大肠杆菌与菌落总数

所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样中活菌的数量。

所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。

(三)实验器材

(1) 菌落总数的测定：

1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基

牛肉膏3.0 g 蛋白胨10.0g NaCl 5.0g 水1000mL pH7.4～7.6 将培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后到入烧杯。也可放在称量杯中，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。在上述烧杯中先假如少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，加入琼脂，再在石棉上加热使其溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积。在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用PH试纸测其PH，直至PH达7.6。反之，用1mol/LHCL 进行调节。

无菌生理盐水：需用生理盐水浓度是0.9%：称取0.9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100毫升。

2)器材试剂：牛肉膏蛋白胨 NaCl 1moL/LNaOH 1moL/LHCL 灭菌水高压蒸气灭菌锅培养皿三角烧瓶带玻璃塞瓶天平试管牛角匙pH试纸（pH5.5-9.0）棉花记号笔纱布吸管麻绳牛皮纸量筒玻璃棒电热炉称量杯灭菌三角瓶灭菌的具塞三角瓶灭菌平皿灭菌吸管灭菌试管

高压蒸气灭菌：1.将内层锅去处，再向外层锅中加入适量的水，使水面与三角架相平为宜。

2.放回内层锅，并加入要灭菌的培养皿、试管、烧杯等物品（注

意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果）。

3.加盖，并将盖上的排气管插入内层的排气槽内，再2两两对称

的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

4.本实验用0.1MPa，121.5℃，20min灭菌。灭菌所需时间到后，

切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至

“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

(2)大肠菌群的测定；

1)培养基：

①乳糖胆盐蛋白胨培养基：

蛋白胨20g，猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，

0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。

制法：将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL，并倒置放入一个杜氏小管，l15℃灭菌15min。

双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培养基：除水以外，其余成分加倍或取三倍用量。

②伊红美蓝琼脂培养基：

蛋白胨10g，乳糖10g， K

2HP0

4

2g， 2％伊红水溶液20Ml，0.65％美蓝水

溶液lOmL，琼脂17g，水1000mL，pH7.1。

制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min 备用。临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。

③乳糖发酵管：

除不加胆盐外．其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基。

2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。

（四）实验方法

(1)水样的采集：

1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流

5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。

2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。

(2)细菌总数的测定：

1)水样稀释及培养：

①按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释：

⑦根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度(饮用水如自来水、深井水等，一般选择1、1:10两种浓度；水源水如河水等，比较清洁的可选择1:10、1:100、1:1000三种稀释度；污染水—被选择1:100、1:1000、1:10000三种稀释度)，吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。

③将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，并趁热转动平皿混合均匀。

④待琼脂凝固后，将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±1h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。

2)计算方法：

作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。

3)计数的报告：

①平板菌落数的选择：

选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个重复时，应选取两个平板的平均数。如果一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘2

以代表整个平板的菌落数。

②稀释度的选择：

a. 应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以该稀释倍数报告之(表1例1)。

b．若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视二者之比如何来决定。若其比值小于2，应报告其平均数；若比值大于2，则报告其中较小的数字(l例2、例3)。

c．若所有稀释度的平均菌落均大于300，则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(l例4)。

d．若所有稀释度的平均菌落数均小于30、则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(1例5)。

e. 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之（表1例6)。

f. 若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最接近30或300的平均菌落数乘以该稀释倍数报告之(表l例7)。

③细菌总数的报告：

细菌的菌落数在l00以内时，按其实有数报告；大于100时，用二位有效数字，在二位有效数字后面的数字，以四舍五入方法修约。为了缩短数字后面的0的个数，可用10的指数来表示，如表1“报告方式”一栏所示。

(3)大肠菌群的测定(多管发酵法)：

表 1 稀释度的选择及细菌数报告方式

稀释度及菌落数两稀

释度

之比菌落总数/

（cfu/g或

cfu/mL）

报告方式（菌落总

数）/（cfu/mL或

cfu/g）

10-110-210-3

1 多不可

计

164 20 - 16400 16000或1.6×104 2 多不可

计

295 46 1.6 37750 38000或3.8×104

3 多不可

计

271 60 2.2 27100 27000或2.7×104

4 多不可

计多不可

计

313 - 313000 310000或3.1×105

5 27 11 5 - 270 270或

6 0 0 0 - ＜10 ＜10

7 多不可

305 12 - 30500 31000或3.1×104计

1)生活饮用水或食品生产用水的检验：

①初步发酵试验：

在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液(可称为三倍乳糖胆盐)的三角瓶中(内有倒置杜氏小管)，以无菌操作各加水样100mL。在10支装有5mL 的三倍乳糖胆盐的发酵试管中(内有倒置小管)，以无菌操作各加入水样10mL。如果饮用水的大肠菌群数变异不大，也可以接种3份100mL水样。摇匀后，37℃培养24h。

②平板分离：

经24h培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管(瓶)，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板(EMB培养基)上，37℃培养18—24h。大肠菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。

③复发酵试验：

将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落1—3个，37℃培养24h，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。

