化学生物学导论-第三章 核酸4-5节
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生物化学第三章核酸PPT课件
DNA与RNA结构差异
五碳糖不同
DNA中的五碳糖是脱氧核糖，而 RNA中的五碳糖是核糖。
碱基不同
DNA中的碱基包括腺嘌呤（A） 、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T） 和胞嘧啶（C），而RNA中的碱 基包括腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（ G）、尿嘧啶（U）和胞嘧啶（C
）。
空间结构不同
DNA通常是双链结构，而RNA 通常是单链结构。
核酸药物设计思路及前景展望
核酸药物设计思路
核酸药物是一类以核酸为靶点的药物，通过 特异性地与核酸结合，调节基因表达或抑制 病原体复制，从而达到治疗疾病的目的。设 计核酸药物时需要考虑靶点选择、药物稳定 性、特异性、安全性等因素。
前景展望
随着基因组学和生物信息学的发展，越来越 多的疾病相关基因和靶点被发现，为核酸药 物的研发提供了广阔的空间。未来，核酸药 物有望在肿瘤、遗传性疾病、病毒感染等领 域发挥重要作用，成为一类重要的治疗药物 。同时，随着技术的不断进步和成本的降低 ，核酸药物的研发和应用将更加普及和便捷
DNA拓扑异构酶的作用
拓扑异构酶能够改变DNA的超螺旋状态，从而调节DNA的拓扑结构和功能。拓扑异构酶 在DNA复制、转录、修复和重组等过程中发挥重要作用。
RNA结构与性质
03
tRNA三叶草结构特点
01
02
03
三叶草二级结构
由DHU环、反密码环、 TΨC环、额外环和可接受 茎组成，形似三叶草。
反密码环
人类基因组计划与意义
1 2 3
人类基因组计划的目标
破译人类全部遗传信息，解读人类基因组所蕴含 的生命奥秘。
研究成果及应用
揭示了人类基因组的组成、结构和功能，为医学 、生物技术和制药等领域提供了重要的科学基础 。
生物化学03核酸化学PPT课件
很宽较深
平坦
窄、深
较窄很深
第31页/共83页
DNA双螺旋三种不同的构象
A-DNA
B-DNA
第32页/共83页
Z-DNA
DNA二级结构的多样性
DNA的回文顺序（palindrome）
5 -T-T-A-G-C-A-C-G-T-G-C-T-A-A- 3 3 -A-A-T-C-G-T-G-C-A-C-G-A-T-T- 5
目录
第一节 核酸概述 第二节 核酸基本构件单位—核苷酸 第三节 DNA的分子结构 第四节 RNA的分子结构 第五节 核酸的理化性质 第六节 基因和基因组 第七节 DNA超螺旋和染色体结构
第1页/共83页
第一节 核酸概论
一、核酸的研究历史和重要性 二、核酸的种类和分布 三、DNA储存遗传信息的证实
第2页/共83页
第24页/共83页
DNA的双螺旋结构的形成
5´
磷酸 脱氧 核糖 碱基
3´
T-A碱基对
5
3´
´
小沟
大沟
C-G碱基对
3´
5´
第25页/共83页
5´
3
´
DNA的双螺旋模型特点
a. 两条反向平行的多聚核苷酸链沿一个假设的中心轴右旋 相互盘绕而形成。
b. 磷酸和脱氧核糖单位作为不变的骨架组成位于外侧，作为 可变成分的碱基位于内侧，链间碱基按A—T，G—C配对（碱基 配对原则，Chargaff定律）
(d)ADP
Adenosine dip(dh)AoTsPphate Adenosine triphosphate
腺苷酸及其多磷酸化合物
第14页/共83页
脱氧三磷酸核苷酸
5´-dNMP 5´-dNDP 5´-dNTP N=A、G、C、T
生物化学-第3章-核酸的结构与功能PPT课件
射图谱和分子模型，
提出了著名的DNA双
螺旋结构模型，并
对模型的生物学意
义作出了科学的解
释和预测。
.
