OsRUS2.1酵母双杂交猎物载体的构建及其细胞毒性和自激活作用检测
组蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用检测
人肝再生增强因子的酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用检测
人肝再生增强因子的酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用检测佟明华;陈思强;孔祥平;姚汝华;易学瑞;杨联萍【期刊名称】《实用临床医学（湖北）》【年(卷),期】2003(017)002【摘要】目的构建肝再生增强因子的酵母双杂交诱饵质粒，为进一步研究其相互作用蛋白奠定基础。
方法将人肝再生增强因子的编码序列重组入pGBKT载体中，经酶切及序列分析鉴定构建正确后，转化酵母AHl09菌株，转化子在SD／-His／-Trp选择培养基上培养；滤纸法β-半乳糖苷酶活性测定；Westem blot检测目的蛋白表达情况。
结果正确地构建了人肝再生增强因子的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-hALR，其酵母AHl09转化菌在SD／-Trp培养基上30℃培养65h，长出φlmm菌落，而在SD／-Trp-His培养基上不生长，β-半乳糖苷酶活性检测呈阴性。
Westem blot结果显示目的蛋白以35KD的融合蛋白形式表达。
结论诱饵质粒pGBKT7-hALR对宿主菌AHl09没有毒性作用，能稳定表达目的蛋白，不能自身激活报告基因，可用于酵母双杂交的筛选工作。
【总页数】3页(P16-18)【作者】佟明华;陈思强;孔祥平;姚汝华;易学瑞;杨联萍【作者单位】解放军第458医院传染病中心，广州510602;毕南理工大学生物工程系【正文语种】中文【中图分类】Q784【相关文献】1.玉米ZmMPK5酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用检测 [J], 马芳芳;王瑞云;蒋明义2.西瓜食酸菌TA基因酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测 [J], 胡金凤;黄成文;刘君3.VSV糖蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测 [J], 韩岩岩;宋德光4.组蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用检测 [J], 李玮妮;李法曾;张浩;陈立涵;程龙;徐小洁;刘婕;叶棋浓5.OsRUS1酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用检测 [J], 潘家强;侯学文因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人CDK2-AP1(DOC-1)酵母双杂交诱饵质粒自激活作用鉴定
Ｃ Ａ Ｏ Ｌ ｉ － ｘ ｕ ｅ Ｊ ｌ Ｎ Ｗ ｅ ｉ ， Ｚ Ｈ Ｅ ＮＧＪ ｕ ｎ ， Ｌ Ｉ Ｊ ｉ ａ ｎ — Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆＯ ｒ ａ ｌ ａ ｎ ｄ Ｍａ ｘ ｉ ｌ ｌ ｏ ｆ ａ ｃ ｉ ａ ｌ Ｓ ｕ ｒ ｇ ｅ ｒ ｙ ， Ｓ ｗｍ ａ ｔ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ， Ｆ ｏ ｕ ｒ ｔ ｈ
ｈ ｙ ｂ ｉ ｒ ｄ ｓ ｖ ｓ ｔ ｅ ｍ ａ ｎ ｄ ｔ ｏ ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｔ ｈ ｅ ｐ ｏｔ ｒ ｅ ｉ ｎ ｔ ｈ ａ ｔ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ａ ｃ ｔ ｓ ｗ ｉ ｔ ｈ ｐ １ ２ Ｄ ０ ｃ 。 ‘ ｃ ０ Ｋ ２ ‘ Ａ Ｐ １Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｔ ｈ ｅ ｂ ａ ｉ ｔ ｐ ｌ ａ ｓ ｍｉ ｄ ｐ ＢＤ． Ｄ ＯＣ． １ ｗ ａ ｓ
倪 前伟 孙 沫逸 戴 建武 韩津 曹立 雪 金 伟 郑军 李建虎
【 摘要 】 目的 验证诱饵质粒 ｐ Ｂ Ｄ — Ｄ Ｏ Ｃ 一 １ 在酵母双杂 交系统 的 自 激 活性及毒性 作用 ， 为应用 酵母双杂交 系
统（ ｙ ｅ ａ ｓ ｔ ｔ ｗ ｏ — ｈ ｙ ｂ ｉ ｒ ｄ ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ） 筛选与 ｐ １ ２ 。 ｃ Ｄ Ａ Ｐ 相互作用 的蛋 白建立实验基 础。方法 将诱饵质粒 ｐ Ｂ Ｄ — Ｄ Ｏ Ｃ 一 １ 转化到酵母细胞 ＭＡ Ｖ ２ ０ ３中， 检测诱饵蛋 白有无毒性和 自激 活作用 。同时利用 对照质粒组筛选 组氨酸 （ Ｈ ｉ ｓ ） 本 底 表达抑 制剂 ３ Ａ Ｔ（ ３ 一 氨 基． １ ， ２ ， ４ 一 三唑） 的合适 工 作浓 度 。结 果 诱 饵 质粒 ｐ Ｂ Ｄ ・ Ｄ Ｏ Ｃ — ｌ成 功转 化 到 酵母 细 胞 ＭＡ Ｖ ２ ０ ３中， 对宿 主酵母细胞无毒性 ， 对报告基 因无 自激 活作用 。确定 了组氨酸 （ Ｈｉ ｓ ） 本底 表达抑制 剂 ３ Ａ Ｔ（ ３ ・ 氨 基． １ ， ２ ， ４ ． 三唑 ） 的合适工作浓度。结论 诱饵 质粒 ｐ Ｂ Ｄ — Ｄ Ｏ Ｃ 一 １ 可 以用于酵母 双杂交实验 ， 为进一步运用酵。
《酵母双杂交系统》课件
01
