常规病毒学实验技术
病毒学实验技术 [病毒学,实验技术]
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病毒学实验技术 [病毒学,实验技术]病毒学实验技术病毒学实验技术目的要求通过实验掌握常用的病毒学实验技术和诊断方法。
操作步骤一、病毒诊断用病料的采集病毒分离用生物学材料的最理想的采集时期，是在机体尚未产生抗体之前的疾病急性期。
各种病料，例如血液、鼻咽拭子、粪、尿、脓汁、水泡液、皮肤病变、脊髓液和活体穿刺材料以及剖检时采取的组织，均可用于病毒分离。
每个具体疾病需要采取什么样的生物标本，可参考有关疾病的叙述，特别是其诊断部分。
有一些总的规则适用于病毒分离用的组织的正确选择。
呼吸道疾病在急性期，通常在鼻或咽分泌物排出病毒。
在痘病的水泡液中或痂皮内也可发现病毒。
许多全身性卡他性疾病具有病毒血症期，易于由血液中分离到病毒。
实际上急性发病期间，机体的所有分泌物中都含有病毒。
与中枢神经系统有关的疾病较特殊，但也可由血液或病死动物的脑内分离病毒。
采取组织标本时一个最为重要的注意事项，就是必须在动物死亡后立即进行--必要时可扑杀濒死动物，就更有利于病毒分离。
同时应采取该动物血液作血清学试验,在冰冻前必须先从全血中分离血清，因为溶血标本经常不再能做某些血清学试验。
各种病毒的生物物理学和生物化学特性明显不同。
许多病毒对热及酸敏感，故在采集材料时必须特别注意。
尤其是必须采取新鲜材料，并立即置-60℃至-70℃下冰冻。
此外，在用这些病料接种组织培养物或试验动物分离病毒时，时间尽量要短。
如无其他方法，可将组织标本低温冰冻后置-20℃保存，等待取来干冰后再贮藏和送往实验室。
将标本放入宽口保温瓶或以泡沫苯乙烯隔热的纸板盒内，再用冰充填，也可达到这一目的。
如果没有干冰，则可应用50%甘油;某些病毒在此种溶液中能比其他一些病毒存活更久。
将小块组织、粪或粘液装入小瓶内，再向瓶内注满50%甘油，并贮存于6℃。
组织标本应以无菌器械在无菌条件下采取。
如果想要了解组织中的病毒分布，则必须应用分开的器械采取每个组织。
经常应用紧盖的灭菌旋帽瓶子贮存可疑的组织和液体。
病毒学研究中的实验技术
病毒学研究中的实验技术病毒学是研究病毒性疾病的科学。
病毒性疾病的病原体是病毒，而病毒无法自行进行代谢活动，必须寄生在宿主细胞内完成其生命活动，因此病毒性疾病是难以治愈的。
病毒学家通过从分子层面研究病毒的结构、生命周期和致病机制等方面，探究病毒感染机制和防治策略。
但是病毒性疾病的研究需要大量的实验技术支持，下面介绍一些病毒学研究中常用的实验技术。
一、细胞培养技术病毒感染的第一步是入侵宿主细胞，因此病毒学研究中不可避免地涉及到细胞培养技术。
细胞培养技术是把生物组织或细胞通过培养基、营养物质等条件模拟人体内环境来培育或生长。
常用的细胞培养技术包括原代细胞培养、细胞系培养和三维细胞培养。
原代细胞培养是将组织切碎后通过酶的作用将细胞分离培养，有原始细胞的特点；细胞系培养是通过连续传代保留的一种相同的细胞群体，细胞系一般在细胞数目增高到一定阶段会停滞不生长，从而要定期传代；三维细胞培养则是将细胞以3D结构的形式培养，可以模拟更接近真实环境的细胞生长。
二、病毒制备技术病毒制备技术是研究病毒性疾病的基础。
制备好的病毒才能在实验中进行感染、药物筛选等研究。
病毒制备技术不同于普通的细胞培养技术，主要包括以下步骤：选择适宜的病毒感染细胞、制备病毒原液、病毒上清的浓缩、纯化和滤过等。
在实际制备中，还需要时刻注意环境卫生和安全控制等因素，保证实验和研究的可行性和可靠性。
三、病毒感染实验技术病毒感染实验技术是研究病毒性疾病的核心。
病毒感染实验技术主要包括病毒感染模型建立、病毒感染实验的设计、病毒感染后的分析与诊断等。
在病毒感染实验中，常常使用到Green Fluorescent Protein (GFP)、Luciferase、β-galactosidase等荧光物质和化学指标来评估病毒感染情况和细胞的生长状态。
此外，病毒感染实验中还会运用到PCR、Western blot等分子和蛋白质分析技术来探究感染机制和影响。
四、病毒抗原与抗体的检测技术病毒的抗原与抗体检测是病毒学研究的重要环节。
病毒学中的基本概念与实验方法
病毒学中的基本概念与实验方法病毒学是研究病毒的学科，涉及病毒结构、生命周期、传播方式、病毒与宿主细胞的相互作用等方面。
病毒学对于预防和治疗病毒感染疾病具有重要的意义。
本文将着重介绍病毒学中的基本概念与实验方法。
