实验三-琼脂糖凝胶电泳检测DNAppt课件
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实验三琼脂糖凝胶电泳ppt课件
2、将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入制胶模具中，直至厚度为4-6 mm，插 入适当的梳子，在室温下冷却凝固。
3、充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。将凝胶置入电 泳槽中，加0.5TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2 mm。
（二）点样
用微量取液器（P20）吸取质粒DNA样品2 l于点样板小孔中，再加入8 l TE及1 l的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉 入点样孔下部。同时点5 l MarkerⅢ作为分子量标准。
5、必须保证琼脂糖充分完全熔解，否则，会造成电泳图像模糊不清。 6、电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液，
一般用2-3次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。 7、为了节约成本，没有跑过DNA的凝胶部分可切下来重复利用，但反复
熔化会降低分辨效率，建议时向哪一极移动？ 2、什么是迁移率？影响迁移率的因素有哪些？什么是分辨率？
分辨率与凝胶浓度的关系？ 3、DNA荧光染料的发光原理？ 4、质粒DNA存在哪些构型？其迁移率有何差异？ 5、loading buffer成分是什么？各成分有何作用？
注意：如何判断单酶切是否完全？ 如何判断双酶切是否完全？
质粒DNA三种构型：环状超螺旋、开环和线性。 质粒电泳三条带：超螺旋、开环和复制中间体（即2个没有复制完全的质粒 连在了一起）。 同一种酶切后电泳谱带的规律：从高分子量到低分子量条带亮度逐渐减弱 由于DNA Marker与酶切产物所含成分不同，因此迁移率不一定相同！
不同波长的紫外光
短波紫外光：254nm 中波紫外光：302nm 长波紫外光：365nm
1、为什么分光光度计测定的浓度很高，但电泳检测浓度却很低？
GoldViewI GoldViewII
3、充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。将凝胶置入电 泳槽中，加0.5TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2 mm。
（二）点样
用微量取液器（P20）吸取质粒DNA样品2 l于点样板小孔中，再加入8 l TE及1 l的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉 入点样孔下部。同时点5 l MarkerⅢ作为分子量标准。
5、必须保证琼脂糖充分完全熔解，否则，会造成电泳图像模糊不清。 6、电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液，
一般用2-3次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。 7、为了节约成本，没有跑过DNA的凝胶部分可切下来重复利用，但反复
熔化会降低分辨效率，建议时向哪一极移动？ 2、什么是迁移率？影响迁移率的因素有哪些？什么是分辨率？
分辨率与凝胶浓度的关系？ 3、DNA荧光染料的发光原理？ 4、质粒DNA存在哪些构型？其迁移率有何差异？ 5、loading buffer成分是什么？各成分有何作用？
注意：如何判断单酶切是否完全？ 如何判断双酶切是否完全？
质粒DNA三种构型：环状超螺旋、开环和线性。 质粒电泳三条带：超螺旋、开环和复制中间体（即2个没有复制完全的质粒 连在了一起）。 同一种酶切后电泳谱带的规律：从高分子量到低分子量条带亮度逐渐减弱 由于DNA Marker与酶切产物所含成分不同，因此迁移率不一定相同！
不同波长的紫外光
短波紫外光：254nm 中波紫外光：302nm 长波紫外光：365nm
1、为什么分光光度计测定的浓度很高，但电泳检测浓度却很低？
GoldViewI GoldViewII
DNA琼脂糖凝胶电泳(课堂PPT)
铺胶
凝胶凝固后取出梳子
加缓冲液
准备样品
点样
电泳
注意观察溴酚蓝染液的迁移
紫外灯下观察电泳结果
照相
对琼脂糖凝胶电泳分离DNA 片段的有效性 的再认识
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DNA 为多元酸，在中性或弱碱性缓冲 液中带负电荷而向阳极泳动 由于不同 DNA 分子在同一凝胶中迁移速率不一样， 电泳一段时间后可将其分开。
紫外灯下观察照相凝胶冷却至凝胶冷却至5050cc加加ebeb至终浓度至终浓度05gml05gml20对琼脂糖凝胶电泳分离对琼脂糖凝胶电泳分离dnadna片段的有效性片段的有效性的再认识的再认识21dnadna为多元酸为多元酸在中性或弱碱性缓冲在中性或弱碱性缓冲液中带负电荷而向阳极泳动液中带负电荷而向阳极泳动由于不同由于不同dnadna分子在同一凝胶中迁移速率不一样分子在同一凝胶中迁移速率不一样电泳一段时间后可将其分开电泳一段时间后可将其分开
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结果
电泳后在日光下(LIGHTBLUE Dye 染色)或在紫外 灯下(溴化乙锭染色)切取含“ 单一” 目的DNA 分 子的胶条并称重，用小量胶回收试剂盒回DNA。
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谢谢观看
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电泳仪
缓冲液 琼脂糖
凝胶槽
梳子
电泳槽琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶 样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝 加样：加样端为负极（黑） 电泳：5V/cm 观察：紫外灯下观察，照相
溶胶
准备胶槽
凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml
状DNA>开环DNA
不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围
琼脂糖浓度（%） 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
质粒的酶切—琼脂糖凝胶电泳分离DNAppt课件
实验二 质粒的酶切、琼脂糖凝 胶电泳分离DNA
1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论
实验目的
限制性内切酶切割出目的DNA
了解琼脂糖凝胶电泳的原理
掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方 法
实验原理
利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位 点，定点切割环状质粒DNA。
Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 100ml 3. 溴化乙锭溶液 10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶或铝 铂纸包装保存。 4. 10×DN切体系
调制酶切体系如下: (共 20μL)
无菌水 6μL，
质粒
10 μL
Buffer K 2μL,
EcoR I 1μL,
BamH I 1 μL
37℃酶切1.5小时。
琼脂糖凝胶制备
1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干。 2. 插好挡板、梳子。 3. 根据实验所需称取0.4克琼脂糖，放入制胶
的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml电 泳缓冲液（1×TAE）。 4. 加热煮沸，使琼脂糖完全溶解。 5. 溶液冷至约60℃时，加入溴化乙锭4 μL (终浓 度为0.1 g/l)，轻轻摇匀，倒入制胶槽上，检查 有无气泡。
纯度；DNA的甲基化程度；温度；缓冲液成分 （DDT，BSA）等。
使用3 mg的DNA Marker DL 2,000（500 ng/条带）进行1% 的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb， 750bp，500bp，250bp，100bp。
9.用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中。
10.插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节 电压至120V，电泳开始，观察电流情况或电泳 槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。
1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论
实验目的
限制性内切酶切割出目的DNA
了解琼脂糖凝胶电泳的原理
掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方 法
实验原理
利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位 点，定点切割环状质粒DNA。
Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 100ml 3. 溴化乙锭溶液 10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶或铝 铂纸包装保存。 4. 10×DN切体系
调制酶切体系如下: (共 20μL)
无菌水 6μL，
质粒
10 μL
Buffer K 2μL,
EcoR I 1μL,
BamH I 1 μL
37℃酶切1.5小时。
琼脂糖凝胶制备
1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干。 2. 插好挡板、梳子。 3. 根据实验所需称取0.4克琼脂糖，放入制胶
的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml电 泳缓冲液（1×TAE）。 4. 加热煮沸，使琼脂糖完全溶解。 5. 溶液冷至约60℃时，加入溴化乙锭4 μL (终浓 度为0.1 g/l)，轻轻摇匀，倒入制胶槽上，检查 有无气泡。
纯度；DNA的甲基化程度；温度；缓冲液成分 （DDT，BSA）等。
使用3 mg的DNA Marker DL 2,000（500 ng/条带）进行1% 的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb， 750bp，500bp，250bp，100bp。
9.用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中。
10.插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节 电压至120V，电泳开始，观察电流情况或电泳 槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。
最新细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳_图文ppt课件
SDS（十二烷基硫酸钠）：破细胞膜、核膜，使组织蛋白与DNA 分离
EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：抑制DNA酶活性，确保目的DNA 不再降解
Proteinase K：使染色质上蛋白质与DNA分离，并进一步降解为小 肽/氨基酸
酚、氯仿：抽提除去蛋白质 异丙醇：沉淀DNA Goldview：DNA萤光染料，与DNA结合形成一种光络合物，在紫
方法
一、胸腺细胞的制备： 小鼠摘眼球并断椎处死，取胸腺，浸入含5－
10%小牛血清的1640培养液中，置铜网上研磨， 将研磨好的细胞悬液用尼龙网过滤。2000rpm， 离心5min，制成1×107细胞悬液备用。
二、提取胸腺细胞DNA：
⑴裂解细胞阶段（使用到的试剂：裂解液=L液、 RNaseA/蛋白酶K液=A液）