19:46
17
DNA双螺旋模型要点
（1）两条长度相等的核苷 酸链反向平行，右手螺 旋结构。
（2）碱基在内碱基平面垂 直于螺旋轴戊糖、磷酸 在外，双螺旋每转一周 为10碱基对螺距3.4nm.
（3）碱基对（A＝T， G≡C）
一、一般性质
1．线性大分子
2．两性电解质
3. 紫外吸收性 质
.
24
二、核酸的变性与复性
1. 变性
❖ 稳定核酸双螺旋次级键断裂， 空间结构破坏，变成单链结构 的过程。
❖ 核酸变性后，由于DNA分子双 链打开暴露了更多碱基的共轭 双键，使其在波长260nm处的 光吸收增强，这一现象称为高 色效应（hyperchromic effect）。
❖ 核苷酸 → 核苷+磷酸 （戊糖+碱基+磷酸）
HH
.
10
19:46
两类核苷酸的比较
RNA： AMP GMP CMP UMP
DNA: dAMP dGMP dCMP dTMP
.
11
二、某些重要的核苷酸
1．多磷酸核苷酸
NH2
N
N
O
O
O
O - P ～O - P ～ O - P
O-
O-
O-
N OCH2 O
稀有碱基较多，稳定性较差，易水解多为 单链结构，少数局部形成螺旋。
分类： mRNA 3% tRNA 15% rRNA 80%
.
21
种类多，分子 量大小不一
5’－端“帽” 式结构
第三章 核酸化学
rRNA的功能 参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。
思考题：
体内有哪些重要的核苷酸？各有何作用？
DNA和RNA在化学组成、分子结构和生理功能有何异同？ 利用核酸的理化性质在临床实践中有何应用？
N O O
-
NH2 N N OCH2
-
O O
-
O O
-
N H H
P O
-
P O
-
P O
O
H H
OH OH 三磷酸腺苷 (AT P )
多磷酸核苷酸
5′-磷酯键
N N O -O O O O O
NH 2
N
N
P O-
P O-
P O-
O
CH 2 H H OH
O H H H
脱氧腺嘌呤核苷 脱氧腺嘌呤一磷酸 (dAMP) 脱氧腺嘌呤二磷酸 (dADP) 脱氧腺嘌呤三磷酸 (dATP)
NH
核苷
N N
2 N 9 N
糖苷键
CH O H O 2 1'
H H OH H 2' O H H
嘌呤N-9或嘧啶N-1与核糖C-1通过β-N-糖苷 键相连形成核苷。
核苷酸(ribonucleotide)
NH2
酯键
O
N N O
N
9 N
糖苷键
HO P O CH 2 O
-
H
H
OH
' 1 H H 2'
* tRNA的二级结构
——三叶草形
氨基酸臂 DHU环 反密码环
额外环
生物化学第三章核酸
第三节 RNA的结构与功能
Structure and Function of RNA
• DNA和RNA的区别
不同点 戊糖 碱基 二级结构 碱基互补配对 种类 RNA 核糖 G C A U 单链 忠实性较低 多 （mRNA，rRNA， tRNA 等） DNA 脱氧核糖 G C A T 双链 忠实性高 少
碱基互补配对: 腺嘌呤/胸腺嘧啶(A-T)
4.双螺旋表面存在大沟和小沟
小沟
大沟
（二） DNA二级结构的多样性
• 三种DNA构型的比较
螺距 旋向 (nm) 每圈碱 基数 螺旋直径 （nm） 骨架 走行
存在条件
A型 右手 B型 右手
2.3 3.54
11 10.5
2.5 2.4
平滑 平滑
体外脱水 生理条件
（二）碱基
碱基(base)是含氮的杂环化合物。
腺嘌呤
嘌呤 碱基 嘧啶 鸟嘌呤 存在于DNA和RNA中
胞嘧啶
尿嘧啶 胸腺嘧啶 仅存在于RNA中 仅存在于DNA中
NH2
嘌呤(purine，Pu)
N 7 8 9 NH
N
N
NH
5 4
6 3 N
1N 2
腺嘌呤(adenine, A)
O N
N
NH
NH
鸟嘌呤(guanine, G)
(二) 原核生物DNA的环状超螺旋结构
原核生物DNA多为环状，以负超螺旋的形 式存在，平均每200碱基就有一个超螺旋形成。
DNA超螺旋结构的电镜图象
(三) DNA在真核生物细胞核内的组装
真核生物染色体由DNA和蛋白质构成
基本单位是核小体
DNA染色质呈现出的串珠样结构。 染色质的基本单位是核小体(nucleosome)。
第三章 核酸——生物化学(ssy)
螺旋直径为2nm，相邻碱基
平面距离0.34nm，螺旋一圈
螺距3.4nm，一圈10对碱基。
碱基垂直螺旋轴居双螺旋内
側，与对侧碱基形成氢键配 对 （ 互 补 配 对 形 式 ： A=T; GC） 。
碱基互补配对 A T G C
氢键维持双链横向稳定性
碱基堆积力维持双链纵向