一、病毒的基本概念病毒是一种非细胞生物，由核酸和蛋白质两部分组成。
病毒依赖于宿主细胞复制，并利用宿主细胞的资源为自己的生存繁殖提供能量和物质。
病毒可以感染所有的生命体，包括细菌、真菌、动物和植物等。
病毒通常以一定的方式传播，如空气传播、食物传播、血液传播等。
不同的病毒在宿主体内的扩散和繁殖方式不同，病毒的致病性也不同。
有些病毒可以引起轻微的疾病，而有些病毒可以导致严重甚至致命的疾病，如HIV、流感、乙肝等。
二、病毒的实验研究方法1、细胞培养技术病毒的寄生乃至其复制均发生在宿主细胞内，因此细胞培养技术是病毒研究的基础。
细胞培养技术是将组织细胞按一定的条件培养起来，便于观察和实验。
目前细胞培养技术已经非常成熟，研究者可以通过不同的培养方式获得无数的活细胞，便于进行病毒的研究。
2、病毒分离技术病毒分离技术是指通过某种方式将已感染宿主的病毒分离出来。
病毒分离技术可以帮助确定病毒的种类和性质，为研究病毒的特性提供了基础。
目前病毒分离技术包括细胞接种、动物试验、从环境中筛选等多种方法，其中细胞接种法是应用最为广泛的一种方法。
3、病毒标记技术病毒标记技术是指将一种化合物或标记物分别加入病毒或宿主细胞中，以便观察病毒的生命周期、传播方式及与宿主细胞的相互作用等。
目前常用的病毒标记技术有许多，如放射性同位素标记、荧光标记、荧光素酶标记等。
4、ELISA技术ELISA技术是一种检测技术，可以检测在宿主体内的病毒和病毒感染者的抗体水平。
ELISA技术的原理是将待检样品与特异性抗体或抗原结合，并利用特定的酶光医学物质将酶与蛋白质结合，以获得可见化的信号。
ELISA技术可以研究病毒在生命周期中不同时间点，感染细胞的后续反应，以及细胞道路中的途径和互作。
病毒技术实验报告
病毒技术实验报告引言近年来，随着信息技术的快速发展，病毒技术也逐渐成为网络安全领域的研究热点之一。
通过对病毒技术的深入研究，可以加强对现有病毒的分析和防范能力，提高网络安全的水平。
本实验旨在通过深入了解和实践病毒技术，以期对病毒的工作原理、传播途径和防御方法有更全面的认识。
实验目的1.了解病毒的工作原理和分类；2.学习病毒的传播方式和繁殖特性；3.掌握病毒的防御方法和安全措施。
实验步骤1. 病毒的工作原理病毒作为一种恶意软件，其主要功能是通过自我复制和传播感染目标计算机系统，给系统带来破坏和损失。
病毒的工作原理可以分为以下几个步骤：•感染阶段：病毒会通过感染病毒携带者（例如邮件附件、下载文件等）进入目标系统，并在系统中寻找可感染的目标文件；•激活阶段：病毒感染目标文件后，等待触发激活条件，例如特定的日期、时间等；•执行阶段：一旦激活条件满足，病毒会开始执行其恶意功能，例如删除文件、传播自身等。
2. 病毒的分类根据病毒的传播方式和破坏程度，病毒可以分为以下几类：•文件病毒：通过感染可执行文件或系统文件来传播，例如EXE、DLL 等；•宏病毒：通过感染办公软件中的宏来传播，例如Word、Excel等；•蠕虫病毒：通过网络传播，自我复制和传播，例如蠕虫病毒可以通过电子邮件、文件共享等途径感染目标系统；•特洛伊木马：外表看起来正常或有吸引力的程序，但在运行时会执行恶意功能；•广告病毒：通过在用户浏览器中显示广告来获取经济利益。
3. 病毒的传播途径和繁殖特性病毒的传播途径主要有以下几种：•邮件附件：病毒常通过电子邮件附件传播，用户在打开或下载附件时可能被感染；•下载文件：用户在下载可疑的文件时可能会下载并运行病毒；•移动存储设备：病毒可以通过USB闪存驱动器等移动存储设备传播；•网络共享：病毒可以通过共享文件夹在局域网内传播。
病毒的繁殖特性也不尽相同，有的病毒具有自我复制和传播的能力，有的病毒则需要依靠人工操作来传播。
病毒学实验
实验一病毒对细胞的感染目的：病毒对细胞的感染具有高度的特异性，通过该实验掌握病毒感染细胞的实验操作，并进一步理解病毒对宿主细胞的选择性。
材料：杆状病毒Sf9细胞器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器步骤：1、感染前12h传代接种Sf9细胞，28℃培养至汇聚度约70%；2、弃细胞培养液，并以1×PBS洗涤2-3次，吸干残夜；3、加入适量病毒悬液，并补充适量无血清培养基，28℃孵育2h，更换适量新鲜培养基；同时设立空白对照；4、28℃培养24-48h，对照观察细胞病变。
实验二病毒的扩增与收集目的：病毒属于严格细胞内寄生生物，故只能在其敏感宿主细胞内进行有效增殖。
通过该实验掌握病毒的扩增及收集、储存方法。
