活体电穿孔法介绍

活体电穿孔法介绍1、什么是活体电穿孔活体电穿孔法(in vivo electroporation) 是将外源基因通过电场作用，导入动物目标组织或器官。

由于这种方法能有效导入外源基因，可在多种组织器官上应用,并且效率较高。

活体电穿孔法的原理很简单,在直流电场作用的瞬间,细胞膜表面产生疏水或亲水的微小通道105～115μm ,这种通道能维持几毫秒到几秒,然后自行恢复。

在此期间生物大分子如DNA 可通过这种微小的通道进入细胞。

近年来活体电穿孔法用于转基因研究的报道不断增多,在基因治疗方面的优势也日趋显著,是一种很好的活体基因导入方法。

活体电穿孔法可用于检测瞬时表达系统中载体的表达状况。

大量的研究表明活体电穿孔法在基因治疗方面有非常好的应用前景。

因此目前国内外对活体电穿孔法介导外源基因转移的研究越来越多。

2、活体电穿孔的法的特点活体电穿孔法基因导入和表达效率较高,它的特点主要在以下几个方面:首先,靶器官的选择面广,理论上任何组织和器官都可以作为活体电穿孔的靶器官。

在用于基因治疗方面，要考虑到靶器官组织生理特性。

如果所选择的局部组织细胞不能把所转移基因的表达产物分泌到外周血液循环中,则在某种意义上说已失去了基因导入的价值,这在基因治疗中是关键性的问题。

当使用组织特异性表达载体时,研究人员应根据所构建的表达载体来选择基因转移和表达的靶器官组织。

例如鱼精蛋白21 启动子可指导外源基因在精母细胞中特异性表达,以小鼠的睾丸作为靶器官将含有鱼精蛋白21启动子的表达载体导入,获得外源基因的表达量远远高于该基因在肝脏和骨骼肌中的表达。

其次,对导入的外源基因片段的大小没有限制,从几KB 或十几KB 的表达载体, 到100～200KB 的YAC、BAC 基因组,都有成功导入并获得表达的报道。

此外活体电穿孔法操作简单快速,电穿孔的时间只有几秒钟,而且DNA片段不需要特殊的纯化操作。

但电穿孔法也存在一些的缺点:首先,外源基因表达持续的时间很短,虽然外源基因导入后最快可在215 小时有表达,但大多1～2 月后表达量降至很低。

外源基因表达的时间主要由于所构建的表达载体和基因导入的靶细胞组织器官不同而存在巨大差异。

由于应用不同的表达载体,Muramatsu 在小鼠肝脏进行电穿孔7天后则检测不到外源基因的表达,而Heller 21 天后还可以检测到外源基因的表达。

如果选择代谢和酶活动旺盛的组织器官如肝脏,则表达持续时间会较短,表达时间在1 个月以内,但以骨骼肌为靶组织,表达可持续15个月。

3、活体电穿孔法与其他活体基因导入方法的比较到目前为止,非病毒载体的活体基因导入方法有直接注射法、脂质体法、基因枪法、电穿孔法等。

每一种方法都有其各自的特殊性,因此很难将这几种方法进行简单的比较。

直接注射法：可将外源基因直接注射到靶位点或血管中,但此种方法不适合以肌肉作为靶器官,它的外源基因表达效率极低,仅为电穿孔法的百分之一。

脂质体法：活体基因转移法中脂质体法更适宜较大面积组织的基因导入,但无法避免DNA浓度变低,在出血的情况下会使本来不高的DNA浓度更加降低,往往造成基因导入效率低。

