常规病毒学实验技术
常规病毒学实验技术
（一）病毒的培养
实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠
主要用于：
①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒
②培养病毒，制造抗原和疫苗
③测定各毒株之间的抗原关系，（用实验动物作中和试验和交叉保护实验）
④制备免疫血清和单克隆抗体
⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等
注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。
鸡胚
（一）条件要求
SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。
（二）优点
组织分化程度低，可选择不同的日龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。
（三）接种途径
1．绒毛尿囊膜接种（10-12日龄鸡胚）
主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。
1）方法一（造人工气室）
①在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的
烤焦圈。
②用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。
③在气室端中央钻一个小孔。
④用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。
⑤滴加滴生理盐水于刺破处，用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，
使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。
⑥用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。
⑦用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的
小孔用石蜡密封。
⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
2）方法二
①在气室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的口。
②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。
③滴入接种物。
④用透明胶纸封闭开口。
2．尿囊腔接种（10-11日龄）
用于正粘病毒和副粘病毒（NDV）
1）画出气室和胚位
2）在气室接近胚位处涂沫碘酊和酒精消毒
3）用钢锥穿一小孔
4）将注射器针头沿此小孔插入0.5-1cm，注入接种物
5）用石蜡封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次
3．卵黄囊接种（6-8日龄）
主要用虫媒病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。
1）画出气室和胚位
2）垂直放置在卵座上，用碘酊和酒精消毒气室外端
3）以钢锥在气室中央锥一小孔
4）将注射器针头沿此小孔插入3cm，注入接种物
5）用石蜡封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次
4．其它接种途径
羊膜腔接种，正粘病毒和副粘病毒
静脉接种，蓝舌病毒
脑内接种，狂犬病毒
组织培养
原代细胞：应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液，适当洗涤以后，加入营养液，通常即可使其贴附于玻璃壁上，并生长增殖。
继代细胞：将原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来再作培养。
传代细胞：由于遗传突变或者在理化学物质和致瘤病毒的作用下，组织培养细胞中有时出现恶性变细胞，也就是癌变细胞，这种病变细胞具有很高的增殖势能，而且几乎
