新基因全长cDNA的克隆策略
谢瓦氏曲霉间型变种YchF基因cDNA全长克隆及序列分析
通讯作者， ｌ ｉ ｕ ｚ ｕ ｏ ｙ ｉ ＠ｙ ａ ｈ ｏ ｏ ． ｃ ｏ ｍ． ｃ ｎ
摘 要 从 谢 瓦 氏曲霉 间型变 种期差 异表 达 的序 列标 签 Ａ０ １ ２ ８ ． ８ ６ ０ ， 以其序 列为 模板 设计 特 异性 引物 ， 利用 Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ及 Ｒ ＡＣ Ｅ技术 克 隆获 得 了该 基 因 的全 长 ｃ Ｄ— ＮＡ， 命名 为 ｅ ｙ ｃ Ｆ 。 生 物信 息学 分析 显示 ， 该基 因包 含一 个 １ １ ８ ２ ｂ ｐ的完整 开放 阅读 框（ Ｏ Ｒ Ｆ ） ， 编码 ３ ９ ３个 氨 基酸， 相对分子质 量为 ４ ３ ． ４ ６ ６ ９ ｋ Ｄ， 预 测 的 理 论 等 电点 为 ６ ． ９ ９ ， 包 括一个 保守 的 Ｇ ｄ ｏ ｍａ ｉ ｎ（ ｇ ｕ ａ ｎ ｉ ｎ ｅ ｎ ｕ － ｃ ｌ ｅ ｏ ｔ ｉ ｄ ｅ — ｂ ｉ ｎ ｄ ｉ ｎ ｇ ｄ ｏ ｍａ ｉ ｎ ） 和一 个 Ｔ ＧＳ（ Ｔ ｈ ｒ ＲＳ ， Ｇ Ｔ Ｐ ａ ｓ ｅ ， Ｓ ｐ ｏ Ｔ ） ｄ ｏ ｍａ ｉ ｎ ， 为疏 水蛋 白。 序 列 同源性 分析 表 明： 该 基
Ｃｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ Ｆ ｕ ｌ ｌ Ｌｅ ｎ ｇ ｔ ｈ Ｙ ｃ ｈ Ｆ ｃ ＤＮＡ ｉ ｎ Ａ ｓ ｐｅ ｒ 一
・ Ｕｕ ’ ’ ｓ Ｃ ｈｅ ’ ｙ １ ・ ｎ ・ Ｖａ ｒ ． ｍ ・ ｔ ｅｒ ｍｅ ｄｉ １ － ｕ ｓ
Ｌｉ Ｘｉ ａ ｏ ｘｉ ａ 。 Ｔａ ｎ Ｙｕ ｍｅ ｉ ， Ｌｉ ｕ Ｙｏ ｎｇ ｘ ｉ ａ ｎ ｇ ， Ｌｉ ｕ Ｚｕ ｏ ｙ ｉ
１ Ｇｕ ｉ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｕｎｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｇｕ ｉ ｙ ａ ｎ ｇ， ５ ５ ０ ０ ２５ ； ２ Ｇｕ ｉ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｋｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｆ ｏ ｒ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕｒ ａ ｌ Ｂｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｇｕｉ ｙ ａ ｎ ｇ ， ５ ５ ０ ０ ０ ６ ；３ Ｇｕｉ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｂｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ — ｎｏ ｌ ｏ ｇ ｙ， Ｇｕ ｉ ｙ ａ ｎ ｇ ， ５ ５ ０ ０ ０ ６ ； ４ Ｇｕ ｉ ｚ ｈ ｏ ｕ Ａｃ ａ ｄ ｅ ｍｙ ｏ ｆＡｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ， Ｇｕ ｉ ｙ ａ ｎ ｇ ， ５ ５ ０ ０ ０ ６
玉米基因组全长cDNA序列获得的辅助策略及其效用评价
ＷＡ Ｇ Ｙ— ｎ Ｅ Ｇ Ｄ —ｉ ｇ Ｂ Ａ ｕ — ｎ Ｎ ｉｕ ，Ｄ Ｎ ｅｘ ｎ ， Ｉ Ｎ Ｙ ｎｌ ｇ ｊ ａ ｏ
ｃＮ Ｄ Ａ序列 。 以 玉 米 为 例 ， 米起 源 于 节 段 异 源 多 玉
为其 他物种 的基 因组学 研究 提供 参考 。
１ 材料 和 方法
１ １ 供试 材料 ．