明确研究目标，确定需要验证的蛋白间相互作用或筛选与特定
蛋白相互作用的候选蛋白。
挑选合适的酵母菌株
02
根据研究目的选择适合的酵母菌株，如用于筛选候选蛋白的酵
母菌株或用于验证已知相互作用蛋白的酵母菌株。
构建诱饵和猎物蛋白的表达载体
03
将目的蛋白分别克隆到酵母表达载体上，构建诱饵和猎物蛋白
的表达载体。
应用领域
蛋白质互作网络研究
利用酵母双杂交系统可以大规模地筛选蛋白质之间的 相互作用，构建蛋白质互作网络。
疾病机制研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，有助于深入了解 疾病的发生和发展机制。
药物靶点发现
发现新的药物靶点，为药物研发提供新的思路和方向 。
02
酵母双杂交系统的实验流程
准备阶段
确定研究目的
基因表达调控研究
研究转录因子与DNA的结合
利用酵母双杂交系统可以筛选与特定DNA序列结合的转录因子，进而研究其在基因表达调控中的作用 。
发现新的转录因子
通过与已知转录因子的相互作用筛选，可以发现新的转录因子，进一步揭示基因表达调控的机制。
药物发现与设计
寻找药物靶点
利用酵母双杂交系统可以筛选与药物作用靶点相互作用的蛋白质，为药物发现提供潜在 的靶点。
对生命科学领域的影响与贡献
促进基础研究
酵母双杂交系统作为一种强大的研究工具，有助于深入揭示生命 过程的奥秘，推动生命科学领域的基础研究。
疾病机制与治疗研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，为疾病机制的解析和药物研发 提供有力支持。
生物技术产业
酵母双杂交系统的应用有助于推动生物技术产业的发展，如新药发 现、生物制品开发等。
VSV糖蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测
VSV糖蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测韩岩岩;宋德光【摘要】构建水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）酵母双杂交诱饵载体，检测其在酵母细胞中的表达和自激活作用，为进一步研究酵母双杂交系统筛选与VSV-G相互作用蛋白奠定基础。
通过RT-PCR方法从水泡性口炎病毒（VSV）克隆糖蛋白（G）基因， BamH I和Sal I双酶切后连接诱饵载体pSos，获得诱饵质粒pSos-VSV-G，经测序鉴定后pSos-VSV-G转化到酵母菌株cdcH25（α），在营养缺陷培养基中观察pSos-VSV-G的自激活作用和毒性作用，同时利用蛋白印迹法分析诱饵蛋白的表达。
成功扩增VSV-G基因，并准确克隆入pSos中，诱饵载体pSos-VSV-G成功转化到酵母菌株cdcH25（α）中，经表型筛选检测无自激活作用和毒性作用，蛋白印迹法检测证实pSos-VSV-G在酵母细胞中表达诱饵蛋白。
可以利用酵母双杂交系统筛选与VSV-G相互作的蛋白质。
%It was to construct a bait vector for vesicular stomatitis virus glycoprotein(VSV-G)and detect its protein expression and self-activation activity in yeast cells, as a basis for further study of screening and VSV-G protein interaction in two hybrid system. Fragment of VSV-G gene were amplified using RT-PCR and directly ligated to pSos vector, insert-contained plasmid was confirmed by restriction endonuclease analysis and DNA sequencing. The self-activation and toxicity of the bait plasmid transformed into the yeast cellscdcH25(α)was observed in selective culture medium, and the bait protein was confirmed by Western blot. Results showed that VSV-G gene was found in the reconstructed plasmid pSos-VSV-G by sequencing. Yeast two-hybrid tests showed that yeast ce lls cdcH25(α)transfected with pSos showed that VSV-G had no self-activation and toxicity, the expression of bait protein was confirmed by Western blot. The yeast two-hybrid system can be applied to screen the interacting proteins of VSV-G.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2014(000)004【总页数】6页(P109-114)【关键词】水泡性口炎病毒;糖蛋白;酵母双杂交;诱饵载体【作者】韩岩岩;宋德光【作者单位】遵义医学院公共卫生学院，遵义563003;吉林大学畜牧兽医学院，长春 130062【正文语种】中文水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）是引起人和多种哺乳动物水泡性口炎（Vesicular stomatitis，VS）的病原［1］。
酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-cide-3的构建、鉴定以及毒性、自激活
酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-cide-3的构建、鉴定以及毒性、自激活酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-cide-3的构建、鉴定以及毒性、自激活效应的检测闵婕;李青;马楠;康艳霞;李娜【期刊名称】《现代肿瘤医学》【年(卷),期】2013(021)003【摘要】Objective;To construct a bait vector containing human cide -3 gene in yeast two -hybrid system in order to screen the human liver cDNA library. Methods; The fragment including all exons of cide -3 gene was amplified by RT-PCR and was inserted into the multiple cloning sites of the shuttle vector pGBKT7. After confirmation with restricted endonuclease digestion and sequence analysis,by using PEG/LiAC method,the plasmid pGBKT7 - cide -3 was transformed into yeast AH109. The plasmid and protein isolated from the positive yeast AH109 clone was tested its expression,toxicity and transcriptional activation. Results:The human cide -3 cDNA was amplified. The restrictive endonuclease digestion and DNA sequencing proved that the plasmid pGBKT7 - cide - 3 was obtained. The yeast AH109 clone transformed with pGBKT7 - cide - 3 was screened out by the SD/ - Trp nutritional media. Sequence analysis revealed that the fragment was correctly inserted into pGBKT7 with a right reading frame and its expression in yeast was verified. Conclusion; The bait plasmid pGBKT7 -cide -3 constructed expresses correctly,and can not activate the transcription of。
SIGIRR胞内区酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活作用检测
SIGIRR胞内区酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活作用检测陈旭昕;冯华松;段蕴铀;吴学玲;钱桂生【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2014(43)10【摘要】目的：构建单免疫球蛋白白细胞介素-1受体相关蛋白（SIGIRR）胞内区酵母双杂交诱饵质粒，并检测其是否存在自激活作用。
方法聚合酶链反应（PCR）扩增人SIGIRR胞内区基因片段（480～1230 bp），并将此基因片段重组入pSos 载体中，构建诱饵质粒pSos-SIGIRR ，经酶切及测序鉴定构建正确后，将重组质粒与对照质粒共转化感受态酵母菌cdc25H ，接种于25℃SD/Glucose（-UL）和SD/Galactose（-UL）平板以及37℃ SD/Glucose（-UL）和SD/Galactose（-UL）平板上，连续观察6 d酵母菌生长状况；用Western blot法检测目的蛋白表达情况。
结果正确构建了人SIGIRR胞内区酵母双杂交诱饵质粒pSos-SIGIRR ，pSos-SIGIRR在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用。
Western blot结果显示，目的蛋白以170×103的融合蛋白形式表达。
结论诱饵质粒pSos-SIGIRR可应用于酵母双杂交系统中，为在人肺互补脱氧核糖核酸（cDNA ）文库中寻找与SIGIRR相互作用蛋白奠定了重要基础。
