全长cDNA主要构建方法的比较
获取全长cDNA若干方法的比较
武汉植物学研究2003,21(2):179～186J ourna l of W uhan B otan ica l R esea rch获取全长cD NA若干方法的比较陶爱林,林兴华,张端品Ξ(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,武汉 430070)关键词:全长c DNA;信使RNA;5′帽子结构;高保真PCR;比较 中图分类号:Q943 文献标识码:A 文章编号:10002470X(2003)022******* Com par ison of the Approaches for Full-length cD NA Enr ichm en tTAO A i2L in,L I N X ing2H ua,ZHAN G D uan2P in(N a tiona l K ey L abora tory of C rop Genetic Imp rove m en t,H uaz hong A g ricu ltu ra l U n iversity,W uhan 430070,Ch ina) Abstract:Fu ll2length com p lem en tary DNA s(c DNA)are crucial fo r the functi onal anno tati on of genes.Several novel exp eri m en tal app roaches fo r selective en richm en t of fu ll2length c DNA s are ou tlined in parallels.Som e k inds of reverse tran scri p tases and h igh fidelity PCR enzym es are in2 troduced fo r p rom ising h igh efficiency of accu rate fu ll2length c DNA syn thesis.T he tem p eratu re p rofiles of the reverse tran scri p ti on and PCR are also discu ssed.Key words:Fu ll2length c DNA;m RNA;5′2CA P;H igh2fidelity PCR;Com parison 生物技术突飞猛进大大提高了人类认识自身及与人类息息相关的生命现象的能力。
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。
其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。
（2）cDNA第一条链的合成。
（3）cDNA第二条链的合成。
（4）双链cDNA的修饰。
（5）双链cDNA的分子克隆。
（6）cDNA文库的扩增。
（7）cDNA文库鉴定评价。
一、Superscipt II—RT合成第一链1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAC TAGTCTCGAGTTTTTTTT TTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water（大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。
）。
2. 混匀后，70℃反应10分钟。
3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。
4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂：（1）4 ul 5×first strand buffer（2）2 ul 0.1 M DTT（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。
7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。
二、cDNA第二链的合成1. 第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。
全长cDNA文库的构建—SMART技术
【共享】全长cDNA文库的构建—SMART技术全长cDNA文库的构建—SMART技术真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA 的末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。
但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。
常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头，利用已知的接头序列再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3'末端加上一连串的G或者C（或者A/T），再通过补齐粘末端，利用已知的两头序列进行扩增。
但是这些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部分信息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上会影响结果的准确性。
另外由于mRNA容易部分降解，很难确定得到的cDNA是否就是全长的cDNA，还是cDNA的片断。
SMART技术的出现是一个新的里程碑。
这个称作Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript(SMART)，原理实际上非常简单：在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA 单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。
cDNA文库构建
cDNA文库构建概述cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA （cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。
cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。
cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。
但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。
真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。
高等生物一般具有105种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都仅有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。
cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。
原理经典cDNA文库构建的基本原理：用Oligo（dT）作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得cDNA 文库。