玉米 自交系 Ｍ １ 河南 农 业 大 学 汤 继华 教 授 ｏ７由
惠赠。 １ ２ 试 验 方 法 ． １２ １ 基 因 组 总 Ｄ Ａ 和 Ｒ Ａ 提 取 基 因 组 总 ．． Ｎ Ｎ
维普资讯
● Ｃ Ｔ ● ＪＢ Ｉ Ｕ Ｔ Ｒ Ｅ Ｒ Ｃ ＬＵ ｇ Ｂ Ｒ Ａ Ｉ ＳＨ ∞ Ｏ Ｆ Ｌ ＩＩ －
华 北 农 学 报 ・ ０ ８， ３ 增 刊 ） １ ． ２ ２０ ２ （ ：略及 其效 用评 价
ｏ ｄ ｆｒａ ｈ ｅ ｉ ｇｆ ｌ ｌｎ ｔ ＤＮＡ ｅ ｕ ｎ ｅｉ ｉｅｇ ｎ ｍｅ，ｔ ａ ｒ ｔｐ ｂ ｔｐ ａ ｐ ａ ｈ。ｃ ｎ ｅ ｖ ｄ ｄ ｍａｎ ｓｒｔ ｐｅ ｏ ｃ ｉｖｎ ｕ ｌ ｅ ｇｈ ｃ ｓ ｑ ｅ ｃ ｎ ｍａｚ ｅ ｏ ｈ ｔｗｅｅｓｅ ｙｓｅ ｐ ｒ ｃ ｏ ｏ ｓ ｒ ｅ ｏ ｉ ｔａ —
水平 上 对基 因的活动规 律进 行解 析 。功 能基 因组学 研究中。 目的基 因 全 长 ｃ Ｎ Ｄ Ａ序 列 的 获 得是 基 因功
组 较为复 杂 的生物 。 如玉米 、 麦基 因组 学研究 的关 小
键 点所在 。
本研 究 以玉米 Ｄ Ａ拓 扑异构 酶 工基 因 Ｔｐ Ｎ ｏｌ的 克隆为 实例 。 展 了获得 目的基 因全 长 ｃ Ｎ 序 列 发 ＤＡ 的 ３种辅 助 策 略 ： 步 展示 法 、 守 结 构 域 策 略 和 逐 保
获取全长cDNA若干方法的比较
武汉植物学研究2003,21(2):179～186J ourna l of W uhan B otan ica l R esea rch获取全长cD NA若干方法的比较陶爱林,林兴华,张端品Ξ(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,武汉 430070)关键词:全长c DNA;信使RNA;5′帽子结构;高保真PCR;比较 中图分类号:Q943 文献标识码:A 文章编号:10002470X(2003)022******* Com par ison of the Approaches for Full-length cD NA Enr ichm en tTAO A i2L in,L I N X ing2H ua,ZHAN G D uan2P in(N a tiona l K ey L abora tory of C rop Genetic Imp rove m en t,H uaz hong A g ricu ltu ra l U n iversity,W uhan 430070,Ch ina) Abstract:Fu ll2length com p lem en tary DNA s(c DNA)are crucial fo r the functi onal anno tati on of genes.Several novel exp eri m en tal app roaches fo r selective en richm en t of fu ll2length c DNA s are ou tlined in parallels.Som e k inds of reverse tran scri p tases and h igh fidelity PCR enzym es are in2 troduced fo r p rom ising h igh efficiency of accu rate fu ll2length c DNA syn thesis.T he tem p eratu re p rofiles of the reverse tran scri p ti on and PCR are also discu ssed.Key words:Fu ll2length c DNA;m RNA;5′2CA P;H igh2fidelity PCR;Com parison 生物技术突飞猛进大大提高了人类认识自身及与人类息息相关的生命现象的能力。