线粒体的改变
• 线粒体检测： 激光扫描共聚焦显微镜检测1）线粒体通透性转
换（MPT），2）线粒体内膜去极化， 3）钙离子 流改变，4）线粒体氧化还原状态等。 缺陷：不能区分凋亡和坏死
• 细胞色素C释放： 荧光显微镜/电镜观测
缺陷：细胞色素C释放到胞浆后不稳定。
• 发育
凋亡的生理学意义
凋亡的生理学意义
• 将细胞离心后小心倒出液体，离心管中加入 100μlL液和20μlA液，充分混匀，置于55℃温浴 20分钟，其间来回颠倒离心管3-5次。
(2) 结合DNA阶段(使用到的试剂: 结合缓冲液=B液、 3MNaAC, pH4.8)
• 加入10μl 3MNaAC，随后加入1250μl B液，充分 振荡混合均匀（重要！），12000rpm离心3min。 将上清分2次加入到离心吸附管。静置1分钟， 12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液。第二次 同上，静置1分钟，离心30s。
EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：抑制DNA酶活性，确保目的DNA 不再降解
Proteinase K：使染色质上蛋白质与DNA分离，并进一步降解为小 肽/氨基酸
酚、氯仿：抽提除去蛋白质 异丙醇：沉淀DNA Goldview：DNA萤光染料，与DNA结合形成一种光络合物，在紫
方法
一、胸腺细胞的制备： 小鼠摘眼球并断椎处死，取胸腺，浸入含5－
10%小牛血清的1640培养液中，置铜网上研磨， 将研磨好的细胞悬液用尼龙网过滤。2000rpm， 离心5min，制成1×107细胞悬液备用。
二、提取胸腺细胞DNA：
⑴裂解细胞阶段（使用到的试剂：裂解液=L液、 RNaseA/蛋白酶K液=A液）
线粒体的改变
• 线粒体检测： 激光扫描共聚焦显微镜检测1）线粒体通透性转
换（MPT），2）线粒体内膜去极化， 3）钙离子 流改变，4）线粒体氧化还原状态等。 缺陷：不能区分凋亡和坏死
• 细胞色素C释放： 荧光显微镜/电镜观测
缺陷：细胞色素C释放到胞浆后不稳定。
• 发育
凋亡的生理学意义
凋亡的生理学意义
• 将细胞离心后小心倒出液体，离心管中加入 100μlL液和20μlA液，充分混匀，置于55℃温浴 20分钟，其间来回颠倒离心管3-5次。
(2) 结合DNA阶段(使用到的试剂: 结合缓冲液=B液、 3MNaAC, pH4.8)
• 加入10μl 3MNaAC，随后加入1250μl B液，充分 振荡混合均匀（重要！），12000rpm离心3min。 将上清分2次加入到离心吸附管。静置1分钟， 12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液。第二次 同上，静置1分钟，离心30s。
琼脂糖凝胶电泳 ppt课件
• 有热可逆性
• 机械强度差，易破碎，浓度 不能太低。
• 易被细菌污染，不易保存， 临用前配制。
• 琼脂糖支持层上的区带易于 扩散，电泳后必须立即固定 染色。
• 与PAGE相比，分子筛作用小， 区带少。
9
ppt课件
琼脂糖凝胶的配置
1. 根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶 缓冲液。一般为 1× TAE或0.5×TBE。
注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相 同的。
2. 根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电 泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂 糖粉。
注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。
3. 在微波炉中加热溶解琼脂糖
注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电 泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加 热。微波炉中加热时间不宜过长。
2) 分子大小相近的DNA带不 增加电泳时间，核准正确的凝胶
易分辨
浓度
DNA带缺失 3) DNA 变性
电泳前请勿高温加热DNA链，以 20mM NaCl Buffer稀释DNA
4) DNA链巨大，常规凝胶电泳 在脉冲凝胶电泳上分析 不合适
31
注意：不要产生气泡，溶液温度太高(>60℃)，会使得水 分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。
6. 在室温下使胶凝固（大约30 分钟），然后放置 于电泳槽中进行电泳。
注意： 凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在4℃ 下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存2～5 天。
11
ppt课件
琼脂糖凝胶缓冲液
电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后 在冰上冷却5分钟
不规则DNA带迁移 2) 电泳条件不合适
电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃； 经常更换电泳缓冲液
• 机械强度差，易破碎，浓度 不能太低。
• 易被细菌污染，不易保存， 临用前配制。
• 琼脂糖支持层上的区带易于 扩散，电泳后必须立即固定 染色。
• 与PAGE相比，分子筛作用小， 区带少。
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ppt课件
琼脂糖凝胶的配置
1. 根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶 缓冲液。一般为 1× TAE或0.5×TBE。
注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相 同的。
2. 根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电 泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂 糖粉。