稳定性。 离子键屏蔽磷酸基团之间 的静电斥力
5′端
C
A
G
3′端
书写方法
A
G
T
G
C
T
线条式
5 P
P
P
P
P
P
OH 3
字母式
5 pApCpTpGpCpT-OH 3
5 A C T G C T 3
2、 DNA二级结构-双螺旋结构
碱基组成分析 Chargaff 规则：[A] = [T] [G] [C] 碱基的理化数据分析 A-T、G-C以氢键配对较合理
第 三 章 核 酸 化 学
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俗
语
生物亲代与子代之间，在形态、结构和生理 功能上常常相似的现象，就是遗传现象。
牛的后代仍然是牛 早在公元前3世纪，《吕氏春 秋》中就记载着“夫种麦而得麦， 种稷而得稷，人不怪也”
金丝猴的后代 仍然是金丝猴
思考： 到底是什么物质在亲子代的遗传 中起作用呢？
2004年12月26日，圣诞节欢乐的气氛尚未结束， 此时，位处南亚的印尼发生了史上第四大强震， 芮氏规模9.0，引发波及东南亚8个国家的海啸。
b. 多磷酸核苷酸：
指含两个以上磷酸基的核苷酸,如ADP 、ATP 、 GDP、 GTP 、 UDP和UTP等.
ATP在细胞能量代谢上起着极其重要的作用。
第三章 核酸化学
反向平行是指一条链是 5’
一条链必为3’ 5’端。
3’ 端，则另
（二）DNA的二级结构
• 双螺旋结构模型的要点
（2）磷酸与核糖彼此通过3’,5’-磷酸 二酯键相连接位于双螺旋外侧，形成 DNA分子的骨架。碱基位于内侧。碱 基平面与螺旋轴基本垂直，糖环平面 与螺旋轴基本平行。
（二）DNA的二级结构
3.多磷酸核苷酸
A
P ～ P ～ P
O
腺苷一磷酸 （AMP） 二磷酸腺苷（ADP） 三磷酸腺苷（ATP） ATP参与多种物质代谢，为各项生命活动提供能量。
NMP NDP
dNMP
RNA
AU U C G
dNDP dNTP
DNA
A T C G
NTP
AMP UDP CTP
dGMP dADP dTTP
（ TTP ）
功能： 与蛋白质结合形成核蛋白体，是蛋白质
生物合成场所。
结构： 核蛋白体有大、小两个亚基组成。
特点：
数量最多。
（三）mRNA的分子结构与功能
“帽子结构” 的作用：
防止mRNA被降解。 蛋白质生物合成时被起始因子识别的标志。
Poly A的作用：引导mRNA由胞核转移到胞质。
点滴积累
1. DNA的一级结构实质是指碱基的排列顺序。 2. DNA的二级结构是双螺旋型，其要点包括：由两条反向 平行的多核苷酸链围绕中心轴形成；磷酸和脱氧核糖位 于螺旋外侧，碱基位于螺旋内侧；碱基配对具有一定的 规律性，即A与T配对，G与C配对。 3. DNA双螺旋结构模型要点及稳定因素。 4. 3种RNA的空间结构决定了它们在蛋白质生物合成过程 中的不同作用。
E．S
• • • • • •
生物化学第三章核酸化学
核糖核酸酶类
牛胰核糖核酸酶：存在于牛胰中，简称为 RNaseⅠ，只作用于RNA，十分耐热，是具 有极高专一性的内切酶。 核糖核酸酶T1：从米曲霉中获得的，耐热， 耐酸，专一性更强。 核糖核酸酶T2：来源同T1，核酸酶：也叫做DNaseⅠ， 需要镁离子参与，切断双链DNA或者单链 DNA为寡聚核苷酸，平均长度为4个核苷酸。 ② 牛脾脱氧核糖核酸酶：也叫做DNaseⅡ， 需要钠离子激活，镁离子抑制活性。 ③ 限制性内切酶：主要降解外源性DNA，目 前发现有数千种，是基因工程最重要的工 具酶。
RNA功能的多样性
① ② ③ ④ ⑤ 控制蛋白质的生物合成； 作用于RNA转录后的加工与修饰； 基因表达与细胞功能调节； 生物催化与其他的细胞功能 遗传信息的加工与进化
第三节
核酸的分子结构
一． 核酸中核苷酸的连 接方式 二． DNA的分子结构 三． RNA的分子结构
核酸中核苷酸的连接方式
1. 核苷酸可以被酸、碱 和酶水解，水解后产 生寡核苷酸、核苷酸、 核苷和碱基。 2. 实验证明，核苷酸是 通过磷酸二酯键彼此 相连，并且形成的是 3’-5’磷酸二酯键（后 面核酸降解中详细说 明）。
tRNA的一级结构特点
① 一般由73-78个核苷酸组成； ② 碱基中有较多的稀有碱基； ③ 3’末端均有CCA-OH结构，用以携带氨基 酸，5’多为pG或者pC。
tRNA的二级结构特点
① 氨基酸臂，由3’和5’末端的7对互补碱基构 成，携带氨基酸，富含G，形成双螺旋； ② 二氢尿嘧啶环，8-12个核苷酸组成，由34对碱基构成双螺旋； ③ 反密码子环，7个核苷酸组成，其中3个组 成反密码子环； ④ 额外环，是tRNA分类的重要标志 ⑤ TψC环，是tRNA中起连接作用的。