cdna法获得目的基因科学家故事
CDNA法是一种基因克隆技术，它通过合成RNA的互补DNA链来获取特定基因的DNA序列。
下面我们将介绍一个科学家在使用CDNA法获得目的基因的故事，展示了这一技术在生命科学领域的重要应用。
一、科学家背景这位科学家名叫李明，是一位优秀的分子生物学家。
他在大学时就展现出对生物学的浓厚兴趣，毕业后前往美国一家知名的生物技术公司工作。
在这家公司，李明深入研究了CDNA法的原理和应用，并成功地利用该技术克隆了多个目的基因。
二、CDNA法的原理CDNA法是一种重要的基因克隆技术，它利用了生物体中DNA的转录和逆转录过程。
具体来说，CDNA法通过以下步骤获得目的基因的DNA序列：1. 提取RNA：从目的细胞或组织中提取总RNA。
这一步需要严谨的实验操作，以确保RNA的完整性和纯度。
2. 逆转录：利用逆转录酶将RNA转录成互补的DNA链，即cDNA。
这是CDNA法的关键步骤，也是其得名的原因。
3. 克隆cDNA：将得到的cDNA插入到适当的载体中，经过转化、筛选等步骤，最终获得目的基因的克隆。
三、科学家故事李明在公司工作期间，获得了一个重要的研究项目：克隆一种与人类疾病相关的基因。
这个基因对研究某种遗传疾病的发病机制非常重要，因此克隆它具有重要的科学意义和潜在的医学应用价值。
在这个项目中，李明首先需要获取这种基因的DNA序列，并将其插入适当的表达载体中，以便在细胞中表达其蛋白。
通过查阅文献和分析公开数据库，李明确定了这种基因在人类组织中的表达模式和序列信息，然后开始着手使用CDNA法进行克隆。
他从实验室中获得了大量的人类细胞系，并提取了其中的总RNA。
这一步骤需要精密的实验技术和仪器，以确保RNA的完整性和纯度。
经过多次尝试和改进，李明终于获得了满意的RNA样本。
他使用逆转录酶将RNA逆转录成cDNA。
由于目标基因的转录水平并不高，在这一步骤中需要特别小心地选择适当的引物和反应条件。
经过一段时间的努力，李明成功地得到了目的基因的cDNA序列，并将其插入了表达载体中。
拟南芥全长cDNA研究进展
拟南芥全长cDNA研究进展【摘要】全长cdnas是基因组序列注释和基因及其产物功能分析的基础。
目前共分离了155，144个riken拟南芥全长（raf）cdna 克隆。
将得到的155，144个rafl cdnas进行了3’端表达序列标签聚类成14，668个非冗余cdna类，其中60%预测到基因。
同时已从14，034个非冗余cdna类中获得了5’ests，并构建成启动子文库。
rafl cdnas序列数据库的建立有助于启动子分析、预测出转录本单元的正确注释和基因产物的注释。
而且，全长cdnas还为表达谱分析、功能分析和植物蛋白结构分析提供了宝贵的资源。
【关键词】拟南芥；cdna拟南芥因其具有个体小，世代周期短和转化率高等特点，因此在植物研究中被广泛的作为一种模式生物。
为了将拟南芥的小基因组测序，日本、欧洲和美国的科学家共同合作完成了拟南芥基因组测序工程。
拟南芥5条染色体中的2条（2号和4号染色体，不包括核仁组织区和着丝点区）在1991年进行了测序，其余3条染色体在2000年进行了测序。
2001年5月，大约127，000个拟南芥表达序列标签（ests）被提交到est数据库（dbest）。
其中的序列来自法国，美国和日本共同合作的大范围est工程。
这些工程已从不同的组织、器官、种子和发育阶段的拟南芥中获得est数据。
然而，这些基于cdna文库的est工程中的大部分的插入片段都不是全长的。
ests有助于为表达基因提供标签，大圣无法进行基因功能的进一步研究。
因此，全基因组范围的获得表达基因的全长cdna，对于在功能基因组学领域中分析基因及其产物的表达标签和功能是十分重要的。
1.拟南芥全长cdna文库的构建目前已应用biotinylated cap trapper法建立了拟南芥的全长cdna文库。