注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。
3. 在微波炉中加热溶解琼脂糖
注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电 泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加 热。微波炉中加热时间不宜过长。
2) 分子大小相近的DNA带不 增加电泳时间，核准正确的凝胶
易分辨
浓度
DNA带缺失 3) DNA 变性
电泳前请勿高温加热DNA链，以 20mM NaCl Buffer稀释DNA
4) DNA链巨大，常规凝胶电泳 在脉冲凝胶电泳上分析 不合适
31
注意：不要产生气泡，溶液温度太高(>60℃)，会使得水 分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。
6. 在室温下使胶凝固（大约30 分钟），然后放置 于电泳槽中进行电泳。
注意： 凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在4℃ 下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存2～5 天。
11
ppt课件
琼脂糖凝胶缓冲液
电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后 在冰上冷却5分钟
不规则DNA带迁移 2) 电泳条件不合适
电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃； 经常更换电泳缓冲液
DNA的琼脂糖凝胶电泳分析ppt课件
❖ 上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压；
❖ 如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘 效应 ，中间电场比较均匀 ；
❖ 做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致；
❖ 加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电 ห้องสมุดไป่ตู้孔内 ；
❖ 电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调 高电压。
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
琼脂糖凝胶 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 浓度（％）
可分辨的线
10~ 7~ 6~ 4~ 3~
性DNA大小 60~5 20~1 0.8 0.7 0.4 0.2 0.1 范围（kb）
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
❖ 2、 50×TAE电泳缓冲液：称取242gTris碱 （即三羟甲基氨基甲烷， Tris为弱碱，在室 温（25℃）下，它的pKa为8.1；根据缓冲理 论，Tris缓冲液的有效缓冲范围在pH7.0到 9.2之间。Tris碱的水溶液pH在10.5左右，一 般加入盐酸以调节pH值至所需值，即可获得 该pH值的缓冲液。但同时应注意温度对于 Tris的pKa的影响 ）， ，加H2O800ml，待 完全溶解后，加57.1ml冰乙酸， 100ml0.5mol/LEDAT（pH8.0），用H2O定 容至1000ml。临用前用H2O稀释成1×TAE 电泳缓冲液。
❖ 如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘 效应 ，中间电场比较均匀 ；
❖ 做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致；
❖ 加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电 ห้องสมุดไป่ตู้孔内 ；
❖ 电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调 高电压。
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
琼脂糖凝胶 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 浓度（％）
可分辨的线
10~ 7~ 6~ 4~ 3~
性DNA大小 60~5 20~1 0.8 0.7 0.4 0.2 0.1 范围（kb）
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
❖ 2、 50×TAE电泳缓冲液：称取242gTris碱 （即三羟甲基氨基甲烷， Tris为弱碱，在室 温（25℃）下，它的pKa为8.1；根据缓冲理 论，Tris缓冲液的有效缓冲范围在pH7.0到 9.2之间。Tris碱的水溶液pH在10.5左右，一 般加入盐酸以调节pH值至所需值，即可获得 该pH值的缓冲液。但同时应注意温度对于 Tris的pKa的影响 ）， ，加H2O800ml，待 完全溶解后，加57.1ml冰乙酸， 100ml0.5mol/LEDAT（pH8.0），用H2O定 容至1000ml。临用前用H2O稀释成1×TAE 电泳缓冲液。
DNA电泳实验步骤 ppt课件
3. 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏紧密封住。将封好的 胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶 槽底面保持1mm左右的间隙。 向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴 化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg /mL。用移液器吸取少量融化的琼 脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地 倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后拨出梳子，注 意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液 面恰好没过胶板上表面。 DNA电泳实验步骤