其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。
（2）cDNA第一条链的合成。
（3）cDNA第二条链的合成。
全长cDNA文库构建方法及应用研究
全长cDNA文库构建方法及应用研究朱利军;长孙东亭;罗素兰【期刊名称】《海南大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2009(027)002【摘要】构建全长cDNA文库是获得大量基因全序列信息的有效途径,也是进行功能基因组研究的一条经济、快速的途径,它克服了常规cDNA文库的缺点,极大地推进了功能基因组的研究,尤其是对于那些因基因组庞大而未能进行全基因组序列测定的生物来说更为重要.全长cDNA文库的研究在不断发展,几种文库构建方法已经建立,并得到了较为广泛的应用.本文重点阐述了全长cDNA文库的构建方法,对各种方法进行了分析和比较;同时对全长cDNA文库的应用也作了介绍.【总页数】6页(P185-190)【作者】朱利军;长孙东亭;罗素兰【作者单位】热带生物资源教育部重点实验室(海南大学);海南大学海洋学院;海南大学生物技术实验中心,海南海口,570228;热带生物资源教育部重点实验室(海南大学);海南大学海洋学院;海南大学生物技术实验中心,海南海口,570228;热带生物资源教育部重点实验室(海南大学);海南大学海洋学院;海南大学生物技术实验中心,海南海口,570228【正文语种】中文【中图分类】Q785【相关文献】1.适合于全长cDNA文库构建的猪苓菌核及菌丝体总RNA提取方法比较 [J], 李杨;李海娜;夏颖;刘忻壑;李艳茹;许广波2.一种构建全长cDNA文库的方法 [J], 刘红军;李青旺;吴淑云;韩增胜;刘智华;李文烨3.全长cDNA文库及构建方法与应用进展 [J], 韩慧霞4.几种全长cDNA文库构建方法比较 [J], 毛新国;景蕊莲;孔秀英;赵光耀;贾继增5.CAP-Finder方法构建人膀胱正常组织全长cDNA文库及鉴定 [J], 成瑜;张良明;李洪伦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
cDNA文库构建知识
全长cDNA文库的构建—SMART技术真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA的3'末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。
但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA 文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。
常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头，利用已知的接头序列再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3'末端加上一连串的G或者C（或者A/T），再通过补齐粘末端，利用已知的两头序列进行扩增。
但是这些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部分信息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上会影响结果的准确性。
另外由于mRNA容易部分降解，很难确定得到的cDNA是否就是全长的cDNA，还是cDNA的片断。
SMART技术的出现是一个新的里程碑。
这个称作Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript(SMART)，原理实际上非常简单：在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA 的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo （dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。
关于cDNA文库
1 cDNA 文库的构建1.1 cDNA 文库构建的基本原理与方法cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。
其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定)，要构建一个高质量的cDNA 文库，获得高质量的mRNA 是至关重要的，所以处理mRNA 样品时必须仔细小心。
由于RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无RNA 酶的环境对于制备优质RNA 很重要。
在获得高质量的mRNA 后，用反转录酶Oligo(dT) 引导下合成cDNA 第1链，cDNA 第2链的合成(用RNA 酶H 和大肠杆菌DNA 聚合酶I，同时包括使用T4 噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌DNA 连接酶进行的修复反应)，合成接头的加入、将双链DNA 克隆到载体中去、分析cDNA 插入片断，扩增cDNA 文库、对建立的cDNA 文库进行鉴定。
这里强调的是对载体的选择，常规用的是λ 噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNA。
1.2 cDNA 全长文库经典cDNA 文库的构建虽然高效、简便，但文库克隆的片段一般较小，单个克隆上的DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因的cDNA。
为了克隆到真正的cDNA 全长，建立富含全长的cDNA 文库具有重要意义。
为此，必须克服仅用mRNA 的PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作用特点所导致的局限性。
全长cDNA 文库，是指从生物体内一套完整的mRNA 分子经反转录而得到的DNA 分子群体，是mRNA 分子群的一个完整的拷贝。
cDNA文库的构建
cDNA文库的构建基因文库的构建是现代生命科学研究中的一项重要技术。
自70年代初首例cDNA克隆问世以来，已用构建和筛选cDNA文库的方法克隆了很多基因。
通过构建cDNA文库能直接分离到生命活动过程中的一些调控基因及了解这些基因所编码的蛋白质的相互作用关系．因此cDNA文库的构建是基因克隆的重要方法之一，从cDNA文库中可以筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。
它是发现新基因和研究基因功能的工具。
1.cDNA文库构建的原理真核生物基因的结构和表达控制元件与原核生物有很大的不同。
真核生物的基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。
真核生物的基因不能直接在原核生物中表达，只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA（complementary DNA,cDNA）接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达。
而且，真核细胞的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA都常通过对其cDNA来进行研究。
为分离cDNA克隆或研究细胞的cDNA 谱，需要先构建cDNA文库。