%Objective To construct the bait plasmid of pSos-single immunoglobin IL-1 receptor related protein (SIGIRR) in Cy-toTrap yeast two hybrid system ,and to test its self-activation .Methods The cDNA fragments of SIGIRR(480 -1 230 bp) were amplified from pReceiver-LV19-SIGIRR and ligated into the bait plasmid pSos to generate the plasmid pSos-SIGIRR .The pSos-SI-GIRR was identified by DNA sequencing and dual-site endonuclease digestion .Thenthe recombinant plasmid and control plasmid were introduced into the yeast cell cdc25H .The transformants were inoculated on plates of 25 ℃/SD/Glucose(-UL) ,25 ℃/SD/Ga-lactose(-UL) ,37 ℃ /SD/Glucose(-UL) and 37 ℃ /SD/Galactose ,res pectively and the proliferation ability of transformant was ob-served for 6 d .The Western blot was adopted to detect the expression of target protein .Results The pSos-SIGIRR vector was cor-rectly constructed and proved of no self-activation and toxic action .The Western blot showed that the target protein was expressed in a form of fusion protein of 170KD .Conclusion The bait plasmid containing SIGIRR cytoplasmic tail can be applied to the yeast two-hybrid system and lays the important foundation for seeking the interacting protein with SIGRR from the human lung cDNA li-brary in .【总页数】4页(P1164-1167)【作者】陈旭昕;冯华松;段蕴铀;吴学玲;钱桂生【作者单位】中国人民解放军海军总医院呼吸内科，北京100037;中国人民解放军海军总医院呼吸内科，北京100037;中国人民解放军海军总医院呼吸内科，北京100037;第三军医大学新桥医院呼吸内科，重庆400037;第三军医大学新桥医院呼吸内科，重庆400037【正文语种】中文【相关文献】1.玉米ZmMPK5酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用检测 [J], 马芳芳;王瑞云;蒋明义2.西瓜食酸菌TA基因酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测 [J], 胡金凤;黄成文;刘君3.VSV糖蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测 [J], 韩岩岩;宋德光4.防御素HNP-3成熟肽酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活和毒性检测 [J], 马生秀;邓璐霞;罗林;彭媛媛;路会侠;张敏;熊文碧;冯云;吴琦;王伯瑶;黄宁5.香蕉束顶病毒nsp酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活验证 [J], 王祥;张秀春;余乃通;梁洁;周朋;刘志昕因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
盐藻酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定
盐藻酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定李照熙;杨瑞;林艳;杨保胜;王天云【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)012【摘要】构建用于杜氏盐藻核基质结合区结合蛋白(matrix attachment region binding protein,MBP)酵母双杂交试验的诱饵栽体,进行自激活及毒性验证.以含有盐藻MBP质粒为模板,经PCR扩增后连接pMD 18-T栽体,经测序鉴定正确后,EcoR Ⅰ/Nde Ⅰ双酶切获得目的基因MBP,克隆入经同样双酶切的酵母栽体pGBKT7,转化酵母菌株AH109及Y187,检测其自激活以及毒性.结果显示,成功扩增出盐藻MBP基因,重组质粒pGBKT7-MBP经酶切、测序表明序列正确,转化酵母菌株无自激活,无毒性.【总页数】4页(P188-191)【作者】李照熙;杨瑞;林艳;杨保胜;王天云【作者单位】新乡医学院生命科学技术系,新乡453003;新乡医学院生命科学技术系,新乡453003;新乡医学院生物化学与分子生物学教研室,新乡453003;新乡医学院生物化学与分子生物学教研室,新乡453003;新乡医学院生物化学与分子生物学教研室,新乡453003【正文语种】中文【相关文献】1.酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-cide-3的构建、鉴定以及毒性、自激活效应的检测 [J], 闵婕;李青;马楠;康艳霞;李娜2.