DNA电泳实验步骤
凝胶成像 系统
DNA电泳实验步骤
实验步骤
1. 取5×TBE缓冲液20mL加水至200mL，配制成0.5×TBE稀释缓冲液， 待用。
2. 胶液的制备：称取0.4g 琼 脂 糖 ， 置 于 200mL 锥 形 瓶 中 ， 加 入 50mL 0.5×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇 匀，此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上 的琼脂糖颗粒进入溶液。
当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在 紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置 。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。
DNA电泳实验步骤
实验材料和试剂
实验材料：PCR产物,植物基因组DNA,质粒DNA等，购买
或自行提取纯化。
实验试剂：
① 5×TBE电泳缓冲液： ② 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶
液，贮存于 4℃。 ③ 溴化乙锭(EB)溶液母液：将EB配制成10 mg/mL，用铝箔
DNA电泳实验步骤
凝胶成像 系统
DNA电泳实验步骤
实验步骤
1. 取5×TBE缓冲液20mL加水至200mL，配制成0.5×TBE稀释缓冲液， 待用。
2. 胶液的制备：称取0.4g 琼 脂 糖 ， 置 于 200mL 锥 形 瓶 中 ， 加 入 50mL 0.5×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇 匀，此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上 的琼脂糖颗粒进入溶液。
当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在 紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置 。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。
DNA电泳实验步骤
实验材料和试剂
实验材料：PCR产物,植物基因组DNA,质粒DNA等，购买
或自行提取纯化。
实验试剂：
① 5×TBE电泳缓冲液： ② 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶
液，贮存于 4℃。 ③ 溴化乙锭(EB)溶液母液：将EB配制成10 mg/mL，用铝箔
实验琼脂糖凝胶电泳的原理与方法 PPT
六、血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳
按电泳法分:
按超速离心法分:
乳糜微粒(CM)
乳糜微粒CM ( < 0、96 )
-脂蛋白 (-位) 极低密度脂蛋白VLDL(0、961、006)
前-脂蛋白(2-位) 低密度脂蛋白LDL (1、0191、063) -脂蛋白 (1-位) 高密度脂蛋白HDL(1、0631、21)
进行印迹转移电泳时,要注意缓冲液得离子强度要低,pH要远 离pI,使蛋白质带有较多电荷,一般用稳定性较好得Tris-缓冲体 系。还要注意凝胶与支持膜之间不能有气泡。适当提高电压或 电流可以提高转移速度,但亦会增加热效应,故电压或电流不可过 高。
五、交变脉冲电场凝胶电泳
一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb得DNA。 这就是因为在琼脂糖凝胶中,DNA分子得有效直径超 过凝胶孔径时,在电场作用下,迫使DNA变形挤过筛孔, 而沿着泳动方向伸直,因而分子大小对迁移率影响不 大。如此时改变电场方向,则DNA分子必须改变其构 象,沿新得泳动方向伸直,而转向时间与DNA分子大小 关系极为密切。
D-半乳糖
3,6-脱水-L-半乳糖
琼脂糖链依分子内与分子间氢键及其它力得作 用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝 胶。
冷却
松散,随机地,盘绕地琼脂糖链
双螺旋结构区域与线性链相链接
淬火
溶胶状态
初级胶
最终得凝胶结构
琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳,其优点如下: (1)琼脂糖凝胶电泳操作简单,电泳速度快,样品不需事
按支持物得装置形式不同,区带电泳可为: ➢平板式电泳,支持物水平放置,就是最常用得 电泳方式; ➢垂直板式电泳,聚丙烯酰胺凝胶常做成垂直 板式电泳; ➢垂直柱式电泳,聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳即 属于此类; ➢连续液动电泳,首先应用于纸电泳,将滤纸垂 直竖立,两边各放一电极,溶液自顶端向下流, 与电泳方向垂直。
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EB结构与核酸碱基相似，容易插入DNA中，因而其有强的致癌性。
实验三-琼脂糖凝胶电泳检测DNA
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器材与试剂
1.实验器材 电泳仪、电泳槽、凝胶紫外透射仪、解剖刀、台式高速离心机、Eppendorf管、移液 抢、恒温水浴锅、一次性手套、三角烧瓶
2.试剂 琼脂糖：根据需要用电泳缓冲液配成不同浓度。
本实验配制 1％ Agrose： 1g Agrose、 50～100ml 0.5×TBE、
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10、电泳结束后，切断电源，取出凝胶 （手套拿取凝胶）。 11、电泳结果分析：
紫外检测仪直接观察电源条带；凝胶成像分析系统处理。
