11免疫印迹技术课稿PPT课件
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免疫血清的应用之免疫印迹PPT精品课程课件讲义
方法已被广为采用，其中三种分别称为Southern、
Northern、Western印迹法，分别用于检测DNA、RNA和蛋 白质。 其中Western印记又称为免疫印迹。
• 免疫印迹是根据抗原抗体的特异性结合，检测复杂样品中
某种蛋白的方法。可以分为斑点印迹和电泳转移印记。
• 电转移印记操作可分为三个过程：
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免疫血清的应用之免疫印迹
主讲：XX XX
凡大医治病，必当安神
定志，无欲无求，先发大慈恻 隐之心，誓愿普救含灵之苦。
- - 孙思邈
PPT内容可自行编辑
开始上课！
一、实验原理
• 印迹法：将生物大分子物质（如核酸或蛋白质）通过不同
的途径转移到固相载体上，转移后的固相载体经淬灭试剂 处理后，用适当的溶液漂洗，置于含底物或探针的溶液中 孵育，可与对于的探针反应，显出特异条带。 • 自从1975年建立印迹法以来，目前比较成熟的有四种印记
• 不足之处：
• 操作要求高
• 成本高
• 结果判断主要依据条带的有无以及条带的亮度
二、实验材料
• • • • • • • • • • • • •
待检抗原：红细胞裂解液；2×SDS凝胶加样缓冲液； SDS-PAGE凝胶制备相关材料； 电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸电泳缓冲液； 预染蛋白质Marker； 染色液，脱色液； 转膜缓冲液； 硝酸纤维素滤膜（NC膜）和定性滤纸； 洗涤液：TBST； 封闭液：以TBST稀释的3％脱脂牛奶； 免疫血清：兔/小鼠抗鸡红血球免疫血清，使用时以TBST稀释100倍； 二级抗体：HRP标记的羊抗兔IgG，使用前以TBST稀释1500倍； 显色液：3,3'-二氨基联苯胺（3,3'-diaminobenzidine, DAB）显色试剂； 终止液：灭菌蒸馏水。
优质课件抗核抗体谱免疫印迹法
抗核小体抗体（ANuA）
核小体是真核细胞染色质的基本 复制单位，含组蛋白二聚体H2AH2B和H3-H4，其外面为146个碱 基对组成的双链DNA。
参与SLE发病机制：多克隆B细胞 活化剂产生ANuA，先于其他ANA 促进抗dsDNA与AHA形成参与LN的 发生。
抗核小体抗体（ANuA）
核小体抗体是SLE的诊断标记，其诊断灵敏度为70-90%。 在SLE的活性期，此抗体的检出率几乎为100%，在非活动期的 SLE中为62%（相应的dsDNA抗体检出率仅为3.3%）。
者出现核糖体P蛋白抗体与中枢神经系统、肝脏或肾脏受累有 关。在抗核抗体阴性的SLE患者，抗核糖体抗体阳性有重要诊 断价值。
抗ds-DNA抗体
SLE 的血清特异性抗体。 多有致病性（IgG型），与亲和力（高）有关。 与LN与SLE疾病活动性相关，活动期达90％。可用于SLE 疾
病活动期判断＆药物疗效观察。 与SLE急性皮疹、血管炎、浆膜腔炎、白细胞减少等有关。
类风湿关节炎中的抗核抗体
抗原
阳性率
组蛋白
15-50%
单链DNA（ssDNA）
8%
U1-nRNP
Hale Waihona Puke 3%RANA90-95%
干燥综合征（SS）
外分泌腺受累的自身免疫疾病
症状: - 口腔干燥 - 唾液及眼泪减少 - 腮腺肿胀 - 胰腺外分泌腺分泌不足
口腔干燥
腮腺肿胀
ANAs与干燥综合征（SS）的相关性
原发性干燥综合征中的自身抗体
整个细胞，包括细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期 蛋白等。
自身免疫性疾病与ANAs的相关性
第二章
2 自身免疫性疾病与ANAs的相关 性 单击添加文本 … …
免疫印迹技术 ppt课件
试剂名称 氟化钠 正钒酸钠 焦磷酸钠 抑制作用 酸性磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶 丝氨酸-苏氨酸磷酸
ppt课件
13
2.5 还原剂
. 防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。 DTT、β－巯基
乙醇等。
2.6 其它
水；溶剂; NaCl。
超纯水的电阻率就是单位厘米内的水 的电阻值。 即18.25MΩ*CM.