最近，研究人员有将trehalose-ther-moactivated 反转录酶应用到cap trapper法中，构建了不同处理的拟南芥全长cdna文库。
基因克隆技术
• 对RACE的片段进行验证，以确定是否已经扩增了目 的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家 族的成员，验证是非常有用的。
• 有3种验证RACE产物的方法： （1）比较由GSP和NGSP获得RACE产物。 （2）Southern blot （3）克隆并测序
• 建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要 嵌套引物的存在。
•Molecular Biology Course
基因克隆技术
1 RACE技术 2 cDNA差示分析法 3 Gateway大规模克隆
技术 4 基因图位克隆法 5 鸟枪法
……
•Molecular Biology Course
2 cDNA差示分析法
类型
2.1 基本前提 2.2 差异显示技术 DDRT-PCR （课下自学）
• 与PCR结合的快速分离差异基因的方法。 方法 • 分别提取实验组和对照组mRNA合成双链cDNA • 选择能识别 4 碱基的限制性内切酶切割
2.6.6 cDNA差示分析法- SSH
• 分别连接2个接头 • 加温去掉12碱基短链
• PCR
2.6.6 cDNA差示分析法- SSH
• 分别连接2个接头 • 加温去掉12碱基短链
•Molecular Biology Course
第五章：
分子生物学 研究方法（上）
•Molecular Biology Course
2 主要核酸操作技术
核酸凝胶电泳技术 突变位点的检测
克隆（clone/ cloning ） 定义（P182）：
多瘤病毒感染的FR3T3细胞
正常的FR3T3细胞 提取mRNA
总mRNA 合成cDNA
cdna基因文库构建的基本路线
cdna基因文库构建的基本路线CDNA基因文库构建是一种常用的分子生物学技术，用于研究基因表达和功能的调查。
本文将介绍CDNA基因文库构建的基本路线，包括材料准备、RNA提取、反转录、合成cDNA、构建文库和筛选等步骤。
一、材料准备进行CDNA基因文库构建之前，需要准备一些实验材料和试剂。
主要包括：1. 细胞或组织样品：可以是人类、动物或植物的细胞或组织样品。
2. 细胞破碎液：用于细胞破碎和RNA保护，常用的有三种类型：TRIzol、RNeasy Mini Kit和RNAiso Plus。
3. 反转录试剂盒：包括反转录酶、随机引物、dNTPs等。
4. 克隆载体：用于构建基因文库的载体，常用的有质粒载体和噬菌体载体。
5. 细菌培养基和抗生素：用于细菌的培养和筛选。
二、RNA提取RNA提取是构建CDNA基因文库的第一步，目的是从细胞或组织样品中提取总RNA。
常用的提取方法有酚/氯仿法、硅胶膜法和磁珠法等。
提取的RNA应具有较高的纯度和完整性，以保证后续的反转录和文库构建质量。
三、反转录反转录是将提取的RNA转录成cDNA的过程。
在这一步中，需要将RNA模板与反转录酶、随机引物、dNTPs等反转录试剂一起反应，合成cDNA。
反转录的条件包括温度、时间和反应体系等，需要根据试剂盒的说明进行操作。
四、合成cDNA合成cDNA是将反转录得到的第一链cDNA转录成双链cDNA的过程。
一般采用PCR扩增的方法，在反应中加入适量的引物和dNTPs，进行多轮扩增，最终得到足够量的双链cDNA。
合成cDNA的条件包括PCR扩增的循环数、温度和时间等。
五、构建文库构建基因文库是将合成的cDNA插入到克隆载体中的过程。
常用的构建方法有限制性内切酶法、T/A克隆法和引物扩增法等。
在构建文库的过程中，需要将双链cDNA与克隆载体进行连接，形成重组DNA。
连接后的重组DNA可以通过转化到适当的宿主细胞中，得到大量的重组质粒。
六、筛选构建完基因文库后，需要进行筛选以获得感兴趣的基因。
cDNA测序和表达谱研究
②电脑克隆全长cDNA
