全长cDNA酶切和连接体系
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。
其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。
（2）cDNA第一条链的合成。
（3）cDNA第二条链的合成。
（4）双链cDNA的修饰。
（5）双链cDNA的分子克隆。
（6）cDNA文库的扩增。
（7）cDNA文库鉴定评价。
一、Superscipt II—RT合成第一链1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAC TAGTCTCGAGTTTTTTTT TTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water（大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。
）。
2. 混匀后，70℃反应10分钟。
3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。
4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂：（1）4 ul 5×first strand buffer（2）2 ul 0.1 M DTT（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。
7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。
二、cDNA第二链的合成1. 第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。
RACE的简介.
通过PCR的方法获得全长cDNA：
利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂 盒适合回收2.5kb以下的RACE产物； 对于长的片段，可以通过电洗脱获得好 的结果。如果你选择使用其他的纯化方 法，最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。 将全长的cDNA克隆到T/A型的 PCR克 隆载体中。
对于5‘端的RACE产物，我们建议挑取至 少8－10个不同的克隆以获得5‘端的最大 可能性的序列。（反转录并不总是进行到 mRNA模板的5’末端，尤其是长模板。 另外，T4 DNA聚合酶会移走5‘末端的0 －20个碱基。） 一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获 得多的序列信息。理想的是，可以对整个 开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻 译区。
通过PCR的方法获得全长cDNA：
在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。 通常情况下，可以见到一条单一带，如果 这样，利用胶来纯化全长的cDNA。 制备1.2%的TAE buffer制备琼脂糖凝胶。 不使用TBE buffer，TBE的胶很难制备全 长的cDNA。 将剩下的45μl反应物点样，选用适当的 marker。 利用长波紫外观察cDNA（≧300nm）切 下全长的cDNA。注意：应该尽量减少紫 外对cDNA的照射。
谢谢大家！
如果要用重叠片段来检测设计的引物， GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。 只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计 的引物是否正确。 降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物 的特异性。在最开始的循环中，退火温度 高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性 条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降 回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循 环。
cdna基因文库构建的基本路线
cdna基因文库构建的基本路线以cdna基因文库构建的基本路线为标题的文章概述CDNA基因文库是基因组学研究中的一个重要工具，可以用于克隆和表达特定基因。
本文将介绍构建cdna基因文库的基本路线，包括RNA提取、逆转录、cDNA合成、文库构建和筛选等步骤。
第一步：RNA提取构建cdna基因文库的第一步是从所研究的生物样品中提取总RNA。
这可以通过使用商业化的RNA提取试剂盒或经典的酚-氯仿法等方法来实现。
在提取RNA的过程中，需要注意样品的保存和处理，以确保所提取的RNA完整无损。
第二步：逆转录逆转录是将RNA转化为相应的cDNA的过程。
逆转录反应通常使用逆转录酶（Reverse Transcriptase）进行，该酶能够将RNA模板上的信息转录成DNA。
在逆转录反应中，需要加入随机引物、dNTPs和逆转录酶，以及适当的缓冲液。
逆转录反应的温度和时间也需要根据具体的逆转录酶和反应体系进行优化。
第三步：cDNA合成在逆转录反应完成后，需要对产生的cDNA进行纯化。
一种常用的方法是通过酶切和连接反应，将cDNA连接到载体上，形成重组DNA，再通过转化等方法将其导入到大肠杆菌等宿主中。
在cDNA 合成的过程中，需要注意对cDNA的纯化和测序质量的控制，以确保所获得的cDNA具有高质量和完整性。
第四步：文库构建文库构建是指将cDNA插入到合适的载体中，形成cdna基因文库。
常用的载体包括质粒和噬菌体等。
在文库构建的过程中，需要对cDNA和载体进行受限酶切，然后使用DNA连接酶将其连接起来。
连接后的DNA需要进行转化，将其导入到适当的宿主细胞中，形成文库。
不同的文库构建方法有所差异，可以根据实验需求选择合适的方法。
第五步：筛选构建cdna基因文库后，需要对文库进行筛选，以寻找感兴趣的基因。
常用的筛选方法包括杂交筛选、PCR筛选和基于功能的筛选等。
根据所研究的基因或表达产物的特性，可以选择合适的筛选方法。
筛选后的阳性克隆可以进一步进行测序和鉴定，以确认所克隆的基因的准确性和完整性。
全长cDNA文库的构建—SMART技术