材料：杆状病毒Sf9细胞器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器、低温高速离心机、离心管，滤器步骤：1、感染前12h传代接种Sf9细胞，28℃培养至汇聚度约70%；2、弃细胞培养液，并以1×PBS洗涤2-3次，吸干残夜；3、加入适量病毒悬液，并补充适量无血清培养基，28℃孵育2h，更换适量新鲜培养基；4、28℃培养24-36h，观察细胞裂解情况；5、吹吸细胞，并转移细胞裂解物至无菌冰预冷离心管；6、4℃，12000rpm,10min，取上清；7、滤器过滤上清，取滤液，分装于无菌冻存管，避光保存于4℃或-20℃或-80℃.实验三病毒的敏感性测定目的：不同类型的病毒对不同理化因子的敏感性存在着显著差异。
本实验拟检测杆状病毒对高温及有机溶剂的敏感性，以加深对病毒理化因子敏感性差异的理解。
材料：杆状病毒Sf9细胞乙醚氯仿器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器，水浴锅步骤：1、氯仿预处理：于一定量病毒悬液中加入终浓度为5%的氯仿，混匀，4℃静置1h，2000rpm，10min，取上清备用；同样，取等量病毒不加氯仿于4℃同样处理备用（空白对照）；2、乙醚预处理：于一定量病毒悬液中加入终浓度为20%的乙醚，混匀，4℃静置1h，2000rpm，10min，取下层备用；同样，取等量病毒不加乙醚于4℃同样处理备用（空白对照）；3、高温预处理：取一定量病毒悬液于55℃处理30min后备用；同样，取等量病毒于4℃处理30min备用（空白对照）；4、分别取适量经氯仿、乙醚、高温处理及未处理的病毒悬液感染Sf9细胞；5、28℃培养24-48h，对照观察细胞感染效率。
常规病毒学实验技术
常规病毒学实验技术常规病毒学实验技术（⼀）病毒的培养实验动物：家兔、⼩⽩⿏、⼤⽩⿏、豚⿏、仓⿏主要⽤于：①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒②培养病毒，制造抗原和疫苗③测定各毒株之间的抗原关系，（⽤实验动物作中和试验和交叉保护实验）④制备免疫⾎清和单克隆抗体⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒⼒测定、建⽴病毒病动物模型等注意：选择对⽬的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。
鸡胚（⼀）条件要求SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。
新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。
（⼆）优点组织分化程度低，可选择不同的⽇龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有⼤量病毒，容易采集和处理，⽽且来源充⾜，设备和操作简便易⾏。
（三）接种途径1．绒⽑尿囊膜接种（10-12⽇龄鸡胚）主要⽤于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。
1）⽅法⼀（造⼈⼯⽓室）①在胚胎附近近⽓室处，选择⾎管较少的部位，⽤电烙器在卵壳上烙⼀个直径约3-4mm的烤焦圈。
②⽤碘酊和酒精消毒后，⼩⼼⽤⼑尖撬起卵壳，造成卵窗。
③在⽓室端中央钻⼀个⼩孔。
④⽤针尖挑破卵窗中⼼的壳膜，切勿损伤其下的绒⽑尿囊膜。
⑤滴加滴⽣理盐⽔于刺破处，⽤橡⽪乳头紧贴于⽓室中央⼩孔上吸⽓，造成⽓室内负压，使卵窗部位的绒⽑尿囊膜下陷⽽形成⼈⼯⽓室，此时可见滴于壳膜上的⽣理盐⽔迅速渗⼊。
⑥⽤1ml注射器滴⼊2-3滴接种物于绒⽑尿囊膜上。
⑦⽤透明胶纸封住卵窗，或⽤玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的⽯蜡密封，⽓室中央的⼩孔⽤⽯蜡密封。
⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
2）⽅法⼆①在⽓室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的⼝。
②⽤灭菌眼科镊⼦撕去⼀⼩⽚内壳膜。
③滴⼊接种物。
④⽤透明胶纸封闭开⼝。
2．尿囊腔接种（10-11⽇龄）⽤于正粘病毒和副粘病毒（NDV）1）画出⽓室和胚位2）在⽓室接近胚位处涂沫碘酊和酒精消毒3）⽤钢锥穿⼀⼩孔4）将注射器针头沿此⼩孔插⼊0.5-1cm，注⼊接种物5）⽤⽯蜡封⼝，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次3．卵黄囊接种（6-8⽇龄）主要⽤⾍媒病毒以及鹦鹉热⾐原体和⽴克次⽒体等的分离和增殖。