可以无限地传代。
原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）
1）在无菌条件下采取9-10日龄鸡胚，置灭菌平皿中，除去头（或仅除去喙和眼）、爪和内脏，并剪成块。
2）用Hanks液，充分冲洗后移入大号青霉素瓶或其它广口瓶中，用眼科剪剪成1mm3大小的碎块。
3）加入Hanks液，充分冲洗，并静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加洗液。
如此反复冲洗2-3遍。
4）于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶，并调整pH至7.6-7.8，振荡混匀后置37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次。
5）取出，小心吸弃上层胰酶溶液，用洗液轻洗2次后，用大口径吸管反复吹打，使细胞游离。
6）用双层或三层纱布过滤，收集滤液于离心管中，以600rpm离心沉淀5-10min，吸弃上清液，按每个鸡胚5ml的量，加入营养液，并用吸管反复吹打，直至形成均匀的细胞悬液。7）细胞计数（培养时，使细胞达到5×105个/ml）
取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫——构椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10分钟，充分振荡后进行计数。
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。
传代细胞系培养
优点：1)可以无限的传代。
2)不少细胞系对病毒很敏感。
3)某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。
4)生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。
缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。
细胞分散剂
1．胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2．乙二胺四乙酸二钠（EDTA）
营养液
1．人工综合营养液
氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2．血清
1）动物血清中含有细胞生长所必须的各种营养因子。
2）促进细胞的贴壁和生长。
3）具有很强的酸碱缓冲作用。
（二）病毒感染力的滴定
LD50，EID50，TCID50
（TCID50的测定）
1．在青霉素瓶中将病毒作连续10倍的稀释，从10-1—10-10。
2．将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度作8孔，每孔接种100ul。3．然后在每孔加入细胞悬液100ul，使细胞量达到3×105个/ml。
4．设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
5．逐日观察并纪录结果，一般需要观察5-7天。
6．结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。
TCID50的计算方法：
高于50%的百分数-50% 91.6-50
距离比例= = =0.8
高于50%的百分数-低于50%的百分数 91.6-40
lgTCID50=距离此例X稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数
=0.8×(-1)+(-3)=-3.8
TCID50=10-3.8
2. Karber法
病毒液稀释度出现CPE孔的比率
10-1 8/8=1
10-2 8/8=1
10-3 7/8=0.875
10-4 3/8=0.375
10-5 1/8=0.125
10-6 0/8=0
lgTCID50=L-d(s-0.5)
L: 最高稀释度的对数
D：稀释度对数之间的差
S：阳性孔比率总和