ppt课件 14
2.7 全蛋白抽提时注意事项
抑制蛋白酶及磷 酸酶
裂解液的用量
可以适量加入甘 油,稳定蛋白
注意事项
细胞或组织的样 本量
使 用 的 Detergent 的 种 类 纯度 浓度 干 扰 去除等因素
可以适量加入 Benzonase /DNase I等核酸 酶 , 去 除 DNA, 充 分提取蛋白,降 低提取的粘度.
一个稳定而不断向阳极移动的界面。
由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集 聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数
2、细胞裂解液
缓冲液 表面活性剂
其它：H2O、NaCl、等
RIPA Buffer
蛋白酶抑制剂
还原剂
磷酸酶抑制剂
ppt课件
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2.2 表面活性剂
溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白） 分为
1 阴离子型: SDS，脱氧胆酸盐 2 阳离子型: CPB和CTAB 3 双性离子型: CHAPS和Zwittergent系列 4 非离子型: Brij系列、Triton-100 、Nonidet P40、Tween 系列等
即可计算待测蛋白的浓度。
BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织 细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影
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2.5 还原剂
. 防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。 DTT、β－巯基
乙醇等。
2.6 其它
水；溶剂; NaCl。
超纯水的电阻率就是单位厘米内的水 的电阻值。 即18.25MΩ*CM.
ppt课件 14
2.7 全蛋白抽提时注意事项
抑制蛋白酶及磷 酸酶
裂解液的用量
可以适量加入甘 油,稳定蛋白
注意事项
细胞或组织的样 本量
使 用 的 Detergent 的 种 类 纯度 浓度 干 扰 去除等因素
可以适量加入 Benzonase /DNase I等核酸 酶 , 去 除 DNA, 充 分提取蛋白,降 低提取的粘度.
一个稳定而不断向阳极移动的界面。
由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集 聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数
2、细胞裂解液
缓冲液 表面活性剂
其它：H2O、NaCl、等
RIPA Buffer
蛋白酶抑制剂
还原剂
磷酸酶抑制剂
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2.2 表面活性剂
溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白） 分为
1 阴离子型: SDS，脱氧胆酸盐 2 阳离子型: CPB和CTAB 3 双性离子型: CHAPS和Zwittergent系列 4 非离子型: Brij系列、Triton-100 、Nonidet P40、Tween 系列等
即可计算待测蛋白的浓度。
BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织 细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影
抗核抗体谱免疫印迹法课件
操作简便
免疫印迹法自动化程度高， 操作简便，减少了人为误 差。
与其他免疫检测方法的比较
与酶联免疫吸附试验（ELISA）比较
免疫印迹法可以同时检测多个抗原，而ELISA只能检测单个抗原。
与胶体金试纸法比较
免疫印迹法具有更高的灵敏度和特异性，检测结果更可靠。
优缺点分析
优点
高灵敏度、高特异性、操作简便 、可同时检测多个抗原。
原理
该方法基于抗原抗体反应的原理，将ANA与固相载体上的核抗原进行反应，再 通过显色反应或放射自显影等方法检测ANA的存在和滴度。
发展历程与现状
发展历程
自20世纪50年代发现ANA以来，抗核抗体谱免疫印迹法经历了放射免疫分析法、酶 联免疫吸附法（ELISA）等不同发展阶段，目前已经形成了较为成熟的检测技术。
实验操作应严格按照操作流程 进行，避免出现误差。
实验结束后应及时清洗实验器 具，整理实验台面，保持实验
室整洁。
03
抗核抗体谱免疫印迹法结果解读
结果判读标准
阴性质控
阴性结果，表示未检测 到抗核抗体谱。
弱阳性
弱阳性结果，表示抗核 抗体谱水平较低，可能
存在轻度异常。
阳性
阳性结果，表示抗核抗 体谱水平较高，可能存
缺点
成本较高、需要专业设备和技术 人员。
05
抗核抗体谱免疫印迹法的未来发展与
展望
新技术与新方法的应用
人工智能与机器学习
利用人工智能技术对免疫印迹图像进行自动识别和分析，提高检 测的准确性和效率。
纳米技术与生物传感器
应用纳米技术提高免疫印迹法的灵敏度和特异性，同时开发新型生 物传感器用于快速检测。
在免疫系统疾病。
强阳性
蛋白质免疫印迹实验(Western-BlotPPT课件
硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角 剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从 膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液 中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在 滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小 心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶 舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿 的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源 进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电 转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰 染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干 滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
.