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• T+C反应：肼（低盐） • C反应：肼（高盐） 测定DNA长度~250bp。
化学裂解法测定DNA的核苷酸序列
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二、以使用DNA聚合酶为基础--DNA链末端终止法 基本原理：以DNA的酶促合成为基础，以被 测DNA单链为模板，通过特殊设计的“末端终 止技术合成出一系列相差一个核苷酸长度的互补 链，然后利用凝胶电泳分离这些不同长度的 DNA小片段，以此推测确定待测DNA链的碱基 顺序。
主要步骤包括：末端终止法合成不同长度 DNA小片段；DNA小片段电泳图谱解析。
Sanger法发展过程
1977年sanger发明末端终止法
“加减法”
Sanger双脱氧终止法 DNA酶法测序 DNA自动测序仪
1、“加减法”测定DNA序列的原理
☺ 以待定片断的单链DNA为模板，首先加上一个适当的引
物（一般用限制性内切酶解片段），再加入4种脱氧三 磷酸（dNTP)为底物，其中一种用放射性同位素32P标记 （例如32PdATP) ,再加入DNA聚合酶IKlenow片断；
荧光检测探头
ddNTPs参与下的DNA复制
Sanger法测序产物的平均链长取决于ddNTP： dNTP的比例，比例高时，得到较短的产物；
“标记／终止法”测序产物的平均长度可通过标记
反应中dNTP浓度(高浓度能得到长的产物)或终止反
应的ddNTP:dNTP来调整。
第二步 荧光检测
• DNA 带负电 • DNA在电泳胶中 的迁移率与其片段 大小有关
核酶的研究中的两个问题
• 核酶催化效率太低 • 由于核酶本身是RNA，很容易被核酸水解 酶(RNase)所破坏 • 因此，要将核酶应用于体内阻断基因表达或 作为抗病毒的临床药物，还要做大量的研究 工作。
◆ DNA分子酶解：将相对分子量质量大的片断用
限制性内切酶技术完成，使切割成能够用于测定的
小片段（300-500bp)；
◆ PCR技术扩增DNA片段：DNA片段数量少的情
况下，以获取一定数量用于序列测定。
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核酸序列分析
Nucleic Acid Sequence Analysis
经典方法 化学降解法 (Maxam-Gillbert法,1977)
第五节 核酸的催化性质
The catalytic properties of nucleic acids
核酶（Ribozyme）
• 核酶的发现 • 核酶的催化性质 • 核酶的研究中的两个问题
核酶的发现
• Altman发现RNase-P的蛋白部分不具催化功能， 而RNA部分在有足够浓度Mg2+ 离子存在下，能起 核酸水解酶的作用。 • Cech发现RNA原生动物四膜虫的Pre-rRNA是一种 具有自催化性能的核酶。
分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱
氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经 电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种 激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射 出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依
此确定DNA碱基的排列顺序。
第一步 加入复制终止剂
谁电 跑泳 得， 快看
基本原理：
☺ 直接引入双脱氧核苷三磷酸作为链终止剂； ☺ 将待定DNA片断分为4组，在反应体系中仍然以DNA单链为 模板，需要引物 、 DNA聚合酶和4种dNTP(其中一种用
32P/35S标记)
、一定比例不同种类的终止剂2，3-双脱氧三
磷酸(ddNTP，特异性末端终止剂) ；
☺ 在DNA合成反应混合物的4种dNTP加入少量的一种ddNTP 后，链的延伸将与偶而发生但却非常特异的链终止竞争，
使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的 四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。
☺ 四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离