lgTCID50=-1-（-1）×(3.375-0.5)
=-3.875
TCID50=10-3.875/0.1ml
（三）病毒中和试验
一、原理
抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使后者丧失感染能力。
二、用途
1. 疾病诊断。
2. 病毒分离株的鉴定。
3. 不同病毒株的抗原关系研究。
4. 疫苗免疫原性的评价。
5. 免疫血清的质量评价。
6. 测定实验动物血清中是否存在抗体等。
三、分类
（一）终点法中和试验
1. 固定病毒——稀释血清法。
1) 将测好TCID50的病毒稀释成200个TCID50的病毒悬液。
2) 在96孔微量培养板中将血清作连续倍比稀释（具体方法是在96孔板中先加入50ul生
长液，再加50ul待检血清，混匀后，吸50ul至下一孔，如此下去。一直到1:256），每个稀释度作4孔。
3) 在上述各孔内加入50ul稀释好的病毒液，混匀后放入37℃5%CO2培养箱中作用
45min-60min。
4) 同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照。
5) 感作完成后每孔加入100ul细胞悬液，放37℃5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结
果。
6) 结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。
Reed-Muench计算方法：
血清稀释度CPE孔数无CPE孔数
累计
CPE孔数无CPE孔数保护率（%）
1:4（10-0.6）0 4 0 9 100
1:16（10-1.2） 1 3 1 5 83
1:64（10-1.8） 2 2 3 2 40
1:256（10-2.4） 4 0 7 0 0
1:1024（10-3.0） 4 0 11 0 0
高于50%的保护率-50%
距离比例=
高于50%的保护率—低于50%的保护率
83-50
= = 0.7
83-40
高于50%的保护率血清稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数
=-1.2+0.77×(-0.6)
=-1.66
-1.66的反对数=1/46
即：1:46稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE。
2. 固定血清——稀释病毒法。
1) 将病毒作连续10倍稀释
1）将稀释好的病毒接种96孔板，每个稀释度接种一纵排共8孔，每孔50μl，做两块板子，在一块板子的每孔加入50μl待检血清（试验组），另一块板子的每孔加入50μl正常血清（对照组），混合后置37℃ 5%CO2培养箱作用1h。
2）然后在每孔中加入100μl细胞。
3）另外还设两纵排正常细胞对照。
4）置37℃ 5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果。
5）分别计算每组病毒的TCID50，然后计算血清的中和指数。
试验组TCID50
中和指数=
对照组TCID50
(二) 蚀斑（痘斑）减数试验
1、蚀斑技术
病毒蚀斑：又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。
原理：将病毒悬液作连续的10倍稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂糖，待其出现蚀斑后计数，即可算出每毫升病毒悬液中所含的蚀斑单位。
用途：①用于病毒纯化；②测定病毒悬液中感染病毒的含量。
2、蚀斑减数试验
将病毒——正常血清混合物以及病毒——待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定，比较病毒——正常血清组和病毒——待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。以试验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。
(三) 交叉保护试验