基因枪法：适合于DNA较易接触到的质地较坚韧的组织如皮肤,而视网膜、胚胎和禽类的胚盘等组织会由于机械刺激和出血造成器质性损伤或发育停滞,因而不能用基因枪法完成。

DNA包裹的金属颗粒从基因枪发出到达组织表面大多只几百微米的距离,较深层的组织不易操作, 表达效率也较低。

Muramatsu报道在材料一致的情况下,电穿孔法的基因导入和表达效率明显高于其它方法,而且电穿孔法适合多种组织的操作[3 ] 。

4 活体电穿孔法施加条件的研究波型的选择在电穿孔过程中方波较指数衰减波更能获得较高的基因表达。

同时方波只要要求控制电压和时间，十分直观，而指数衰减波需要控制的电压、电容、电阻等参数，这样的条件摸索过程中，方波较指数衰减波更易得到高表达。

电压电穿孔时在能量导入一定的情况下设计施加电压的值。

电压过低或过高都会影响外源基因的表达。

电压过低时,无法造成细胞膜表面状态的改变,因而外源D不能进入细胞内。

电压过高时,局部组织积聚过多热量,造成细胞的死亡或组织失去功能,即使外源基因导入细胞,也无法进行正常的表达。

哺乳动物常用的活体电压大多为20～100VPcm ,最高电压在250～750VPcm。

电穿孔次数和时间有试验证明,皮肤的电阻在每一次电穿孔后都有所降低，说明电穿孔使皮下组织形成孔道,且其大小随电穿孔而变大,经过电穿孔的处理后外源基因更易在更深的真皮和毛囊内表达。

但电穿孔次数不能过多,否则会对局部的细胞组织造成不可逆的损害,基本应在10 次以内,每组电穿孔时间应在20～100msec 。

能量的测算电穿孔过程中能量的测算公式为: Q(J ) = V2 TP412R 其中Q 代表电穿孔时导入的能量,V 代表施加的电压,T 代表电穿孔延续的时间,R 代表作用组织的电阻。

试验证明在导入能量一定的情况下外源基因转移效率也相近。

在此原则基础上可根据不同的组织器官选择不同的电压和电穿孔时间。

温度由于电穿孔瞬间在局部会产生大量热,因此操作过程中,DNA 转染试剂应保持4 ℃,同时电穿孔操作部位的温度也应适当降低,Muramatsu 证明温度较低的情况下,外源基因的转移表达效率会有明显的提高。

此外在电穿孔操作部位温度降低的同时可以有效抑制局部组织的出血和外源DNA 的流失,这样也在一定程度上保证了基因的导入效率。

DNA 的状态和浓度很多试验都证明线状DNA 较环状DNA 在活体电穿孔法瞬时表达系统的建立中效果较好[12 ] 。

DNA 的浓度应在1～40mgPml 范围内。

DNA 溶液组分DNA溶液中不应含有不能分解成离子的组分,如甘露糖醇、蔗糖等。

这些大分子存在时会降低基因的转移效率。

5、活体电穿孔法在不同组织上的应用肌肉组织在肌肉组织中最初进行外源基因活体导入是采用电穿孔法。

选择肌肉组织作为靶组织是因为肌肉组织在体内所占比例很大,约占40 % ,而且外源基因可在肌肉中长期表达、分泌,在基因治疗中经常会用到。

此外,外源基因也不会因肌细胞的分裂而丢失。

皮肤皮肤组织相对于其他组织较难进行电穿孔法的基因导入,因为皮肤比较薄,电阻相对低,要求电流较高。

但如果电流过大,会严重影响基因的表达,因此应适当降低电流和电压,延长电穿孔的时间。

另外,由于皮肤组织含有的脂肪细胞分布不均,会干扰电穿孔的作用,因此只推荐用镊状电极,且应将动物被毛刮净后操作。

虽然外源基因在皮肤中表达的时间较肌肉中短,但可利用活体电穿孔法对很多皮肤疾病进行治疗。

肝脏由于肝脏的生理代谢十分旺盛,因此外源基因在肝脏中的表达时间往往很短暂,而且表达产物的水平也较低。

为减少出血,可从小静脉注入，然后在肝脏上施加电场,能显著增强基因的表达。

睾丸相对于其他的转基因方法,活体电穿孔法可使外源基因在睾丸中产生大量和持久的表达。

此外,很多研究人员希望利用活体电穿孔法将外源基因导入精子, 进而通过授精得到转基因动物。

Yamazaki 等[13 ] 和Ryoki 等[14 ] 用甲磺酸丁二醇二酯注射或用手术法将动物人为造成隐睾,大部分体细胞和分化了的精母细胞减少,这样使外源基因导入精原细胞的几率增加。