病毒学研究中的重要技术方法
病毒学研究中的重要技术方法病毒学是对病毒进行研究和控制的学科，其研究范围涉及病毒的结构、生物学特性、病理学、免疫学、疫苗与治疗的研究、流行病学调查等多个方面。
为了更好地进行病毒学研究，科学家们不断创新并发展出了许多重要的技术方法。
本文将介绍其中几个重要技术方法。
1. 病毒培养技术病毒培养技术是研究病毒生物学特性、病理学和制备疫苗等研究领域必不可少的技术。
其主要通过在宿主细胞中进行体外培养来进行。
常用的宿主细胞有鸡胚、哺乳动物细胞以及昆虫细胞等。
其中，哺乳动物细胞培养技术在研究人类病毒方面具有极大的应用价值。
通过病毒培养技术，病毒生长繁殖的规律以及影响其繁殖的各种因素都可以研究和控制。
一些病毒在宿主细胞中生长繁殖的特性也可以通过病毒培养技术进行研究。
因此，病毒培养技术是病毒学研究的重要基础技术。
2. 病毒检测技术病毒检测技术是对病毒进行检测和诊断的重要技术。
目前常用的病毒检测技术主要包括免疫学方法、分子生物学方法及电子显微镜技术等。
在病毒学研究中，不论是对研究病毒引起的疾病的发病机理还是对病毒流行病学进行研究，都需要采用病毒检测技术。
3. 病毒分离技术病毒分离技术是病毒学研究中非常重要的技术。
它主要通过对病人样品、动物组织或者其它环境样品进行分离和纯化，从中分离出病毒。
此外，病毒分离技术还可以用于评估疫苗的效力以及研究病毒变异的规律性。
通常的病毒分离技术主要包括细胞传代法、小鼠传代法、囊泡传代法、鸡卵传代法以及临床样品直接分离法等。
在现代病毒学中，主要采用的是细胞传代法。
4. 基因芯片技术近年来，基因芯片技术在病毒学研究中的应用越来越广泛。
这项技术主要基于生物芯片技术、分子生物学技术和计算机技术等。
它将许多基因片段集合在一起制成芯片，通过对样品核酸的杂交实验可以检测到基因相应片段与芯片上的匹配。
基因芯片技术在病毒感染后机体免疫应答、病毒基因特征、宿主基因不同表达情况等方面提供了全面的信息。
因此，基因芯片技术在病毒学研究中扮演着越来越重要的角色。
第五章 病毒学检验基本技术
第五章病毒学检验基本技术第一节病毒的形态结构和化学组成病毒（Virus）是超显微的、无细胞结构的、只含一种核酸(或DNA或RNA)、只能在活细胞内存活的寄生物。
病毒在活细胞外以病毒粒子的形式存在，不能进行代谢和繁殖，不具有生命特征，但一旦进入宿主细胞就具有生命特征。
一病毒的形态大小（一）病毒的形态病毒一般呈球形或杆形，也有呈卵圆形、砖形、丝状和蝌蚪状。
动物病毒多呈球形、卵圆形或砖形，如腺病毒为球状，痘病毒为砖形；植物病毒多呈杆形或丝状，少数为球状，如烟草花叶病毒为丝状，苜蓿花叶病毒为杆状，花椰菜花叶病毒为球状。
细菌病毒即噬菌体多为蝌蚪状，也有为球状和丝状，如大肠杆菌偶数T噬菌体系列为蝌蚪状，大肠杆菌噬菌体fd为丝状（图5-1）。
图5-1 病毒的形态（二）病毒的大小病毒非常微小，以纳米（nm）表示。
较大的痘病毒直径约为300nm，较小的口蹄疫病毒颗粒直径为10～22nm。
二病毒的结构和化学组成及其功能病毒粒子(virion)是指一个结构和功能完整的病毒颗粒。
病毒粒子主要由核酸和蛋白质组成。
核酸位于病毒粒子的中心，构成了病毒的核心或基因组 (genome)，蛋白质包围在核心周围，构成了病毒粒子的衣壳(capsid) 。
核酸和壳体合称为核衣壳(nucleocapsid) ( 见图5-2)。
最简单的病毒就是裸露的核衣壳。
病毒形状往往是由于组成外壳蛋白的亚单位种类不同而致。
此外，在某些病毒的核衣壳外，还有一层囊膜(envelope)结构。
1 核酸核酸是组成各种病毒的核心。
一种病毒只含有一种类型的核酸,即DNA或RNA。
核酸可以是单股的，也可能是双股的；可以是线状的，也可以是环状的。
大多数病毒粒子中只含有一个核酸分子。
少数RNA病毒含两个或两个以上的核酸分子，而且各个分子担负着不同的遗传功能，它们一起构成病毒的基因组，所以这些 RNA 病毒为双组分基因组、三组分基因组或多组分基因组。
病毒核酸(即病毒基因组)储存着病毒的遗传信息，控制着其遗传变异、增殖和对宿主的感染性等。