先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。其缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。用途：（1）应用已知V鉴定未知V
（2）应用已知免疫血清鉴定未知V
（3）应用已知V鉴定未知血清
（四）病毒的分离和鉴定
病毒材料的注备
1．脑、肝、肌肉等器官或组织
充分研磨后加入5倍量的Hank’s液（内含P.S各200V/ml）反复冻融三次。2000rpm 10min，取上清作接种物。
2．鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物
用内含青、链霉素100u/ml的Hank’s液，将其稀释3-5倍，充分混匀悬浮后，置4℃冰箱内感作2-4h或过夜，200rpm 10min取上清作接种物。
3．咽喉拭子或鼻拭子
仔细用棉拭子擦拭咽喉部，并迅速将其泡入盛有2-5ml Hank’s液的（200-500u/ml P.S）试管内，充分涮洗棉拭子，反复冻融3-5次，收集液体部分，2000rpm 10min，收集上清作接种物。
4．粪便
用含100u/ml P.S的Hank’s液作10-20倍稀释，4℃感作4h，2000rpm 10min取上清作接种物。
5．无菌的体液或鸡胚液
直接接种用。
接种方法
1．实验动物
2．鸡胚
目前常用鸡胚分离的病毒有正粘V、副粘V、痘V、脑炎V及引起禽类疫病的其它许多V。3．组织培养细胞。
病毒增殖的判定
1．细胞病变（CPE）
2．抗原的测定
3．中和试验
4．病毒间的干扰现象
乙型脑炎V 脊髓灰质炎V
流感V 西方马脑炎V
猪传染胃肠炎牛病毒性膜炎粘膜病V
5．电子显微镜观察
6．实验动物或鸡胚接种
病毒感染力的滴定
LD50、EID50、TCID50
病毒理化学特性的测定
1．病毒核酸型鉴定（药物抑制试验）
FUDR、IVDR、BRUDR
原理：FUDR、ICDR、BRUDR是嘧啶的卤化物，进入cell后发生磷酸化，掺入新合成的DNA 以代替胸腺嘧啶产生至功能分子，从而抑制DNA的合成。常用浓度为50ug/ml。2．脂溶剂敏感性试验
1）乙醚敏感试验
取同批病毒分装于两个青霉素瓶中，每瓶16ml，在其中1瓶加入麻醉用乙醚，使终浓度为20%，两瓶均用橡皮塞塞紧后，置4℃冻箱内作用24h，其间不时振荡，随后以2000rpm 离心20min。已加乙醚的小瓶，用毛细吸管吸取病毒液，移入另一小瓶内，适当吹打，使残余乙醚挥发殆尽，然后滴定两组病毒的TCID50。
2）氯仿敏感性试验
向病毒液内加入分析纯氯仿，使其终浓度为4.8%，置4℃振荡混合10min。随后500rpm 5min，然后吸取上层液体，滴定病毒TCID50。对照组病毒加入终浓度为4.8%的生理盐水，同样处理和滴定。
3．胰蛋白酶敏感试验
脊髓灰质炎V、猪传染性胃肠炎V对胰酶有较强的抵抗力，痘V、呼肠孤V、疱疹V易被胰酶灭活。取病毒液两瓶，每瓶1ml,在其中1瓶加入1ml 1%的trypsin，使终浓度为0.5%，另一瓶加入1ml 1640（培养基），用橡皮塞塞紧瓶口，将小瓶倒转几次，使其充分混合，置37℃1h，随即加入灭活犊牛血清8ml，充分混合，终止胰酶的作用。最后滴定两瓶V的TCID50。4．耐酸性试验
pH3.0 2h or pH5.0 1h
取等量病毒液两瓶，用0.1mol/L HCL将1个小瓶中的病毒液的pH调至3.0(or 5.0)，并在另一个小瓶内加入相同于用酸量的培养基作为对照，置37℃水溶或室温中感作2h(or 1h)，再用5.6%NaHCO3溶液将pH调回至7.2左右，对照组再加紧入相同于NaHCO3量的培养基，测定两者的TCID50。
5．耐热性试验
将病毒液分成等量的11小瓶，其中4小瓶分别置50℃、60℃、70℃、80℃水溶中1h，另6瓶置50℃水浴中分别感作5、10、15、30、60和180min，随后测定每瓶V的感染X。6．病毒粒子大小测定
1)电子显微镜直接观察（透射电镜、磷钨酸负染）
2)超速离心沉淀
3)滤过试验
取澄清的病毒液20ml，留出1ml作为对照，将剩余的19ml病毒液在正压下依次通过孔经为450nm、225nm、100nm和50nm的各级微孔，每通过一种孔径的滤膜就吸取1ml滤液用为样品，并将剩余的滤液通过一次滤膜。最后测定原病毒液以及各级滤液的TCID50。
病毒液种类 TCID50/0.1ml