1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
.
1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST
免疫印迹法的实验技术PPT课件
根据实验结果和反馈，不断优化和改 进实验条件和方法，提高实验质量。
改进实验方法
积极探索和尝试新的实验方法和技术， 提高实验效率案例一：病毒抗原的检测
总结词
高效、准确
详细描述
免疫印迹法在病毒抗原检测中具有高效、准确的优点，能够快速识别病毒抗原， 为临床诊断和治疗提供有力支持。
疾病诊断
药物研发
通过检测患者血清或其他体液中的蛋白质 表达水平，辅助医生对疾病进行早期诊断 、分型和监测病情进展。
在药物筛选和药效评估过程中，利用免疫 印迹法检测药物对特定蛋白质表达的影响 ，从而评估药物的疗效和安全性。
生物标志物研究
蛋白质相互作用研究
通过免疫印迹法检测生物样本中特定蛋白 质的表达水平，有助于揭示生物标志物与 疾病发生、发展之间的关系。
存。
03
实验操作流程
样品处理与分离
样品选择
选择适当的组织或细胞样品，确保其具有代 表性。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和蛋白提取试剂，确保蛋 白质的完整性和活性。
细胞分离
根据细胞类型和实验需求，采用不同的分离 方法，如组织匀浆、离心等。
蛋白定量
采用BCA法、Bradford法等方法对提取的蛋 白进行定量，以便后续操作。
转印与封闭
01
02
03
转印膜选择
根据实验需求选择适当的 转印膜，如NC膜、PVDF 膜等。
转印条件
设置适当的电流、电压和 转印时间，确保蛋白质成 功转移至膜上。
封闭操作
采用合适的封闭液对转印 膜进行封闭，以减少非特 异性结合。
免疫反应与显色
一抗选择
根据实验目的选择特异性的一抗，确 保与目标蛋白的结合。
案例二：肿瘤标志物的检测
蛋白质免疫印迹技术及PPT课件
实验案例二：蛋白质相互作用分析
总结词
蛋白质相互作用分析有助于了解蛋白质之间的相互作用关系，进一步揭示生物学过程的分子机制。
详细描述
在实验中，首先将蛋白质样品进行分离和提纯，然后通过电泳分离蛋白质，再将其转移到膜上。接下 来，利用抗体技术检测两种蛋白质是否相互作用。这种方法可以用于研究蛋白质之间的相互作用关系 ，为生物学过程的研究提供重要信息。
归一化处理
将目标蛋白的密度与内参蛋白的密 度进行归一化，消除实验误差。
统计学分析
对实验组和对照组的数据进行统计 分析，比较组间差异。
数据分析的注意事项
数据可靠性
确保数据来源可靠，避免数据污染和误差。
数据可比性
确保实验条件一致，使数据具有可比性。
数据解读
结合生物学背景和实验目的，对数据进行合理解 读。
凝胶电泳
01
02
03
确定电泳条件
根据蛋白大小和分离需求， 选择合适的凝胶浓度和电 泳电压。
加样与电泳
将稀释后的蛋白样品加入 凝胶的加样孔中，开始电 泳分离蛋白质。
染色与脱色
电泳结束后，对凝胶进行 染色，使蛋白质条带显现 出来，然后进行脱色处理。
转膜
选择合适的转移膜
根据需要，选择NC膜、 PVDF膜等适合的转移膜。
实验操作流程
1. 样品制备
将细胞或组织提取蛋白，进行浓 度测定。
2. 阻断
将膜置于脱脂奶粉或BSA中，封 闭非特异性结合位点。
3. 抗体孵育
将抗体与膜在适当条件下孵育， 使抗体与目标蛋白结合。
6. 结果观察
通过荧光显微镜或其他成像设备 观察蛋白条带。
5. 显影
将荧光染料或其他标记物与抗体 结合，使蛋白在膜上显像。
Wesern-bloing蛋白免疫印迹实验ppt课件
子时要使梳子保持水平。）
④ 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，
槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
27
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
①测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋 白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白 变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。
2.结果分析
3.注意事项
四
实验室常见问题解答
20
蛋白样品制 备 蛋白含量测
定
21
在六孔板中，按照一 个孔添加150μL的比 例添加适量RIPA裂解 液，用枪吹打均匀以 充分接触细胞。
样品放置冰上 30min（中间混 匀5-6次）直至 裂解完全。
充分裂解后，1000014000g离心3-5分钟， 取上清，即可进行后续 的PAGE、Western和免 疫沉淀等操作