【共享】全长cDNA文库的构建—SMART技术全长cDNA文库的构建—SMART技术真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA 的末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。
但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。
常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头，利用已知的接头序列再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3'末端加上一连串的G或者C（或者A/T），再通过补齐粘末端，利用已知的两头序列进行扩增。
但是这些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部分信息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上会影响结果的准确性。
另外由于mRNA容易部分降解，很难确定得到的cDNA是否就是全长的cDNA，还是cDNA的片断。
SMART技术的出现是一个新的里程碑。
这个称作Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript(SMART)，原理实际上非常简单：在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA 单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。
cdna基因克隆的基本原理和流程
一、CDNA基因克隆的基本原理CDNAplementary DNA）是DNA的互补序列，通过反转录酶将mRNA作为模板合成的一种DNA。
CDNA基因克隆是利用逆转录酶将mRNA逆转录合成cDNA，并通过PCR或其他方法将cDNA插入到质粒载体中，实现对目标基因的克隆。
二、CDNA基因克隆的流程1. RNA提取：首先需要从细胞中提取出总RNA，可以使用TRIzol等试剂进行RNA的提取纯化工作。
2. 反转录合成cDNA：将提取得到的RNA作为模版，利用逆转录酶进行cDNA的合成。
反转录反应通常包括RNA模版、随机引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液，并经过一系列温度循环反应，将mRNA 逆转录成cDNA。
3. cDNA纯化：为了避免反转录反应中产生的非特异性产物和杂质，需要对反转录反应产物进行纯化。
4. cDNA扩增：对cDNA进行PCR扩增，以获得目标基因的cDNA 片段。
PCR反应体系包括cDNA模板、引物、dNTPs、Taq聚合酶和缓冲液，通过一系列温度循环反应，扩增目标基因cDNA片段。
5. 酶切与连接：将PCR扩增得到的cDNA片段与质粒载体进行酶切，并在两者的黏端上连接。
6. 转化：将连接得到的质粒转化入大肠杆菌等细菌中，使其进行复制。
7. 筛选与鉴定：通过筛选和鉴定，选出携带目标基因cDNA片段的质粒，进行测序和分析，最终确定目标基因序列。
三、CDNA基因克隆的应用CDNA基因克隆技术已广泛应用于基因克隆、基因表达等多个领域。
在科研领域中，通过CDNA基因克隆技术可以方便快捷地获得目标基因的cDNA，实现对目标基因的研究和功能分析；在医药领域，CDNA基因克隆技术也被应用于基因治疗、蛋白表达等方面。
总结：CDNA基因克隆是一种重要的基因工程技术，通过反转录酶合成cDNA并将其插入到质粒中，可以方便地获取目标基因序列，具有广泛的应用前景。
掌握CDNA基因克隆的基本原理和流程对于开展相关实验研究具有重要意义。
实验酶切与连接
限制性内切酶酶切常见问题分析 问题一：DNA完全没有被内切酶切割
原因
1. 内切酶失活
2. DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等 内切酶抑制因子
3. 条件不适（试剂、温度）
4. DNA酶切位点上的碱基被甲基化
对
5. DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn 策
I）
6. DNA位点上存在其它修饰
7. DNA不存在该酶识别顺序
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G|AATTC ……3’
3’…… CTTAA|G …… 5’
在双链上交错切割的位置切割后生成
5’……G
AATTC……3’
3’……CTTAA
G……5’
各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用 而“粘合”。
平头末端：
II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别 位置是：
3’…… CTTAA|G …… 5’
在双链上交错切割的位置切割后生成
5’……G
AATTC……3’
3’……CTTAA
G……5’
各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用 而“粘合”。
一、DNA的限制性酶切实验原理
核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原 核生物中发现，功能犹似高等功物免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ侵袭。
EcoRI PrimerGST6p1-APOA1-down: 5’ CGCGTCGACTCA CTG GGT GTT GAG CTT CT-3’
SalI
粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键， 所以称为粘性末端。
一种构建全长cDNA文库的方法