开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测 DNA的核苷酸序列,如下图所示：
DNA酶法测序
三、DNA自动测序
采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列
• DNA酶(deoxyribonuclease, DNase)
• RNA酶 (ribonuclease, RNase) 依据切割部位不同分类 • 核酸内切酶： 限制性核酸内切酶
非特异性核酸内切酶
• 核酸外切酶： 5´→3´或3´→5´核酸外切酶。
核酸酶的功能
生物体内的核酸酶负责催化细胞内外核酸的降解
第三章 核酸
Nucleic Acid
王骊丽
第四节
核酸碱基序列顺序分析
(Sequence analysis of nucleic acids)
DNA碱基顺序的测定 RNA碱基顺序的测定
DNA 碱基顺序测定的基本步骤
DNA 片断的制备 DNA碱基顺序测定
DNA 片断的制备
由于DNA的分子量很大，需要先将DNA分子切割 或能够用于测定的小片段，共包括部分：
3）八聚体测序技术
4）转录测序
5）质谱法
6）原子探针显微镜 7）流动式单分子荧光检测法 8）芯片测序
核酸碱基顺序测定
• 核酸分子的核苷酸序列分析是以纯品核酸为材料， 经水解，测定核苷酸组成及比例；
• 先以外切酶确定5′- 或3′-末端核苷酸，再以内切酶 将核酸链分为若干寡核苷酸段，分段测定核苷酸 组成、比例和序列； • 最后将核苷酸序列的各寡核苷酸重叠，确定整个 核酸分子的核苷酸序列。
反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始
DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。 分别得到ddA ddT ddG ddC结尾的片段。
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3、DNA酶法测序
☺ 平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同
的引物以及四种脱氧核苷酸；
☺在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，
条件下，只C断裂，而不与T反应。 • 哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。 在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同 组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。
特异性碱基化学切割反应(2)
• G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。
• G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌 呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。
DNA自动测序结果
RNA 碱基顺序测定方法
• RNA 链碱基顺序的测定比较复杂；
• 逆转录法，以待测的RNA链为模板，在逆转录酶 纯化下，合成DNA(与RNA互补的DNA分子，常 用cDNA 表示)； • 用化学降解法 或双脱氧链终止法测定DNA碱基顺 序，再得出RNA的碱基顺序。
应用一套已知序列的寡核苷酸探针去寻找靶DNA链上 的互补序列，靶DNA上的序列根据杂交情况来确定。
• 证明了核酸既是信息分子，又是功能分子
核 酶
催化性RNA (ribozyme) • 序列特异性的核酸内切酶 • 参与RNA转录后加工修饰 • 作为针对病毒或肿瘤基因的药物降解mRNA。
催化性DNA (DNAzyme) 人工合成的寡聚脱氧 核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。
核酶的催化性质
• RNA作用于RNA • 核酸酶催化的反应主要包括:水解反应(RNA限 制性内切酶活性)，连接反应(聚合酶活性)和转 核苷酰反应等。 • 最近核酸酶的其他作用底物也已被发现，如多 糖、DNA以及氨基酸酯等。
核酶的催化过程图
转 酯 作 用
转 酯 作 用
核酸酶是指所有可以水解)