滤前病毒液 10-6.75
450nm孔径液 10-6.23
225nm孔径液 10-5.78
100nm孔径液 10-4.50
50nm孔径液 10-0.50
免疫——血清学检查
目的：①新分离毒株的种类及型别的鉴定。
②检测发病动物体液中的Ab，或进一步比较动物急性发病期和恢复期血清中的Ab效价，了解病毒性Ab是否有明显的增长，从而判定V感染的存在。
（一）中和试验
1．终点法中和试验
固定病毒——稀释血清法中和试验
固定血清——稀释病毒法中和试验
2．蚀斑（痘斑）减数试验
1）蚀斑技术
病毒蚀斑，又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。
原理：将病毒悬液作连续的10倍稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂糖，待其出现蚀斑后计数，即可算出病毒悬液中每毫升所含的蚀斑单位。
用途：①用于病毒纯化；②测定病毒悬液中感染病毒的含量。
2）蚀斑减数试验
将病毒——正常血清混合物以及病毒——待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定，比较病毒——正常血清组和病毒——待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。以试验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。
3．交叉保护试验
先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。其缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。用途：（1）应用已知V鉴定未知V；
（2）应用已知免疫血清鉴定未知V；
（3）应用已知V鉴定未知血清。
（五）凝集试验
定义：
颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）或表面载有抗原的颗粒状的物质（如聚苯乙烯胶乳、
红细胞、炭素颗粒等），与相应抗体在电解质存在下凝集成团的试验。
分类
直接凝集试验：颗粒状Ag与相应Ab所发生的凝集反应。（布氏杆菌）
间接凝集试验（被动凝集试验）：可溶性抗原吸附到载体颗粒表面，与相应抗体所发生的凝集反应，可以证明相应抗体的存在并测定效价。反相问接凝集试验（反向被动凝集试验）：将抗体吸附到颗粒表面与相应抗原所发生的凝集反应。
间接血凝试验
胶乳凝集试验
炭凝集试验间接凝集试验
皂土凝集试验
脂质体凝集试验
间接凝集抑制试验：先将被检的抗体（或抗原）与已知的抗原（或抗体）作用后，再
与抗体（或抗原）致敏的颗粒时行反应。
反向凝集抑制试验
间接凝集试验的优点：快速、简便、特异、敏感
间接血凝试验（IHA）（PHA）
口蹄疫、猪瘟、弓形体、胸膜肺炎、衣原体
反向IHA：FMDV、水疱病病毒Ag、猪传染笥胃肠炎病毒Ag、小鹅瘟病毒Ag等。
红细胞作为载体的优点：
1．来源广泛，容易取得。
2．红细胞表面几乎可以吸附任何一类的Ag或Ab，如蛋白质、糖蛋白、核蛋白以及多糖等。3．具有天然的均一性，比其它许多载体都更容易标准化和规格化。
缺点：容易破裂、难于保存
IHA的优点：
①敏感性高、特异性强、重复性和稳定性好，操作简便、反应迅速。
②既可定性又可半定量，而且试剂价格低廉，不需要特殊、复杂的设备。
注意：影响红细胞凝集的因素很多：红细胞的来源，致敏条件、操作技术、标本中的杂质、细菌污染和类属Ag常引起非特异性凝集反应。
1．红细胞的选择和保存
选择：许多种类动物的红细胞，包括人的0型红细胞都可用，但用得最多的是绵羊红细胞。保存：用玻璃珠脱纤法采集或用肝素抗凝。
②无菌的红细胞在4℃冰箱中可保存3-4天。
②采血时加等量氏液和适量抗生素，4℃保存2周，但这样红细胞致敏时容液自凝。
2．红细胞的醛化
醛化剂：甲醛、戊二醛、丙酮醛、丙酮醛—甲醛双固定、戊二醛—丙酮醛双固定。
1）无菌采取绵羊静脉血，加至红细胞保存液内，4℃保存备用。
2）取红细胞悬液1份，加入10倍量0.1mol/L、PH7.2磷酸缓冲液（PH7.2PB），洗5遍，并以该液配成8%红细腻悬液。
