后,导入合适的受体细胞并能在其中表达,产生目的基因产物(目的蛋白).因此表达载体和受体细胞共同组成了外源基因的表达系统.外源基因的表达除受到表达载体的影响外,还受到受体细胞生长特性、表达水平、翻译后修饰及生物活性物质形成等影响.4.大肠杆菌作为外源基因表达系统有哪些优缺点？答:优势:遗传背景清楚:全基因组测序,共有4405个开放型阅读框架;繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定;基因克隆表达系统成熟完善;目标基因表达水平高;代谢途径和基因表达调控机制比较清楚.缺点:缺乏对真核生物蛋白质的复性功能;缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统;内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白;细胞周质内含有种类繁多的内毒素5、真核生物表达载体通常需要哪些构件？各构件的作用是什么？答:1.原核DNA序列:包括能在大肠杆菌中复制的Ori以及便于筛选的细菌抗生素抗性基因和便于目的基因插入的多克隆位点MCS.2.启动子与增强子:增强子对于异源启动子控制下的外源基因也具有增强转录的作用,因此,启动子和增强子的联合使用可大大提高外源基因的转录水平.3.终止子:不同来源的终止子对外源基因的表达有很大影响,它不仅决定外源基因转录活性也决定mRNA在细胞中的稳定性,从而影响mRNA的翻译.4.内含子剪接信号:虽然许多基因的

的cDNA转入哺乳动物细胞后,其表达不受有无内含子的影响,有些基因的表达需要内含子的存在.一般来说,在哺乳动物细胞的表达载体中最好有一段内含子序列包括剪接信号以提供外源基因cDNA表达的需要.5. polyA加尾信号:polyA可防止核酸酶对mRNA 3’末端的降解,增加mRNA 在细胞中的稳定性.6. 选择标记基因:只有采取有效的筛选方法,才能高效准确地将少量的转化子从大量未转化细胞中分离出来.一般情况下,载体上携带的选择基因可供细胞筛选使用. 第九章1.植物/动物转基因的方法及其各自的特点:动物转基因有:1)显微注射法2)逆转录病毒法3)胚胎干细胞法4)体细胞核移植法2.构建了基因文库后,有哪些方法可以筛选或鉴定出哪一个克隆可能含有目的基因？答:1)表型筛选法:是在宿主菌(大肠杆菌)中表达目的基因,使宿主产生新的表型或使宿主恢复其突变基因的表型来筛选目的基因.2)用核酸探针筛选目的cDNA(基因):对欲克隆的基因序列了解时,以目的基因的部分序列(DNA片段)制备探针,对文库进行筛选.3)免疫筛选(抗体筛选)目的基因:如果能够得到目的基因产物的抗体,就可以通过免疫学的方法来筛选目的基因.其使用的探针不是核酸,而是特异性抗体.4)利用数据库鉴定基因:将DNA序列输入GenBank与已知的基因序列进行比较.5)酵母双杂交系统鉴定基因:是根据真核生物转录调控特点创建的一种体内鉴定基因的方法,其筛选的基因不是“探针”的直接编码产物,而是能够与其相互作用的蛋白质的编码基因,即筛选与已知基因产物发生相互作用的蛋白的编码基因. 3.在构建cDNA克隆之前,可以用(差示杂交)来富集一特殊的核苷酸序列等.做法是:用来自能够产生目的蛋白的细胞mRNA分子同来自于另一类型细胞(不产生这种蛋白质但亲缘关系密切)的过量mRNA分子杂交.4.在基因工程中,为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物,为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA？为什么要在cDNA前加上细菌的启动子？答:原核生物一般不含内含子,在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统.当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成mRNA前提后,其中内含子部分不能被切除,所以在原核细胞中表达真核基因时不能用基因组DNA,而用cDNA.原核生物只有一种RNA聚合酶,识别原核生物的启动子,催化所有RNA的合成,不能识别真核生物的启动子.5.外源基因在大肠杆菌(原核细胞)中高效表达的策略1.有效的转录起始2.mRNA的有效延伸和转录终止3.翻译水平的优化4.提高表达质粒(或载体)的拷贝数及稳定性5.提高外源蛋白的稳定性6.外源基因在酵母菌(真核细胞)中的表达优势答:①完成全基因组测序,基因表达调控机理比较清楚;②大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉;③能将外源基因表达产物分泌至培养基中;④具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统;⑤不含有特异性的病毒、不产内毒素,被认定为是安全的;酵母菌是最简单的真核模式生物7.天然的Ti质粒不