• 硫酸二甲酯（DMS ）：使DNA分子中嘌呤碱基选择性水解， 分别得到两种嘌呤碱基的甲基化产物：N3-甲基腺嘌呤核苷
和N7-甲基鸟嘌呤核苷；
• 肼：使DNA分子中嘧啶碱选择性水解，胸腺嘧啶（T）和胞 嘧啶（C）的嘧啶环断裂，生成核糖腙衍生物；再在哌啶存
在下水解，核糖腙3´-位的磷酸酯键则被水解断裂；但高盐
☺ 从引物3′端合成出一条与模板互补的、具有放射性标记的
dDNA 链混合物，反应尽量不同步，使合成的产物中各 种长度的片断都存在，然后经过琼脂糖柱纯化，除去反 应混合物中多余的4种dNTP,将纯化后的混合物分成两份， 分别进行加减法反应系统。
脱氧核苷酸与双脱氧核苷酸结构
少一个－OH
*
2、双脱氧链终止法
– Michael P. Robertson and William G. Scott Science 16 March 2007: 1549-1553. A SYNTHETIC RIBOZYME CATALYZES THE BOND FORMATION NECESSARY FOR RNA SYNTHESIS BY TRANSITION-STATE STABILIZATION AND ACID-BASE CATALYSIS, PERHAPS AS IN AN EARLY RNA WORLD. Abstract » Full Text » PDF » Supporting | | | Online Material » |
杂 交 测 序
分析化学的新发展
一、化学正在向生命科学领域渗透。
二、DNA 测序的研究工作, 历经了数十年, 成绩辉 煌, 曾两次获得诺贝尔奖。而后基因组的研究工作 是更有意义且更具挑战性的，它必将激发科学家 更大的创造力！
正在发展的几种测序方法
1）毛细管电泳激光荧光法 2）超薄层板电泳激光荧光法
双脱氧链终止法 (sanger法,1977)
杂交测序法
新技术方法
质谱法 单分子测序法 原子探针显微镜测序法 DNA 芯片法
一、以化学裂解反应为基础—化学降解法
基本原理：基于有机化学方法，选择性地切断
核苷酸（A、G、C或T）所形成的磷酸二酯键，得
到不同链长的DNA小片段；将这些片段经电泳分离； 分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放射自显 影即可在X胶片上读出DNA链的序列。 主要两个步骤：碱基选择性水解；对水解产物 DNA小片段进行电泳分析和碱基顺序的推断。
化学裂解法测定DNA的核苷酸序列
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二、以使用DNA聚合酶为基础--DNA链末端终止法 基本原理：以DNA的酶促合成为基础，以被 测DNA单链为模板，通过特殊设计的“末端终 止技术合成出一系列相差一个核苷酸长度的互补 链，然后利用凝胶电泳分离这些不同长度的 DNA小片段，以此推测确定待测DNA链的碱基 顺序。
主要步骤包括：末端终止法合成不同长度 DNA小片段；DNA小片段电泳图谱解析。
Sanger法发展过程
1977年sanger发明末端终止法
“加减法”
Sanger双脱氧终止法 DNA酶法测序 DNA自动测序仪
1、“加减法”测定DNA序列的原理
☺ 以待定片断的单链DNA为模板，首先加上一个适当的引
物（一般用限制性内切酶解片段），再加入4种脱氧三 磷酸（dNTP)为底物，其中一种用放射性同位素32P标记 （例如32PdATP) ,再加入DNA聚合酶IKlenow片断；
荧光检测探头
ddNTPs参与下的DNA复制
Sanger法测序产物的平均链长取决于ddNTP： dNTP的比例，比例高时，得到较短的产物；
“标记／终止法”测序产物的平均长度可通过标记
反应中dNTP浓度(高浓度能得到长的产物)或终止反
应的ddNTP:dNTP来调整。
第二步 荧光检测
• DNA 带负电 • DNA在电泳胶中 的迁移率与其片段 大小有关
核酶的研究中的两个问题
• 核酶催化效率太低 • 由于核酶本身是RNA，很容易被核酸水解 酶(RNase)所破坏 • 因此，要将核酶应用于体内阻断基因表达或 作为抗病毒的临床药物，还要做大量的研究 工作。
◆ DNA分子酶解：将相对分子量质量大的片断用
限制性内切酶技术完成，使切割成能够用于测定的
小片段（300-500bp)；
◆ PCR技术扩增DNA片段：DNA片段数量少的情
况下，以获取一定数量用于序列测定。
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核酸序列分析
Nucleic Acid Sequence Analysis