②加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃 板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样 器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气
泡也可能使样品溢出。）
28
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
浓缩胶80V电压跑20 分钟，可多跑几分钟； 分离胶180V电压跑 至底端。
疾病早期诊断
例：诸延慧，容瓘等.酶联免疫印迹术(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期 诊断中的应用[J]. 中国人兽共患病杂志,1993,9(3):26-29.
5
检测样品中特异性蛋白质是否
④ 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，
槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
27
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
①测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋 白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白 变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。
2.结果分析
3.注意事项
四
实验室常见问题解答
20
蛋白样品制 备 蛋白含量测
定
21
在六孔板中，按照一 个孔添加150μL的比 例添加适量RIPA裂解 液，用枪吹打均匀以 充分接触细胞。
样品放置冰上 30min（中间混 匀5-6次）直至 裂解完全。
充分裂解后，1000014000g离心3-5分钟， 取上清，即可进行后续 的PAGE、Western和免 疫沉淀等操作
②加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃 板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样 器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气
泡也可能使样品溢出。）
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清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
浓缩胶80V电压跑20 分钟，可多跑几分钟； 分离胶180V电压跑 至底端。
疾病早期诊断
例：诸延慧，容瓘等.酶联免疫印迹术(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期 诊断中的应用[J]. 中国人兽共患病杂志,1993,9(3):26-29.
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检测样品中特异性蛋白质是否
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原
理
流
程
图
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三、注意事项
▪ 1． 免疫印迹技术所测定的只是目的蛋白的相对 含量。因此不能确定一种细胞含有多少目的蛋白， 只能确定该蛋白存在与否及其它条件下与其他细 胞相比蛋白的含量是高还是低。
择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合
在硝酸纤维素膜上。
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▪2、抗原转移
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二、基本操作流程
2、estern Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸
纤维素膜（NC）和偏二氟乙烯(PVDF膜），此外也
有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。
法，低渗缓冲液裂解法。可以参考相关文献提取
这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽
提.