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常规病毒学实验技术（一）病毒的培养实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠主要用于：①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒②培养病毒，制造抗原和疫苗③测定各毒株之间的抗原关系，（用实验动物作中和试验和交叉保护实验）④制备免疫血清和单克隆抗体⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。
鸡胚（一）条件要求SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。
新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。
（二）优点组织分化程度低，可选择不同的日龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。
（三）接种途径1．绒毛尿囊膜接种（10-12日龄鸡胚）主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。
1）方法一（造人工气室）①在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的烤焦圈。
②用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。
③在气室端中央钻一个小孔。
④用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。
⑤滴加滴生理盐水于刺破处，用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。
⑥用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。
⑦用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用石蜡密封。
⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
2）方法二①在气室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的口。
②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。
③滴入接种物。
④用透明胶纸封闭开口。
2．尿囊腔接种（10-11日龄）用于正粘病毒和副粘病毒（NDV）1）画出气室和胚位2）在气室接近胚位处涂沫碘酊和酒精消毒3）用钢锥穿一小孔4）将注射器针头沿此小孔插入0.5-1cm，注入接种物5）用石蜡封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次3．卵黄囊接种（6-8日龄）主要用虫媒病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。
1）画出气室和胚位2）垂直放置在卵座上，用碘酊和酒精消毒气室外端3）以钢锥在气室中央锥一小孔4）将注射器针头沿此小孔插入3cm，注入接种物5）用石蜡封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次4．其它接种途径羊膜腔接种，正粘病毒和副粘病毒静脉接种，蓝舌病毒脑内接种，狂犬病毒组织培养原代细胞：应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液，适当洗涤以后，加入营养液，通常即可使其贴附于玻璃壁上，并生长增殖。
继代细胞：将原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来再作培养。
传代细胞：由于遗传突变或者在理化学物质和致瘤病毒的作用下，组织培养细胞中有时出现恶性变细胞，也就是癌变细胞，这种病变细胞具有很高的增殖势能，而且几乎可以无限地传代。
原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）1）在无菌条件下采取9-10日龄鸡胚，置灭菌平皿中，除去头（或仅除去喙和眼）、爪和内脏，并剪成块。
2）用Hanks液，充分冲洗后移入大号青霉素瓶或其它广口瓶中，用眼科剪剪成1mm3大小的碎块。
3）加入Hanks液，充分冲洗，并静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加洗液。