经典方法 化学降解法 (Maxam-Gillbert法,1977)
第五节 核酸的催化性质
The catalytic properties of nucleic acids
核酶（Ribozyme）
• 核酶的发现 • 核酶的催化性质 • 核酶的研究中的两个问题
核酶的发现
• Altman发现RNase-P的蛋白部分不具催化功能， 而RNA部分在有足够浓度Mg2+ 离子存在下，能起 核酸水解酶的作用。 • Cech发现RNA原生动物四膜虫的Pre-rRNA是一种 具有自催化性能的核酶。
分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱
氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经 电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种 激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射 出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依
此确定DNA碱基的排列顺序。
第一步 加入复制终止剂
谁电 跑泳 得， 快看
基本原理：
☺ 直接引入双脱氧核苷三磷酸作为链终止剂； ☺ 将待定DNA片断分为4组，在反应体系中仍然以DNA单链为 模板，需要引物 、 DNA聚合酶和4种dNTP(其中一种用
32P/35S标记)
、一定比例不同种类的终止剂2，3-双脱氧三
磷酸(ddNTP，特异性末端终止剂) ；
☺ 在DNA合成反应混合物的4种dNTP加入少量的一种ddNTP 后，链的延伸将与偶而发生但却非常特异的链终止竞争，
使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的 四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。
☺ 四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离
开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测 DNA的核苷酸序列,如下图所示：
DNA酶法测序
三、DNA自动测序
采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列
• DNA酶(deoxyribonuclease, DNase)
• RNA酶 (ribonuclease, RNase) 依据切割部位不同分类 • 核酸内切酶： 限制性核酸内切酶
非特异性核酸内切酶
• 核酸外切酶： 5´→3´或3´→5´核酸外切酶。
核酸酶的功能
生物体内的核酸酶负责催化细胞内外核酸的降解
第三章 核酸
Nucleic Acid
王骊丽
第四节
核酸碱基序列顺序分析
(Sequence analysis of nucleic acids)
DNA碱基顺序的测定 RNA碱基顺序的测定
DNA 碱基顺序测定的基本步骤
DNA 片断的制备 DNA碱基顺序测定
DNA 片断的制备
由于DNA的分子量很大，需要先将DNA分子切割 或能够用于测定的小片段，共包括部分：
3）八聚体测序技术
4）转录测序
5）质谱法
6）原子探针显微镜 7）流动式单分子荧光检测法 8）芯片测序
核酸碱基顺序测定
• 核酸分子的核苷酸序列分析是以纯品核酸为材料， 经水解，测定核苷酸组成及比例；
• 先以外切酶确定5′- 或3′-末端核苷酸，再以内切酶 将核酸链分为若干寡核苷酸段，分段测定核苷酸 组成、比例和序列； • 最后将核苷酸序列的各寡核苷酸重叠，确定整个 核酸分子的核苷酸序列。
反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始
DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。 分别得到ddA ddT ddG ddC结尾的片段。
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3、DNA酶法测序
☺ 平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同
的引物以及四种脱氧核苷酸；
☺在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，