人肠三叶因子酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用鉴定 [J], 王林;孙勇;王臻;张勇;吴炜;吕尚军;彭曦3.人DOC-2氨基端PID结构域酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定 [J], 刘淑娟;杨力军;王涛;吴元明4.杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测 [J], 柴丹丹;李庆华;阎赟梦;毛丽红;李靓;朱立强;薛乐勋5.杜氏盐藻寡糖基转移酶亚基stt3a酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测 [J], 侯永杰;李杰;李庆华;王建人;薛乐勋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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OsRUS2.1酵母双杂交猎物载体的构建及其细胞毒性和自激活作用检测潘家强;侯学文【摘要】采用 PCR 技术扩增水稻根UV‐B 敏感基因2.1(ROOT UV‐B S EN S IT IV E 2.1,RUS2.1)四个不同片段[OsRUS2.1(1‐1317),OsRUS2.1(1‐138),OsRUS2.1(139‐879),OsRUS2.1(880‐1317)],连接到 T 载体pMD18‐T‐Simple 上,测序无误后分别亚克隆到猎物表达载体 pGADT7上.结果表明：四个OsRUS2.1基因片段的表达载体构建成功,读码框正确；分别转化这四个猎物表达载体于酵母感受态细胞 Y187中,用 LacZ 、M EL1活性检测法和营养缺陷型培养基SD‐Leu‐DO 培养法进行自激活检测和毒性检测,结果表明构建的四个OsRUS2.1不同片段的猎物表达载体对酵母菌株 Y187均没有转录激活活性和毒害作用,可用于后续研究.%Four fragments of rice(Oryza sativa)ROOT UV‐B SENSIT IV E 2 .1(OsRUS2 .1) ,OsRUS2 .1(1‐1317) , OsRUS2 .1(1‐138) ,OsRUS2 .1 (139‐879) ,OsRUS2 .1 (880‐1317) ,were amplified by PCR from cloned OsRUS2 .1 plasmid ,and were ligated with pMD18‐T‐simple vector ,then transformed to E .coli TOP10 competent cell .The posi‐tive clones were selected and sequenced .The confirmed fragments were subcloned to prey vector pGADT 7 .The four constructed pGADT7 prey vectors were further confirmed by enzyme digestion and sequencing . The confirmed 4 types of pGADT7 prey vectors were transformed to Y187 yeast c ompetent cells .The self‐activation and toxicity of the plasmids to host yeast Y187 were detected by LacZ and MEL1 activity assays and culturing in auxotroph medium SD‐Leu ‐DO .Results showed that the fourconstructed plasmids had no self‐transcriptional a ctivity and not toxicity to yeast strain Y187 ,and they could be used in the following yeast two‐hybrid experiments .【期刊名称】《广西植物》【年(卷),期】2013(000)001【总页数】6页(P76-81)【关键词】水稻根对敏感基因 2.1;猎物载体;酵母双杂交;自激活;毒性检测【作者】潘家强;侯学文【作者单位】华南农业大学生命科学学院分子植物生理研究室，广州 510642;华南农业大学生命科学学院分子植物生理研究室，广州 510642; 华南农业大学生命科学学院植物功能基因组与生物技术重点实验室，广州 510642【正文语种】中文【中图分类】Q782UV-B是太阳辐射的组成部分，它能够穿过大气层到达地表，但到达地表的UV-B 辐照强度与季节、云层厚度以及大气层臭氧含量有关。
近几十年来，随着大气中臭氧含量逐渐下降导致到达地表的UV-B强度有增强的趋势(任健等，2005)。
UV-B 对植物的生理效应根据UV-B辐射强度的不同具有明显的双重效应，即在强度较高时(>1 μmol·m-2·s-1)就作为逆境因子对植物造成伤害；在较低强度下(<1μmol·m-2·s-1)却是一个信号调控因子参与植物的多种光形态建成(Frohnmeyer & Staiger，2003)。
Brown & Jenkins(2008)的研究表明，在拟南芥中存在UVR8依赖和UVR8非依赖的UV-B信号传导途径，近年来对UVR8依赖的UV-B信号传导途径研究取得了很大进展，相继发现这一途径中的几个成员(Brown et al.，2005；Gruber et al.，2010)，特别是确认UVR8就是UV-B受体(Rizzini et al.，2011)及其感受UV-B的机理(Wu et al.，2012)。