如此反复冲洗2-3遍。
4）于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶，并调整pH至7.6-7.8，振荡混匀后置37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次。
5）取出，小心吸弃上层胰酶溶液，用洗液轻洗2次后，用大口径吸管反复吹打，使细胞游离。
6）用双层或三层纱布过滤，收集滤液于离心管中，以600rpm离心沉淀5-10min，吸弃上清液，按每个鸡胚5ml的量，加入营养液，并用吸管反复吹打，直至形成均匀的细胞悬液。
7）细胞计数（培养时，使细胞达到5×105个/ml）取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫——构椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10分钟，充分振荡后进行计数。
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。
每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。
传代细胞系培养优点：1)可以无限的传代。
2)不少细胞系对病毒很敏感。
3)某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。
4)生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。
缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。
细胞分散剂1．胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2．乙二胺四乙酸二钠（EDTA）营养液1．人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2．血清1）动物血清中含有细胞生长所必须的各种营养因子。
2）促进细胞的贴壁和生长。
3）具有很强的酸碱缓冲作用。
（二）病毒感染力的滴定LD50，EID50，TCID50（TCID50的测定）1．在青霉素瓶中将病毒作连续10倍的稀释，从10-1—10-10。
2．将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度作8孔，每孔接种100ul。
3．然后在每孔加入细胞悬液100ul，使细胞量达到3×105个/ml。
4．设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
5．逐日观察并纪录结果，一般需要观察5-7天。
6．结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。
TCID50的计算方法：高于50%的百分数-50% 91.6-50距离比例= = =0.8高于50%的百分数-低于50%的百分数 91.6-40lgTCID50=距离此例X稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数=0.8×(-1)+(-3)=-3.8TCID50=10-3.82. Karber法病毒液稀释度出现CPE孔的比率10-1 8/8=110-2 8/8=110-3 7/8=0.87510-4 3/8=0.37510-5 1/8=0.12510-6 0/8=0lgTCID50=L-d(s-0.5)L: 最高稀释度的对数D：稀释度对数之间的差S：阳性孔比率总和lgTCID50=-1-（-1）×(3.375-0.5)=-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml（三）病毒中和试验一、原理抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使后者丧失感染能力。
二、用途1. 疾病诊断。
2. 病毒分离株的鉴定。
3. 不同病毒株的抗原关系研究。
4. 疫苗免疫原性的评价。
5. 免疫血清的质量评价。
6. 测定实验动物血清中是否存在抗体等。
三、分类（一）终点法中和试验1. 固定病毒——稀释血清法。
1) 将测好TCID50的病毒稀释成200个TCID50的病毒悬液。