条件下，只C断裂，而不与T反应。 • 哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。 在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同 组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。
特异性碱基化学切割反应(2)
• G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。
• G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌 呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。
DNA自动测序结果
RNA 碱基顺序测定方法
• RNA 链碱基顺序的测定比较复杂；
• 逆转录法，以待测的RNA链为模板，在逆转录酶 纯化下，合成DNA(与RNA互补的DNA分子，常 用cDNA 表示)； • 用化学降解法 或双脱氧链终止法测定DNA碱基顺 序，再得出RNA的碱基顺序。
应用一套已知序列的寡核苷酸探针去寻找靶DNA链上 的互补序列，靶DNA上的序列根据杂交情况来确定。
• 证明了核酸既是信息分子，又是功能分子
核 酶
催化性RNA (ribozyme) • 序列特异性的核酸内切酶 • 参与RNA转录后加工修饰 • 作为针对病毒或肿瘤基因的药物降解mRNA。
催化性DNA (DNAzyme) 人工合成的寡聚脱氧 核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。
核酶的催化性质
• RNA作用于RNA • 核酸酶催化的反应主要包括:水解反应(RNA限 制性内切酶活性)，连接反应(聚合酶活性)和转 核苷酰反应等。 • 最近核酸酶的其他作用底物也已被发现，如多 糖、DNA以及氨基酸酯等。
核酶的催化过程图
转 酯 作 用
转 酯 作 用
核酸酶是指所有可以水解)
• 硫酸二甲酯（DMS ）：使DNA分子中嘌呤碱基选择性水解， 分别得到两种嘌呤碱基的甲基化产物：N3-甲基腺嘌呤核苷
和N7-甲基鸟嘌呤核苷；
• 肼：使DNA分子中嘧啶碱选择性水解，胸腺嘧啶（T）和胞 嘧啶（C）的嘧啶环断裂，生成核糖腙衍生物；再在哌啶存
在下水解，核糖腙3´-位的磷酸酯键则被水解断裂；但高盐
☺ 从引物3′端合成出一条与模板互补的、具有放射性标记的
dDNA 链混合物，反应尽量不同步，使合成的产物中各 种长度的片断都存在，然后经过琼脂糖柱纯化，除去反 应混合物中多余的4种dNTP,将纯化后的混合物分成两份， 分别进行加减法反应系统。
脱氧核苷酸与双脱氧核苷酸结构
少一个－OH
*
2、双脱氧链终止法
– Michael P. Robertson and William G. Scott Science 16 March 2007: 1549-1553. A SYNTHETIC RIBOZYME CATALYZES THE BOND FORMATION NECESSARY FOR RNA SYNTHESIS BY TRANSITION-STATE STABILIZATION AND ACID-BASE CATALYSIS, PERHAPS AS IN AN EARLY RNA WORLD. Abstract » Full Text » PDF » Supporting | | | Online Material » |
杂 交 测 序
分析化学的新发展
一、化学正在向生命科学领域渗透。
二、DNA 测序的研究工作, 历经了数十年, 成绩辉 煌, 曾两次获得诺贝尔奖。而后基因组的研究工作 是更有意义且更具挑战性的，它必将激发科学家 更大的创造力！
正在发展的几种测序方法
1）毛细管电泳激光荧光法 2）超薄层板电泳激光荧光法
双脱氧链终止法 (sanger法,1977)
杂交测序法
新技术方法
质谱法 单分子测序法 原子探针显微镜测序法 DNA 芯片法
一、以化学裂解反应为基础—化学降解法
基本原理：基于有机化学方法，选择性地切断
核苷酸（A、G、C或T）所形成的磷酸二酯键，得
到不同链长的DNA小片段；将这些片段经电泳分离； 分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放射自显 影即可在X胶片上读出DNA链的序列。 主要两个步骤：碱基选择性水解；对水解产物 DNA小片段进行电泳分析和碱基顺序的推断。