UVR8非依赖的UV-B信号传导途径的研究进展较慢，对于这一途径涉及哪些基因，目前尚不清楚。
ROOT UV-B SENSITIVEs(RUSs)是近年来在拟南芥中发现的与极低强度UV-B信号传导有关的基因(Tong et al.，2008)，但它与目前已知的UV-B信号传导途径的关系目前在进一步研究中。
RUS的共同特点是具有一个功能未知的结构域DUF647，采用酵母双杂交技术表明AtRUS1与AtRUS2能通过该结构域互作(Leasure et al.，2009)。
在拟南芥研究的基础上，经生物信息学分析发现水稻基因组中也具有6个OsRUS基因。
我们已用OsRUS1构建了酵母双杂交诱饵载体(潘家强等，2012)，并从水稻cDNA文库中筛选到了一些互作基因，研究结果在进一步分析中。
OsRUS2.1开放阅读框(ORF)全长1 317 bp，结构域DUF647位于138～879 bp，为研究OsRUS2.1是否能与OsRUS1互作以及它们之间通过哪一个结构域互作，我们在已构建好的四个OsRUS1不同片段酵母双杂交诱饵载体的基础上，本文根据OsRUS2.1结构域DUF647的分布情况，构建了四个OsRUS2.1不同片段酵母双杂交猎物载体，并进行毒性及自激活检测，以便用于后续的酵母双杂交技术实验。
酵母(Saccharomyces cererisiae)Y187菌株，pGADT7质粒，阳性对照质粒pGBKT7-53和pGADT7-T，阴性对照质粒pGBKT7-Lam(美国Clontech公司)，大肠杆菌TOP10菌株及已克隆的OsRUS2.1基因pMD18-T-S-BamHI-OsRUS2.1cDNA-1317-HindIII由本实验室保存；YNB和蛋白胨(Difco公司)，SD-Leu-DO(美国Clontech公司)，酵母提取物(OXOID公司)，DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶(TaKaRa公司)，KOD-Plus-Neo DNA聚合酶和dNTPs(TOYOBO公司)，DS2000 Marker(东盛生物公司)，DNA胶回收试剂盒(普博欣生物公司)，2X power Taq PCR Mix(Microanalysis公司)，X-β-gal(BBL 公司)，X-α-gal(GOLDBIO公司)。
本实验所用的引物名称及引物序列：OsRUS2.1 cDNA-EcoRI-1-F：5′-CGAATTCATGAACATACTCGAGAGGATAC-3′；OsRUS2.1 cDNA-BamHI-138-R：5′-AGGATCCTTACAGAGACTCTGCCGGCGT-3′；OsRUS2.1 cDNA-EcoRI-139-F：5′-GGAATTCAAAGTTATCCAAGATTCGAGAC-3′；OsRUS2.1 cDNA-BamHI-879-R：5′-TGGATCCGGAAACCTTTCCACTCTTGAT-3′；OsRUS2.1 cDNA-EcoRI-880-F：5′-GGAATTCAGCCCAGCTGAGCTAAGATATCG-3′；OsRUS2.1 cDNA-BamHI-1317-R：5′-CGGATCCTCATAAAGCACTACCGCTGA-3′；Matchmaker 5′ AD LD-insert screening amplimer：5′-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3′；Matchmaker 3′ AD LD-insert screening amplimer：5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′。
以本实验室已克隆并测序的pMD18-T-S-BamHI-1-OsRUS2.1cDNA-1317-HindIII为模板，分别以OsRUS2.1cDNA-EcoRI-1-F/OsRUS2.1 cDNA-BamHI-1317-R，OsRUS2.1cDNA-EcoRI-1-F/OsRUS2.1cDNA-BamHI-138-R，OsRUS2.1 cDNA-EcoRI-139-F/OsRUS2.1cDNA-BamHI-879-R，OsRUS2.1cDNA-EcoRI-880-F/OsRUS2.1cDNA-BamHI-1317-R为引物，采用高保真酶KOD-Plus-Neo DNA聚合酶反应体系，扩增获得OsRUS2.1cDNA 的四个不同片段。
将这四个片段加A后与pMD18-T-Simple连接，转化E.coli TOP10感受态，筛选获得阳性克隆，并经测序确认无突变。
将上述克隆并验证的pMD18-T-S-EcoRI-1-OsRUS2.1cDNA-1317-BamHI、pMD18-T-S-EcoRI-1-OsRUS2.1cDNA-138-BamHI、pMD18-T-S-EcoRI-139-OsRUS2.1cDNA-879-BamHI和pMD18-T-S-EcoRI-880-OsRUS2.1cDNA-1317-BamHI及空载体pGADT7用EcoRI/BamHI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测酶切正确后，按照常规分子生物学连接、转化、筛选，获得pGADT7-EcoRI-1-OsRUS2.1cDNA-1317-BamHI、pGADT7-EcoRI-1-OsRUS2.1cDNA-138-BamHI、pGADT7-EcoRI-139-OsRUS2.1cDNA -879-BamHI和pGADT7-EcoRI-880-OsRUS2.1 cDNA-1317-BamHI 四个重组表达载体，分别采用双酶切鉴定及测序确认读码框正确。