所谓cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。
cDNA文库应包含的克隆数目可由以下公式来计算：N=ln(1-p)/ln(1-1/n)式中：N－cDNA文库所包含的克隆数目；P－低丰度cDNA存在于库中的概率，通常要求其大于99％；1/n－每一种低丰度mRNA占总mRNA的分数。
2.构建cDNA文库的基本步骤构建cDNA文库的基本步骤有五步：①制备mRNA；②合成cDNA；③制备载体DNA；④双链cDN 的分子克隆；⑤对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库包含的克隆数，抽查克隆的质量和异质性，如果需要可适当扩增。
对cDNA的文库的要求：一是希望文库能包括各种稀有mRNA的cDNA克隆；二是克隆的cDNA应是全长的，避免丢掉5’端的序列。
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全长cDNA主要构建方法的比较
摘要全长cDNA文库的构建是进行功能基因组研究的一种经济、快速、有效的途径,克服了传统cDNA 文库的缺点,本文主要介绍了两种较为实用的方法，分别是SMART法和Cap trapper法。
关键词：全长cDNA构建SMART法Cap trapper法
随着测序技术和计算机科学的不断发展，大部分生物和人类的基因组全序列测定高速完成。
cDNA作为基因克隆的一种重要工具，在帮助人们更好的发现新基因和研究基因功能上发挥了巨大的作用。
但是，由于传统的cDNA由于反转录能力差，cDNA酶切位点保护不彻底和非cDNA片段插入导致克隆片段短、无效克隆多和全长率低等缺点,因而无法满足大规模、高通量、高效的功能基因组研究需要。
而全长cDNA序列大多数拥有5’和3’端非编码区序列,因而弥补了传统cDNA文库构建方法的缺陷,成为目前基因克隆的一种重要方法。
目前主要有CAPture法，Oligo capping法，SMART法，Cap jumping法以及Cap trapper 法。
本文主要介绍优点突出的两个方法，SMART法和Cap trapper法。
SMART 方法
SMART 方法是Chenchik 等1996 年提出的[3]，该方法利用PowerscriptTMRT 反转录酶的反转录、末端转移活性和内切酶sfiⅠ的特性，快速、简单地构建全长cDNA 文库。
PowerscriptTMRT 反转录酶是M-MLVR点突变而来的，丧失了RnaseH 的活性，但保留着野生型聚合酶转移酶的活性，能够长距离的反转录，又可识别mR-NA5’帽子结构。
原始一链合成中，转移酶的活性低，延伸效率低。
用于反转录的5’端poly(A)引物和延伸模板分别含有sfiI（A）、sfiI（B）识别位点的寡聚核苷酸序列。
而截短的一链cDNA，反转录酶没有识别到mRNA5’帽子结构，一链cDNA3/ 端不能被延伸、合成和扩增二链。
两端含有sfiI 识别位点的全长cDNA，经两种类型（A、B）内切酶sfiI 酶切，使两端产生不同的粘性末端，而全长cDNA 内部由于sfiI 识别位点在基因组中很少见而得以保护，这样就实现了目的全长基因的高效定向克隆。
与其他方法相比，此方法有其独特的优点（1）所需起始材料少，一般0.5~1μg mRNA（2）mRNA 在合成cDNA 前无需任何酶反应或化学反应处理，不会导致处理过程中mRNA 的降解和损耗。
（3）实验过程快速、简单，整个过程没有对mRNA 和中间产物的复杂处理。
（4）全长比例较高[13]。
SMART 方法也有其自身明显的缺点（：1）PCR 扩增具有选择性，不利于长片段序列的扩增，使一些长片段的全长基因丢失，不易得到大于3kb 片段和低峰度
全长基因[13]2）dG 加尾效率低，导致文库中基因信息丢失，文库缺乏代表性。
在实际应用中，该方法快速、简单的优点使之广受青睐[14~17]，尤其是在医学领域中应用较广[18~20]。
4 CAP- trapper 方法
CAP-Trapper 方法是由 Carninci 等提出的[4]，它是根据mRNA5’端及3’端存在一个共同二醇结构来建库。
将这种二醇结构氧化后进行生物素修饰, 再经过沉淀、酒精洗涤、无RNase 的双蒸水重新悬浮等筛选步骤, 得到生物素化的 mRNA，经反转录酶催化合成 cD-NA 第一链，接着进行 RNaseI 处理, 未被 cDNA 保护的 mRNA 被降解。
后经青链霉素磁珠吸附并使用弱碱降解 mRNA，得到单链全长 cDNA，在末端转移酶的催化下进行5’端Oligo(G)加尾，再进行第二链的合成，定向克
隆即可得到全长cDNA文库。
为了提高合成全长 cDNA 的能力和测序效果，该方法进行了改进。
一是用海藻糖、山梨糖醇热启动反转录反应。
mRNA 5’端二级结构阻碍反转录的进行，高温破坏二级结构但同时也抑制反转录酶活性。
海藻糖的加入，尤其是再附加山梨糖醇可以保证反转录酶的活性在55~60℃的高温下正常发挥，有利于全长cDNA 的合成。
二是用 Ssth 或 BsaI、BamHl\Xhol 双酶切替换 EcolI\Xhol 双酶切。
EcolI 对甲基化不敏感，容易将全长 cDNA 近端的内部已甲基化的识别位点切割。
用对甲基化敏感的限制性内切酶 Ssth 或 BsaI、BamHl 等替换EcolI，提高了文库全长比例。
三是用SSLM 法加尾克服 Oligo(G)加尾对测序的干扰[25]，虽然加尾效率（ 44%）稍抵于 Oligo(G)加尾（ 52%），但该法加尾对片段无选择性，且加尾时无须使用 MnCl2 和CoCl2，不会造成全长 cDNA 降解，还利于全长 cDNA
的转录和表达克隆[26,27]。
与其他方法相比，CAP-Trapper 方法可以说是一种较好的构建高质量全长文库方法，它兼顾了文库代表性好，全长比例高，建库效率高的优点[13,28]。
但也有些缺点（：1）mRNA 长期暴露在酶反应体系中，有降解风险（；2）各反应难于控制，所需实验技术高（；3）实验流程长，过程
复杂，耗时，费力。
由此可见，从这些文库中，研究者们不仅获得了大量有价值的全长序列，对其功能基因组进行深入研究，而且对基因组结构进行了预测。
可见，构建高质量的全长cDNA文库会带来一劳永逸的效果。
参考文献：
董志敏等，全长cDNA文库的构建方法【J】.中国农学通报，2006,22（2）：51-55
毛兴国等，几种全长cDNA文库的构建方法【A】。
遗传，2006,28（7）:865-873
朱利军等，全长cDNA文库构建方法及应用研究【A】。
海南大学学报自然科学版，2009，27
（2）：185-190
Carninci P, Kvam C, Kitamura A, et al. High efficiency full length cD-NA cloning by biotinylated CAP trapper [J].Genomics, 1996, 37 (3): 327~336
Carninci P, Nishiyama Y, Westover A. Thermostabilization and ther-moactivation of thermolabile enzumes by thehalose and its application for the synthesis of full length cDNA[J]. Proceedings of the National A-cademy of Sciences, 1998, 95:520~524 Carninci P, Hayashizaki Y. High efficiency full-length cDNA cloning[J]. Methods Ezymol, 1999, 303:19~44。