3）红细胞悬液1份+3%丙酮醛液等量，24左右的室温中用电磁搅拌器缓慢搅拌17h。PH7.2PB 配成8%悬液，——丙酮醛固定红细胞悬液。
4）丙酮醛固定红细胞悬液1份+等量3%甲醛液，如上搅拌17hr。
5）再以PH7.2PB液洗5遍，最后用内含0.1%叠氮钠的ph7.2PB配成20%的红细胞悬液，分装后置4℃冰箱内保存，可用2个月—双醛化红细胞悬液。
3．红细胞的鞣化
作用：可增加红细胞吸附蛋白质的能力，新鲜红细胞用1：200000浓度的鞣酸，醛化红细胞用1：100000浓度的鞣酸。
程序：取红细胞，用PH7.2PB洗4—5遍，并用同液配成2.5%悬液，同时以PH7.2PB临时配制1：200000优质鞣酸，将其与红细胞悬液等量混合，37℃水浴咸作15min。取出后用ph7.2PB洗一次，再用PH7.2pB配成20%红细胞悬液。
4．致敏红细胞的制备：
1）抗体致敏红细胞
取20%鞣化或未鞣化的双醛化红细胞悬液1ml，离心沉淀，弃去上清液，将沉淀红细胞重新悬浮于0.1mol/L.PH3.5~4.0醋酸缓冲液10ml中，加入等量的提纯IgG液（每毫升需含IgG100~300g）置37℃水浴中咸作2-4h，每15-20分钏用吸管轻轻吹吸混合2-3次。以ph7.2PB 洗5遍，再将沉淀红细胞用1%灭活免血清盐水配成0.8%悬液备用。—— Ab致敏红细胞悬液。
2）抗原致敏红细胞
取PBS（PH6.4）4ml病毒抗原1ml，2.5%鞣酸化红细胞悬液1ml，混匀后，置室温下振荡结合30—60min（随病毒Ag种类不同）或37℃水浴30-45min，其间适当振摇。随后以1500rpm离心沉淀10min，并用2倍量的PH7.2PB(内含1%灭活兔血清)洗2遍后，配成1%的致敏红细胞悬液供试验用。以病毒致敏的红细胞悬液应立即使用。4℃冰箱保存，不宜超过2天。
※致敏红细胞的保存：用1%兔血清盐水或0.4%明胶缓冲液洗涤，并用其配成2.5%悬液保存备用。长期保存：用含1%糖和4%兔血清的生理盐水，将致敏红细胞配成10%悬液，然后于真空中冷冻干燥。
乳胶凝集试验
乳胶的预处理
取空白乳胶用PBS（PH7.4）配成2%溶液，加入10%的胰蛋白酶液，使其终浓度为1%，于56℃水溶作用18-24h，其间摇动几次，置4℃冰箱保存备用——使乳胶稳定并减少非特异性凝集。（离心上清，将沉淀用PBS悬浮配成2%乳胶溶液）
乳胶的致敏
1．将浓缩的病毒抗原作倍比稀释（PBS），加入等量的2%空白乳胶中（逐滴加入，边加边摇动）。37℃作用15-30min。
2．加入10%牛血清白蛋白，使终浓度为1%，混合均匀，37℃ 15-30nin，或2h，即得乳
胶抗原。
（六）标记抗体技术（免疫标记技术）
原理：抗体能追踪抗原，在抗原所在部位与之结合，一旦结合后就不易洗脱。但此种结合反应肉眼不易察出。有一些物质在超微量时，即能用某种特殊理化因素将其检测出来。如将这些构标记在抗原或抗体分子上，就能利用调换体与原特异结合的特性，检测抗原或抗体，即免疫标记技术。
荧光抗体技术（免疫荧光技术）
分类：酶标记抗体技术（免疫酶技术）
同位素标记抗体技术（放射免疫测定技术）
铁蛋白标记抗体技术
免疫荧光技术
基本方法和原理
1．直接法
将标记的特异荧光抗体，直接加在Ag标本上，经一定温度和时间的染色，用水洗去来参加反应的多余荧光抗体，室温干燥后封片，镜检。优点：方法简便，非特异荧光染色因素少。缺点：不够敏感，且一种标记抗体只能检测一种Ag。
2．间接法
既可检查抗体，也可检查抗原。
1）检查抗原
用已知未标记的特异抗体（一抗）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗体（二抗）与抗原标本反应，使之形成抗原一抗体——抗抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗抗体，干燥封片后镜检。
2）检查Ab
Ab标本为已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤同上。缺点：但特异性较差。可能是间接法的中间层可结合更多的标记抗体所致。优点：敏感性高，且标记一种抗体球蛋白抗体，可用于多种抗原，抗体系统的检查。既可检测Ag，也可检测Ab。
3．补体法