能作为表达载体使用的原因:答a. 植物转化细胞产生大量的生长素和分裂素,阻止了生长在培养基上的细胞再生长为整株植物,因此,必须除去生长素和分裂素基因. b. 有机碱的合成与T-DNA的转化无关,而且会影响植物细胞生长,因为有机碱合成大量消耗精氨酸和谷氨酸,因此必须去除有机碱合成基因(tmt). c. Ti质粒过大,重组操作非常困难,也很难找到单一的酶切位点. d. Ti质粒不能在大肠杆菌中复制.8.运用所学知识制备胰岛素:答:选定具有免疫原型的胰岛素基因片段,将其插入表达载体,并引入到与表达载体相应的宿主细胞,构成重组体.重组体在合适的环境下培养,就可以表达、加工、生产出胰岛素.⑴大肠杆菌制备胰岛素:胰岛素A、B链的基因序列分开导入大肠杆菌,发酵后收集A、B链,通过体外将A、B链用二硫键连接起来成为有活性的胰岛素.⑵酵母制备胰岛素:胰岛素A、B链不用分开,可以一起导入酵母中,酵母可以利用真核蛋白翻译后加工系统形成有活性的胰岛素,并可以将胰岛素分泌到体外.9.与基因文库相

比,cDNA 克隆的主要优点与缺点有:优点:①cDNA 克隆以mRNA 为材料,特别适用于某些RNA 病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离.②cDNA 基因文库的筛选比较简单易行.③每一个cDNA 克隆都含有一种mRNA 序列,这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低,由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因.④cDNA 克隆可用于在细菌中能进行表达的基因克隆,直接应用于基因工程操作.⑤cDNA 克隆还可用于真核细胞mRNA 的结构和功能研究.缺点:①cDNA 文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA 文库,并且受细胞来源或发育时期的影响.②cDNA 基因文库不能直接获得基因的内含子序列和基因编码区外大量的调控序列的结构与功能方面的信息.③在cDNA 基因文库中,对于低丰度mRNA 的cDNA 克隆所占的比例则比较低,且分离也就比较困难10.抗除草剂植物作用机制:磷丝菌素食一种除草剂,可抑制植物谷氨酰胺合成酶的活性,发生致死性累计,bar基因编码磷丝菌素乙酰转移酶,使磷丝菌素乙酰化而失去毒性,抗除草剂植物可以导入bar基因,可以破坏磷丝菌素的活性,而达到抗除草剂的作用.另一种方法,可以采用认为措施使植物谷氨酰胺合成酶基因的活性提高,而大量表达谷氨酰胺合成酶,使磷丝菌素无法抑制住大量的谷氨酰胺合成酶的活性,而达到抗除草剂的作用. 11．碱变性抽提法提取质粒DNA 的基本原理是:碱变性抽提法是基于染色体DNA 与质粒DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的.在pH 高达12.6 的碱性条件下,染色体DNA 的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,质粒DNA 的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离.当以pH4.8 的NaAc 高盐缓冲液调节其pH 至中性时,变性的质粒DNA 又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA 不能复性而形成缠连的网状结构.通过离心,染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白

质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去.12.PCR 引物设计时需要注意哪些基本原则:①引物长度以20～30bp 为宜,过长过短都会降低特异性,而且过长会增加成本.②引物碱基要随机分布,避免出现嘌呤或嘧啶堆积现象,G+C 含量为45～55%左右.③引物内部不应含有回文结构,两个引物之间尤其是3`端不应有互补链存在.④引物的碱基顺序不应与非扩增区有同源性.⑤引物3`末端碱基原则上要求与模板DNA 配对.⑥引物5`末端允许有几个碱基不与模板DNA 匹配而呈游离状态,这不影响扩增的特异性.⑦引物的5`端一般加有适当限制性核酸内切酶的识别序列,便于克隆和表达,但其保护碱基有一定的要求.