一种构建全长cDNA文库的方法刘红军;李青旺;吴淑云;韩增胜;刘智华;李文烨【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2007(035)005【摘要】建立了一种以LD-PCR为基础的cDNA文库的快速构建方法.以人胎盘组织为材料获得总RNA,利用引物F1、R2在逆转录酶M-MLV的作用下合成cDNA 第1链,进而利用引物F3、R4在DNA聚合酶的作用下通过LD-PCR方法合成cDNA第2链;双链cDNA经SfiⅠ酶切,通过T4 DNA连接酶连接到经相同酶切的JG45质粒载体后构建成cDNA文库,并对文库的容量、重组率以及多样性进行了分析.结果表明,通过该方法构建的cDNA文库容量约为7.01×105 个/μgds-cDNA,重组率为96%;对随机提取的100个克隆质粒的插入序列进行分析,共获得80个不同的cDNA序列,且未见重复序列.该法构建的cDNA质粒文库具有快速、简单的特点,构建的文库质量符合要求,可用于大规模的基因分析.【总页数】3页(P1305-1306,1316)【作者】刘红军;李青旺;吴淑云;韩增胜;刘智华;李文烨【作者单位】西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌,712100;燕山大学,环境与化学工程学院生物工程系,河北秦皇岛,066004;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌,712100【正文语种】中文【中图分类】Q501【相关文献】1.适合于全长cDNA文库构建的猪苓菌核及菌丝体总RNA提取方法比较 [J], 李杨;李海娜;夏颖;刘忻壑;李艳茹;许广波2.全长cDNA文库及构建方法与应用进展 [J], 韩慧霞3.全长cDNA文库构建方法及应用研究 [J], 朱利军;长孙东亭;罗素兰4.几种全长cDNA文库构建方法比较 [J], 毛新国;景蕊莲;孔秀英;赵光耀;贾继增5.一种获得大片段克隆的SMART全长cDNA文库构建方法 [J], 董志敏;李英慧;张宝石;关荣霞;常汝镇;邱丽娟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
西南大学基因工程名词解释
α-互补：人工突变使大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因（lacZ）缺失N-端的第11-41位氨基酸，而载体则携带有lacZ基因的N-端140个氨基酸和编码区段（lacZ’），二者单独存在时均无功能，但共存于一个大肠杆菌细胞时则发生功能互补，形成具有完整活性的lacZ酶。
报告基因：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。
标记基因：是一种已知功能或已知序列的基因，能够起着特异性标记的作用。
选择标记基因用于鉴别目的DNA的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来；筛选标记基因：将携带了外源DNA片段的重组子挑选出来。
cDNA文库：将生物某一组织细胞中的总的mRNA分离出来作为模板，在体外用反转录酶合成互补的双链cDNA，然后连接到合适的载体上，并转入宿主细胞。
这种方法所形成的所有克隆的集合体叫cDNA文库。
侧翼序列：一条核酸单链上位于某一特定位置的5’或3’方向的序列。
Ct值：荧光信号达到阈值所对应的PCR循环数，它具有极好的重复性。
插入失活：当一段足够长的外源DNA片段插入到一个功能基因的编码区后，导致ORF移码或提前终止，严重破坏原基因的编码能力而使该基因失活。
插入型λ载体：通过特定的酶切位点允许外源DNA片段插入的载体。
穿梭载体：能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。
主要是质粒载体，至少有2套复制单元和2套选择标记，相当于两个载体的联合。
DNA聚合酶：是指以脱氧核苷三磷酸作为底物催化合成DNA的一类酶，它的主要活性是在具备模板、引物、dNTPs等情况下催化DNA的合成及其相辅的活性。
DNA连接酶：DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5′-磷酸根和3′-羟基生成磷酸二酯键。
这种反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的DNA 连接酶以NAD作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。
多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR。
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用测序时所构建的各片段重组质粒作模板，用新合成的加有连接酶切位点的引物扩增出需要连接的各片段。
LF1在扩增时，由于片段比较长，故分为两步进行扩增，第一步扩增后，连接到pMD-18T载体上，再用此作模板进行第二次扩增。
得到所需的加有酶切位点和启动子序列的目的片段，再将其克隆到pMD-18T载体上。
使用时每次从载体上切取目的片段进行连接。
F5、F6和F7片段的连接，F5(Not I/ Fsp I)、F6(Fsp I/Csp45 I)、F7(Csp45 I/Sal I)分别进行酶切，将载体pGEM5zf同时进行Not I/Sal I双酶切，分别将各酶切产物进行纯化回收。
由于F5片段和载体pMD18-T大小相近，故无法回收酶切后的目的片段，所以F5片段直接采用
酶切buffer F5用buffer D、F6用buffer B、F7用buffer D
F21和F22的连接，将F21和F22 PCR测序片段分别用Nhe I酶切后，回收目的条带，将二者用T4 DNA酶连接后，克隆到T-easy载体上。
即为连接全长所用的F2片段。
连接时，直接用设计时的两端酶切位点。
LF3和LF4同样用Acc III酶切后，用T4 DNA连接酶连接，再克隆到pMD-18T载体上，用于5’半长的连接。
F21、F22连接酶切体系：
Nhe I 1µl；10×M buffer 2µl；DNA 17µl；
F3、F4连接酶切体系：
Acc III 1µl；10×F buffer 2µl；BSA 0.2µl；DNA 16.8µl。
37℃3h酶切。
纯化回收时，注意各种限制性酶的灭活(65℃,10min)。
连接体系：
T4 DNA连接酶buffer 2µl；T-easy(F2) or pMD-18T(F34) 2µl；回收DNA片段15µl；T4 DNA连接酶1µl。
16℃6h，再4℃过夜。
转化感受态JM109。
酶切后纯化回收时，依据连接时DNA的用量，最后一步适量入无核酸酶水。
全长连接体系：20µl
T4 DNA连接酶1µl
10×buffer 2µl
5’-half 8µl
3’-half 8µl
pGEM-5zf(+) 1µl
16℃连接6小时后，4℃放置过夜，次日下午转化。
分别取10µl转化一管感受态JM109。
涂板，挑斑，鉴定。