应用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体，鉴定未知Ag或未知Ab。先将未标记的Ab和补体加在Ag标本上，使其发生反应，随后再加标记抗体抗体，使之形成Ag— Ab —cb抗补体复合物。缺点：特异性较差。优点：敏感性高。标记一种抗体补体Ab，可用于各种Ag—Ab系统的检查（可用于各种动物）
间接法：双层法、混合法、三层法。补体法：抗体一抗补体法、异属补体结合法。涂片压印片、冰冻切片、石蜡切片、组织培养物、可溶性Ag标本（醋酸评维素膜）。
放射免疫测定技术
原理：用放射性同位素标记已知的Ab或Ag，用以检测被检材料中Ag 或Ab。随后根据Ag —Ab复合物中的同位素放射性强度进行定性或定量的测定。优点：敏感性和特异性都很强。缺点：射线污染。
分类和操作原理：
（一）液相放射免疫测定
1．直接法（Ag、Ab）
用放射性同位素标记病毒Ag或Ab。检测相应的Ab 或Ag。主要同于颗粒性物质，如悬浮细胞内病毒抗原的初步检测，检测Ag时，通过超速离心将Ag—Ab复合物沉淀下来，分别检测沉淀物和上清液中的放射性强度，检测Ab时，在Ab、Ag感作以后，再加入适当浓度（40-50%饱和度）的硫酸铵，叫Ag—Ab复合物盐析沉淀，而Ag仍处于溶解状态。
2．间接法（主要用于病毒抗体的检测）
被检血清+ Ag+二抗离心沉淀
3．竞争法（主要用于病毒抗原的检测）
被检抗原+标定浓度的特异抗体，混合咸作一定时间再加入标定量的放射性同位素标记抗原—离心沉淀。
（二）固相放射免疫测定（聚苯乙烯小管或微量滴定板上，或者用溴化氢、二醛等将Ab 偶联或共价联结于琼脂糖珠或纤维素等表面）
1．夹心法
Ab+待检Ag+标记Ab
2．夹心间接法，与上法相比，敏感性更强。
Ab包被+待检Ag+另一动物的抗病毒Ab+同位素标记的抗第二次Ab的抗抗体
3．竞争法
Ab包被+待检抗原+标记Ag
两者同时加入or待检Ag先加
4．阻断试验法
Ab包被+已知Ag+被检血清+同位素标记的Ab。
（三）放射免疫自显影
用同位素标记Ab or Ag，然后进行琼脂扩散试验或免疫电泳对流免疫电脉，检测相应的Ag or Ab。扩散或电泳完毕后，将琼脂板置于盐水和ddH2O中充分浸泡，除去未结合的标记Ab或Ag。干燥后，覆盖X光胶片，置暗室中曝光1-2天。经过显影和定影，即可在X光胶片上显示特异的沉淀线。
免疫酶技术
抗酶抗体法
放大抗体法：同时使用酶标记抗体和抗酶抗体
1．酶标记抗体法
1）直接法
用酶标记的特异性Ab，直接检测病毒或病毒Ag。在将含有uirus或virus Ag的组织和细胞标本固定的消除其中的内源性酶以后，应用酶标记Ab直接处理，随后滴加底物显色，直接镜检。
2）间接法
将含有V或V Ag的组织或细胞标本，先用特异性V Ab处理，充分涮洗后，再用酶标记的抗体处理，使其形成Ag-Ab-酶标记抗体复合物，最后滴加底物，镜检。
2．抗酶抗体法
不需进行酶的标记，比前都简便和灵敏
1）免疫球蛋白桥法
搭桥：用二抗（如抗兔IgG的抗体）将抗体和已结合在病毒抗原上的同种动物（兔）特异性Ab连接起来。
加酶，形成Ag+Ab+抗抗体+抗酶抗体+酶加底物显色、镜检。
2）可溶性酶——抗酶复合物法（PAP）
3）杂交抗体法
将来自同种动物的抗IgG抗体（或其Fab碎片）与抗酶抗体（或其Fab碎片）结合起来，使之成为一种具有抗IgG和抗酶双重活性的杂交抗体。再用这种杂交抗体进行免疫酶染色。Ag+Ab+杂交Ab+酶
（一）免疫酶测定法
固相免疫酶测定法：利用固相载体，以化学的或物理的方法将Ag或Ab联接于其上，制
成免疫吸附剂，随后进行免疫酶测定。
均相免疫酶测定法：不需将游离的和结合的酶标记物分离，也不需要载体，直接从溶液中测定结果。
1．固相免疫酶测定法
根据固相载体的种类和免疫吸附剂的制备方法。分为两类：、
1）酶联免疫吸附试验或测定法（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）。
①间接法，用Ag包被板子+Ab（未知）+抗Ab+酶底物显色
②双抗体夹心法，用于检测Ag。Ag+Ag（未知）+抗Ab+酶底物显色
③竞争法：（测定Ag）
利用酶标记Ag和未标记Ag共同竞争有限量的Ab，测定样品中的Ag。需同时微只加酶标记Ag的系统作对照。Ab+待检Ag和酶标记Ag（与可先加待检样品，稍后再加酶标记Ag）。对照组：只加酶标记Ag。