13.T4 DNA 连接酶作用机制及提高平末端连接效率的方法:T4 DNA 连接酶的作用机制:①ATP+DNA ligase(E)→ E-AMP+PPi.②E-AMP 上的AMP 转移到DNA 的5′磷酸根上,使其活化,释放出酶.③活化的5′磷酸根与相邻的3′羟基形成3′,5′-磷酸二酯键,并释放出AMP.提高平头末端连接效率的方法包括:①加大连接酶用量(10 倍大于粘性末端的连接).②加大平头末端底物的浓度,增加分子间碰撞机会.③加入10%PEG8000,促进大分子之间的有效作用.④加入单价阳离子(NaCl),最终浓度150-200 mmol/L.

14.简述PCR 技术的基本原理:①变性:通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂,双链解离形成单链DNA.②退火: 当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂得多,而且反应体系中引物DNA 量大大多于模板DNA,使引物和其互补的模板在局部形成杂交链,而模板DNA 双链之间到互补的机会少.③延伸:在DNA 聚合酶和4 种脱氧核糖核苷酸底物及Mg2+存在条件下,5`→3`的聚.合酶催化以引物为起点的DNA 链延伸反应.以上3 步为一个循环,每一循环的产物可以作为下一个循环的模板, 数小时后, 介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制,数量可达2×106-7 拷贝.

15.简述影响Ⅱ型限制性核酸内切酶活性的因素有:①DNA 样品的纯度:DNA 样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性.可采用以下方法,提高酶活性:加大酶的用量,1μg DNA 用10U 酶、加大反应总体积、延长反应时间.②DNA 样品的甲基化程度:采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA,可防止DNA的甲基化.③酶切反应的温度:多数标准反应温度是37℃,如SmaI 为25℃或30℃,SfiI 为50℃.反应温度过度或过低都会影响酶活性,甚至导致酶失活.④DNA 分子结构:某些酶切割超螺旋质粒DNA 时,酶量比切割线性DNA 时高出多位,可高达20 倍.⑤核酸内切酶的缓冲液:高浓度的酶、高

浓度的甘油、低离子强度、极端pH 值等,会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性,即所谓的“星活性”现象. 16.简述琼脂糖凝胶电泳的基本原理:DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应.DNA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷,在电场中向正极移动.由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA 几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动.在一定的电场强度下,DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA 分子本身的大小和构型. 在琼脂糖凝胶电泳中,DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系.质粒DNA 样品用单一切点的酶切后与已知相对分子质量大小的标准DNA 片段进行电泳对照,观察其迁移距离,就可获知该样品的相对分子质量大小.凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA,也可以鉴别相对分子质量相同但构型不同的DNA 分子.另外在制备琼脂糖凝胶时加入溴化乙锭指示剂,溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光.当DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时,琼脂糖凝胶中的EB 就插入DNA 分子中形成荧光络合物,使DNA 发射的荧光增强几十倍.荧光的强度正比于DNA 的含量,如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照,就可比较出待测样品的浓度.若用薄层分析扫描仪检测,只需要5～lOng DNA,就可以从照片上比较鉴别.如用肉眼观察,可检测到0.01～0.1μg 的DNA. 12．什么是限制性内切核酸酶的星号活性?受哪些因素影响:Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性,但是这种特异性受特定条件的限制,即在一定环境条件下表现出来的特异性.条件的改变,限制酶的特异性就会松动,识别的序列和切割都有一些改变,改变后的活性通常称第二活性,而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示,因此第二活性又称为星活性.概括起来,诱发星活性的因素有如下几种: (1)高甘油含量＞5％,v／v);(2)限制性内切核酸酶用量过高(>100U／μg DNA);(3)低离子强度(<25 mmol／L);(4)高pH(8.0 以上);(5)含有有机溶剂,如DMSO,乙醇等;6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如

Mn2+,Cu2+,C02+,Zn2+等).

17.简述Sanger 双脱氧链终止法的基本原理:在模板指导下,DNA 聚合酶不断将dNTP 加到引物的3’-OH 末端’使引物延长’合成出新的互补的