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二、基本操作流程
▪ 1、SDS-PAGE ▪ ①收集或提取蛋白样品 ▪ ②测定蛋白样品浓度 ▪ 一般来说有三种方法：第一种是采用
定量试剂盒；第二种是采用光学检测法； 第三种直接跑SDS-PAGE。
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二、基本操作流程
▪ 3、封闭
▪
电泳转移后，固相纸膜上还留有无蛋白组分
结合的区域，在对蛋白质进行专一性检测的时候，
由于免疫学检测试剂中的蛋白质（抗体），在与
特异性抗原结合的同时也会非特异的结合固相上
的空白区域，产生高背景，导致检测结果不明显， 因此要对这些空白区域进行封闭。
2020年9月28日
4
基本内容
1 免疫印迹技术的原理
2
基本操作流程
3
注意事项
4 免疫印迹技术的应用
5
课堂小结
6
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作业
5
一、免疫印迹技术的原理
▪
通过SDS-PAGE区分不同大小的蛋白组分，并
转移至固相支持物（硝酸纤维素膜），通过特异
性试剂（抗体）作为探针，与固相支持物上的蛋
白质（抗原）发生抗原抗体反应，再通过显色反
第11讲
免疫印迹技术
2020年9月28日
1
2020年9月28日
2
2020年9月28日
3
雕版印刷是最早在中国出现的印刷形式，在 印刷史上有“活化石”之称，扬州是中国雕版印 刷术的发源地，是中国国内唯一保存全套古老雕 版印刷工艺的城市。
雕版印刷术是一种具有突出价值且民族特征 鲜明、传统技艺高度集中的人类非物质文化遗产。 它凝聚着中国造纸术、制墨术、雕刻术、摹拓术 等几种优秀的传统工艺，最终形成了这种独特文 化工艺；它为后来的活字印刷术开了技术上的先 河，是世界现代印刷术的最古老的技术源头。
且容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条
件）。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件
下可以稳定保存很长时间。
▪ 2020年9月28日
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二、基本操作流程
2、抗原转移 NC膜简介
但是纯的硝纤膜在比较脆，容易卷，不 适合用于需要多次重复清洗的用途。选择 缺 硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通 常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的 膜，小于20KD的话建议选择0.2um的，如 果小于7KD的话最好选择0.1um的膜。
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二、基本操作流程
2、抗原转移
NC膜简介
▪ 硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用
的转移介质，其优点是对蛋白有结合能力
优
强，适用于各种显色方法（包括同位素， 化学发光、常规显色、染色和荧光显色），
背景低，性价比高；使用也很简便（不需
要甲醛预处理，只须在无离子水面浸润排
出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡；而
10
二、基本操作流程
▪ 1、SDS-PAGE
▪
①收集或提取蛋白样品
▪
②测定蛋白样品浓度
▪
③电泳
▪
④电泳结果检查
▪
考马斯亮蓝使用简便快速，是最经济通用的
蛋白PAGE胶电泳染色方法。银染操作复杂一些但
分辨率高很多。可是由于考马斯亮蓝染色或者银
染经过固定不可逆结合，会干扰后面的Western
Blot实验，很多人会选择省略掉这一步。
应对靶物质进行检测。
▪
蛋白质的Western blotting技术结合了凝胶
电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多
种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－
100pg）中等大小的靶蛋白。
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6
二、基本操作流程
1、SDS-PAGE
④
电泳结果检查
③
电泳
②
测定蛋白样品浓度
①
收集或提取蛋白样品
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二、基本操作流程
▪ 1、SDS-PAGE
▪
①收集或提取蛋白样品
▪
可以使用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬
浮细胞或组织样品。
▪
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞
核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，用SDS上样
缓冲液，裂解能力强，能提取细胞总蛋白。
▪
另外，常用的还有非离子去垢剂缓冲液裂解
▪
同样的样品跑2块胶，一块染色一块转膜，一
般也可以说明问题。
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二、基本操作流程
▪ 2、抗原转移
▪
通常有两种方法：毛细管印迹法（转移效率
较低）和电泳印迹法（常用）。
▪ 电泳印迹法-----用有空的塑料盒有机玻璃板
将凝胶和硝酸纤维素膜夹成“三明治”状，而后
浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选
▪ 膜的选择根据：
▪ a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能 结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大 小）；
▪ b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方 法，信噪比好）；
▪ c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱 分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。
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二、基本操作流程
▪ 1、SDS-PAGE
▪ ①收集或提取蛋白样品
▪ ②测定蛋白样品浓度
▪ ③电泳
▪ 配制SDS-PAGE凝胶，在收集的蛋白样品 中加入上样缓冲液，点样后接通电源开始 电泳。
▪ 利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效 应将不同分子量大小的蛋白质分离。
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▪
最常用的封闭剂就是脱脂奶粉。
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各种常见的封闭剂
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二、基本操作流程
▪ 4、免疫检测
▪ 把已经封闭过的膜放入加入已知抗体 的缓冲液中，对特异性的靶抗原进行检测。
▪ 这个过程通常会发生多步反应，一般 采用间接检测法，常用的检测系统有放射 性同位素、酶、荧光素等，通过放射自显 影或显色反应检测抗原-抗体复合物，从而 达到对蛋白质进行特异性检测和鉴别的目 的。