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影响迁移率的因素 DNA分子的大小 琼脂糖凝胶的浓度 DNA的构象 所加电压 一般5V/cm 电场方向 染料的存在与否 电泳缓冲液的组成
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2、胶床准备： ①取出洗净并晒干的胶床和梳子 ②将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙。 ③将胶床放在调整好的水平台上。
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3、铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度3～5mm。 4、室温下静置1小时左右，凝胶固化。将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔
在碱性环境下，不同的核酸分子由于具有相同的磷酸戊糖结构，几乎具有 相同的电荷密度，其电泳行为线性分子在凝胶中的迁移率与其所含碱基对数目 的对数值成反比。可以近似用于估算分子的大小。
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2. 琼脂糖介质结构均一，含水量大（98-99%），可通过调整琼脂糖的浓度改变孔 径的大小，起到分子筛的作用。 琼脂糖凝胶电泳 200bp—50kb（分离范围广、方便）
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8、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般10～ 30μl。
9、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。
开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。电泳条件：接通电泳槽与电 泳仪的电源，调节电压100V 30min,当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停 止电泳。
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操作步骤
1、凝胶准备：用0.5×TBE配制1％琼脂糖凝胶。 ① 称1g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 0.5×TBE； ② 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖； ③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB（终浓度0.5μg/ml），并轻轻混
匀。
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DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分 子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
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3. 溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分碱基对子中形成 荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检 测琼脂糖中的DNA。
位于电场负极。 5、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。
原梳齿处 (样品孔) 即被缓冲液充满，如发现有气泡，应设法去除。
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6、向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，以越过凝胶表面1～2mm为宜。
7、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻 混匀。例如，5微升的DNA样品+1微升的上样缓冲液，以此类推。
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注意事项
1. 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否则温度太高会使 凝胶盘变形。 2. 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏 点样孔。 3.点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡。 4.EB有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔，紫外线 照射不宜太久。
思考题
1.影响核酸在琼脂糖凝胶电泳中迁移速率的因素有哪些？
2.电泳中加入Loading buffer的作用是什么？
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实验目的
1.掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方法。 2.检测PCR结果。
实验原理
1. DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
核酸为两性分子，在pH 3.5时，碱基上的氨基解离而磷酸基团中只有第一 个磷酸解离，整个分子带正电； pH 8左右时，碱基几乎不解离，而磷酸全部解 离，整个分子带负电。
实验三-琼脂糖凝rker DL2000 电泳缓冲液：本实验选用TBE
6×上样缓冲液（ Loading buffer ）： 4℃贮存。增加样品密度，使样品带颜色，起指示作用。 0.25% 溴酚蓝、0.25% 二甲苯青FF、30％ 甘油水溶液
10mg/ml 溴化乙锭（EB）：贮存液，棕色瓶室温保存。终浓度是0.5μg/ml。