与UniGene的构成非常类似， 也是应用序列相似性进行排列组合。 不同之处： 除充分利用EST数据外， 还要利用基因组DNA序列基因预测结果。 电脑克隆时，需要与上述核苷酸及蛋白质数据库进行同源性比 较分析以确定是否可能含有全长的ORF。 若同源性较高，则易判断； 若同源性较低或没有同源性，则较难确定。此时，在保证顺序 正确的同时，对翻译的顺序进行结构功能域和比较基因组分 析，可帮助确定是否含有ORF。
目前，美国NIH启动了全长cDNA计划—哺乳动物基因采集 计划(Mammalian Gene Collection Project) ，加之 其他国家的加入，大大加快了全长cDNA的识别和克隆 工作。 中国的人类基因组计划起步较晚，但坚持“有所为，有 所不为”的原则，充分利用自己的资源优势和研究基 础，提出对特殊组织如造血细胞、神经内分泌细胞、 树突状细胞、胚胎器官等,或疾病如白血病、肝癌等进 行大规模EST测序,进行基因表达谱分析，同时完成1％ 人类全长cDNA的识别和克隆任务。
UniGene：
为了弄清EST间的关系，美国国立生物技术 信息中心(NCBl)根据EST相似性比较进行聚 类分析，形成数据库UniGene (／UniGene) 当前cDNA测序的趋势: 由对EST的随机测序， 转向全长cDNA的克隆和测序。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
随着人类基因组计划(H GP)和其它模式生物基因组计划的相继完成, 生命科学 已经进入了后基因组学时代(post genomics)。 在对基因组结构进一步了解的
同时,功能基因组学逐渐成为核心内容. 基因组序列测定的完成仅仅是基因组
计划的第一步, 更大的挑战在于如何确定基因的功能和阐述其调控的机制与 表达规律。 因而,基因功能研究已成为生命科学领域中的重大课题, 它将是21 世纪生命科学研究的重要领域. 那么,对于一个未知的新基因,如何对它制定基 因功能的研究方案从而进行全面和系统的研究是每个基因功能研究者面相 似的基因。
• 如果只知道某个基因的一段碱基序列,可以采用 RACE(cDNA 末端快速扩增)或反向
PCR和锚定 PCR方法克隆该基因的 cDNA全长序列的引物进行序列分析。
• 所有DNA片段；
• 2.连接至载体；
• 3.转化到受体细胞扩增；
• 4.目的序列的筛选鉴别。
• 如果已知一个基因的序列，那么可以通过已知序列设计引物，然后通过PCR技术获 得目标DNA片段。
• 如果一个或多个物种的某种基因已经被分离，可以通过同源性对比找到的保守性
• 转座子是染色体上一段可移动的DNA片段，它可从染色体的一个位置跳
到另一个位置。当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基 因的失活，并诱导产生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时， 失活基因的功能又可得一恢复。遗传分析可确定某基因的突变是否由转 座子引起。由转座子引起的突变便可部分突变株DNA序 列的克隆，。
• 目前基因功能的基本策略： • 1 .新基因全长 cDNA的克隆策略； • 2 .通过生物信息学预测新基因的功能； • 3 .新基因的表达谱分析；
• 4 .基因功能的研究方法；
• 5 .基因编码产物相互作用蛋白的研究。
新基因全长cDNA的克隆策 略
•
在研究新基因的功能之前，首先要通过基因克隆实验得到新基因全长 cDNA序列。
• 转座子示踪技术可用于酵母和植物的克隆；
• 基于图谱的基因克隆方法(m ap-based clo ning)依赖于遗传图谱和
物理图谱,可用来分离与已知分子标记紧密连锁的基因,包括染色
体跳查和染色体歩查；
• 硅片克隆(silico cloning),即不经过实验室工作, 将网络中的数据资
料进行整理分析和拼接,得到新基因的全长序列。