④报告：

根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数，查表107-2（或表107-3），报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。

2)水源水的检验：

用于检验的水样量，应根据预计水源水的污染程度选用下列各量。

①严重污染水：1，0．1，0．01．0．00lmL各1份。

②中度污染水：10．1，0．1，0．01mL各1份。

③轻度污染水：100，10，1，0．1mL各l份。

④大肠菌群变异不大的水源水：10mLl0份。

表2 大肠菌群检索表（饮用水）

1

2

备注

每升水样中大肠菌群数

0 ＜3 4 11 接种水样总量300mL （100 mL2份，10 mL10份）

1 3 8 18

2 7 1

3 27 3 11 18 38

4 14 24 52

5 18 30 70

6 22 36 92

7 27 43 120

8 31 51 161

9 36 60 230 10

40

69 ＞230

表3 大肠菌群数变异不大的饮用水

阳性管数 0 1 2 3 接种水样总量300mL （3份100

mL ）

每升水样中大肠菌群

数

＜3

4

11

＞18

表4 大肠菌群检索表（严重污染水） 接种水样量/mL

每升水样中大肠菌群数 备注

1 0.1 0.01 0.001 - - - - ＜900 接种水样总量为1.111（1，0.1，0.01，0.001mL 各一份） - - - + 900 - - + - 900 - + - - 950 - - + + 1800 -

+

-

+

1900

- + + - 2200 + - - - 2300 - + + + 2800 + - - + 9200 + - + - 9400 + - + + 18000 + + - - 23000 + + - + 96000 + + + - 238000 +

+

+

+

＞238000

表5大肠菌群检索表（中度污染水） 接种水样量/mL

每升水样中大肠菌群数 备注

10 1 0.1 0.01 - - - - ＜90 接种水样总量为11.11（10，1，0.1，0.01 mL 各一份）

- - - + 90 - - + - 90 - + - - 95 - - + + 180 - + - + 190 - + + - 220 + - - - 230 - + + + 280 + - - + 920 + - + - 940 + - + + 1800 + + - - 2300 + + - + 9600 +

+

+

-

23800

+ + +

+ ＞23800

表6大肠菌群检索表（轻度污染水） 接种水样量/mL

每升水样中大肠菌群数

备注

100 10 1 0.1 - - - - ＜9 接种水样总量为111.1（100，10，1，0.1mL 各一份） - - - + 9 - - + - 9 - + - - 9.5 - - + + 18 - + - + 19 - + + - 22 + - - - 23 - + + + 28 + - - + 92 + - + - 94 + - + + 180 + + - - 230 + + - + 960 + + + - 2380 +

+

+

+

＞2380

表7 大肠菌群变异不大的水源水

阳性管数 0

1

2 3 4 5 6 7

8

9

10 每升水样中大肠菌群数 ＜10 11 22

36

51

69

92

120 160 230

＞230

备注

接种水样总量100mL(10mL10份)

操作步骤同生活用水或食品生产用水的检验。同时应注意，接种量1mL及

1mL以内用单倍乳糖胆盐发酵管；接种量在1mL以上者，应保证接种后发酵管(瓶)中的总液体量为单倍培养液量。然后根据证实有大肠菌群存在的阳性管(瓶)数，查表107-4、表l07-5、表107-6或表107-7，报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。

附：滤膜法

滤膜法所使用的滤膜是一种微孔滤膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中，经过抽滤，细菌即被均匀地截留在膜上，然后将滤膜贴于大肠菌群选择性培养基上进行培养。再鉴定滤膜上生长的大肠菌群的菌落，计算出每升水样中含有的大肠菌群数(MPN)。

(1)准备工作：

1)滤膜灭菌：

将3号滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中蒸煮灭菌3次，每次15min。前两次煮沸后需换无菌水洗涤2-3次，以除去残留溶剂。

2)滤器灭菌：准备容量为500mL的滤器，用点燃的酒精棉球火焰灭菌，也可用121℃高压灭菌20min。

3)培养：

3）培养：

将品红亚硫酸钠培养基放入37℃培养箱内预温30-60min。

(2)过滤水样：

1)用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将祖糙面向上贴放于已灭菌的滤床上，轻轻地固定好滤器漏斗。水样摇匀后，取333mL注入滤器中，加盖，打开滤器阀门，在—50kPa压力下进行抽滤。

2)水样滤完后再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用无菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上与培养基完全紧贴，两者间不得留有间隙或气泡。若有气泡需用镊子轻轻压实，倒放在37℃培养箱内培养16-18h。

(3)结果判定：

1)挑选符合下列特征的菌落进行革兰氏染色，镜检。

①紫红色，具有金属光泽的菌落。

②深红色，不带或略带金属光泽的菌落。

③淡红色，中心颜色较深的菌落。

2)凡是革兰氏阴性无芽胞杆菌，需再接种于乳糖蛋白胨半固体培养基，37℃培养6-8h，产气者，则判定为大肠菌群阳性。

3)1L水样中大肠菌群数等于滤膜法生长的大肠菌群菌落数乘以3