2) 在96孔微量培养板中将血清作连续倍比稀释（具体方法是在96孔板中先加入50ul生长液，再加50ul待检血清，混匀后，吸50ul至下一孔，如此下去。
一直到1:256），每个稀释度作4孔。
3) 在上述各孔内加入50ul稀释好的病毒液，混匀后放入37℃5%CO2培养箱中作用45min-60min。
4) 同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照。
5) 感作完成后每孔加入100ul细胞悬液，放37℃5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果。
6) 结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。
Reed-Muench计算方法：血清稀释度CPE孔数无CPE孔数累计CPE孔数无CPE孔数保护率（%）1:4（10-0.6）0 4 0 9 1001:16（10-1.2） 1 3 1 5 831:64（10-1.8） 2 2 3 2 401:256（10-2.4） 4 0 7 0 01:1024（10-3.0） 4 0 11 0 0高于50%的保护率-50%距离比例=高于50%的保护率—低于50%的保护率83-50= = 0.783-40高于50%的保护率血清稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数=-1.2+0.77×(-0.6)=-1.66-1.66的反对数=1/46即：1:46稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE。
2. 固定血清——稀释病毒法。
1) 将病毒作连续10倍稀释1）将稀释好的病毒接种96孔板，每个稀释度接种一纵排共8孔，每孔50μl，做两块板子，在一块板子的每孔加入50μl待检血清（试验组），另一块板子的每孔加入50μl正常血清（对照组），混合后置37℃ 5%CO2培养箱作用1h。
2）然后在每孔中加入100μl细胞。
3）另外还设两纵排正常细胞对照。
4）置37℃ 5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果。
5）分别计算每组病毒的TCID50，然后计算血清的中和指数。
试验组TCID50中和指数=对照组TCID50(二) 蚀斑（痘斑）减数试验1、蚀斑技术病毒蚀斑：又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。
原理：将病毒悬液作连续的10倍稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂糖，待其出现蚀斑后计数，即可算出每毫升病毒悬液中所含的蚀斑单位。
用途：①用于病毒纯化；②测定病毒悬液中感染病毒的含量。
2、蚀斑减数试验将病毒——正常血清混合物以及病毒——待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定，比较病毒——正常血清组和病毒——待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。
以试验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。
(三) 交叉保护试验先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。
其缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。
用途：（1）应用已知V鉴定未知V（2）应用已知免疫血清鉴定未知V（3）应用已知V鉴定未知血清（四）病毒的分离和鉴定病毒材料的注备1．脑、肝、肌肉等器官或组织充分研磨后加入5倍量的Hank’s液（内含P.S各200V/ml）反复冻融三次。
2000rpm 10min，取上清作接种物。
2．鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物用内含青、链霉素100u/ml的Hank’s液，将其稀释3-5倍，充分混匀悬浮后，置4℃冰箱内感作2-4h或过夜，200rpm 10min取上清作接种物。
3．咽喉拭子或鼻拭子仔细用棉拭子擦拭咽喉部，并迅速将其泡入盛有2-5ml Hank’s液的（200-500u/ml P.S）试管内，充分涮洗棉拭子，反复冻融3-5次，收集液体部分，2000rpm 10min，收集上清作接种物。