Ryoki 等[14 ] 将基因与病毒诱导的整合酶基因共转染,可在精原细胞中检测到外源基因的表达,且病毒诱导的双基因共转染较单基因整合效率更高。

但目前用这种方法获得转基因动物还较难。

禽类输卵管对禽类输卵管活体电穿孔的研究很少,但这一方法却有很广阔的发展前景。

因为输卵管腺体细胞具有很强的分泌功能,可以将大量蛋白分泌到鸡蛋中。

也可以利用此瞬时表达系统检测含卵清蛋白启动子的载体功能。

Park 等用活体电穿孔法以荧光素基因导入鸡输卵管上皮,检测到荧光素活性约4500RLUPmg 组织[15 ] 。

眼睛、胚胎和禽类胚盘这三种组织都是很脆弱的,如果实施基因枪法,会使靶组织因强烈的机械损伤而失去功能或直接导致发育停滞。

Sakamoto 将血纤蛋白溶酶原激活因子基因导入眼睛中,有效抑制了眼睛在淤伤后血纤蛋白的反应。

哺乳动物胚胎的电穿孔操作包括离体和子宫内操作。

禽类胚胎基本是在蛋壳中进行电穿孔的,而且表达快速,Momose 等报道电穿孔施加后215 小时在鸡胚中就可以检测到外源基因的表达,这在使用病毒载体时也是不可能的。

当电场被限定在一个很小的范围内时,基因可以定点表达, 这是活体电穿孔法的又一优点,Katahira 等[17 ] 证实可将外源基因导入鸡胚大脑、心脏和一些微小组织(如中胚层,间充质和体节) 中进行表达。

6、活体电穿孔法进行基因治疗及外源基因表达的调控6．1 活体电穿孔法在基因治疗方面的应用原来在基因治疗中利用活体电穿孔法将抗体或化疗药物导入肿瘤中,促进抗体和化疗药物的运送来进行治疗,现在则以特异的外源基因替代了抗体的应用,简化操作步骤同时降低了费用。

首先,在皮肤瘤和脑瘤的治疗中,电穿孔法可有效地将药物基因导入治疗部位。

电穿孔法导入人单核细胞趋化物蛋白基因到大鼠脑瘤后,该蛋白在肿瘤的局部表达,同时在基因导入的部位可观察到巨噬细胞和白细胞的聚集。

同时有科学家从另一角度研究电穿孔对治疗肿瘤方面的作用,利用高电场强度的陡脉冲促使肿瘤细胞发生不可逆性电击穿而最终死亡,这种方法很适于局部组织肿瘤的治疗。

此外,活体电穿孔法还可以参与癌症的治疗,通过活体电穿孔法将基因导入机体后,导入组织可成为分泌抗体等物质的临时分泌器官,以抵抗癌细胞的侵蚀或代偿由于癌细胞的侵蚀而造成的机体多种生理机能的丧失。

除了可以利用活体电穿孔法对肿瘤进行局部治疗外,还可以治疗机体的内分泌系统和免疫系统的疾病。

可在机体局部以活体电穿孔法导入编码分泌型蛋白的基因,这种重组的治疗蛋白可以随着血液循环分布到全身各种组织和细胞进行治疗。

如在活体电穿孔骨骼肌导入EPO 基因后,可通过红细胞比容值检测到EPO 基因表达产物的增加。

Yasui 等在小鼠体内检测到活体电穿孔法导入的胃泌素基因的表达产物和人的单克隆抗体。

在不远的将来,研究人员可以选择机体的一种组织的某个位置作为活体电穿孔的靶位点,将治疗基因从该位点导入进而表达,因此又可以把这个特殊的组织当作机体的一个人造的内分泌或免疫组织,对病人进行相应的治疗。

活体电穿孔法可对系统疾病产生作用并且安全有效。

将不同类型的耐药基因同时导入造血细胞,以扩大耐药范围和进行体内选择是基因治疗的重要策略,这类载体基因片段大多较长,进行传统基因导入有一定的难度。

有报道可以用活体电穿孔法将醛脱氢酶基因和多药耐药基因共转移并在PA317 细胞中获得高效表达,转导率达98 % ,测定药物蛋白表达较常规方法增高4 倍。

此外电穿孔法有很高的经皮促渗作用,可进行很多经皮给药的治疗。