④夹心间接法
应用酶标记抗抗体测定Ag。Ab+Ag（待检）+不同种动物的同的Ab+酶标抗第二种抗体的动物球蛋白（二抗）
2）特定Ag基质球法（Defined antigen substrate sphere, DASS）
应用溴化氰活化的琼脂糖球作为固相载体，将Ag或Ab结合于其上，制成免疫吸附剂。2．均相酶免疫试验（酶放大免疫试验）
利用竞争原理，将含有小分子半Ag的样品，酶标半Ag及相应Ab混合感作，随后测定酶的活性。如果样品中主要用于激素、抗菌素和吗啡微生物等小分子半Ag的检测，没有半Ag，则酶标半Ag与Ab结合，酶的活性受到抑制。
ELISA的操作要领：
1．固相载体的选择
聚苯乙烯微量反应板
PVC塑料软板
硝酸纤维素膜，斑点——ELISA（Dot—ELISA）
疏水聚酯布，布——ELISA（C-ELISA）
2．预备试验
确定酶结合物、包被抗原或抗体的最适浓度，底物的最适反应时间。
1）酶结合物的确定
用PH9.6的碳的酸盐缓冲液将IgG稀释至100ug/ml,加入固相载体的每一孔中进行包被,洗涤后将酶结合物以1:200,1:400,1:800……作系列稀释,依次加入各孔,每一稀释度加2孔。反应完毕后加底物显色，以能产生光吸收值（A）为1.0的稀释度为结合物的最适浓度。2）包被蛋白质浓度的确定
将欲包被的蛋白质用PH9.6的碳酸盐缓冲液作1：10，1：20，1：40…….系列稀释，每一稀释度包被2个孔，然后进行常规的ELISA操作。以能产生光吸收值（A）为1.0的稀释度为包被蛋白质的最适浓度。
3）底物最适作用时间的测定
以最适稀释度Ag和酶结合物进行试验，加入底物后在不同时向终止反应，即可确定最适反应时间。
3．包被
1）载体
2）包被液的PH：通常用PH9.5~9.6,0.05mol.L or 0.1mol/L的碳酸盐缓冲液稀释Ag or Ab。
吸咐时的PH一般为9.0左右。如PH较低，则吸附时间延长，但PH低于6.0则非特异性吸附增加。
3）吸附时间与温度，一般为4℃过夜，有时也可采用37℃吸附1-5h。
4）蛋白质浓度，在固相载体上，每孔加入量一般为0.1-100us/ml。浓度太高，令固Ag或Ab蛋白分子之间的相互作用较大而影响载体对蛋白质的吸附，浓度太低，则感染性下降。4．洗涤，将载体各也甩干，再加洗涤充满各孔，静置3-7min如此重复3次。
常用的洗涤液：含有0.05%吐温-20，0.01mol/L PH7.4的PBS或含有0.05%吐温-20，
0.01mol/L PH7.4的Tris-cl。
5．封闭
抗原或抗体包被后，载体表面仍可能遗留有未吸附蛋白质的空白位点，从而造成下一步的非特异性吸附。
封闭液： 1%-3%牛血清白蛋白，3%-5%脱脂乳，10%牛或马血清加入封闭液后，37℃吸附2h，然后洗涤。
6．结果判定
1）目视比色法：定性
2）光电比色法：P/N比法，P/N值≥2.0为阳性
（七）聚合酶链反应（PCR）与疾病诊断聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是1985年Mallis等根据核酸自然扩增的原理，建立的一种人工体外扩增DNA技术，目前已广泛应用于病毒学研究及病毒病的诊断。
基本原理
PCR又称为体外酶促基因扩增，即在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下依赖于DNA聚合酶的体外扩增反应，其原理类似于天然DNA的复制。双链靶DNA分子变性后解链，两条单链DNA分别经复性与两条引物互补结合，在4种dNTP 存在和合适的条件下，由DNA聚合酶催化引物由5’――3’扩增延长，每经过变性、复性、延伸一个循环，模板DNA增加1倍，新合成的DNA链又可作为下一循环的模板，经过30-50个循环，可使原DNA量增加106-109倍。由于引物的序列决定了扩增的范围，而数十个循环，又使原DNA模板大量增加，因此，PCR具有特异、敏感等许多优点，适用于病毒性疾病的诊断。
主要步骤
PCR的每一个循环包括变性、复性、延伸3个步骤。
1）变性通过加热（90-95℃），使双链DNA模板的氢键断裂，双链解离成单链。
2）复性适当降温（42-62℃），使引物与其互补的模板在局部形成杂交DNA双链。
3）延伸72℃，在DNA聚合酶、4种脱氧核糖核苷酸底物及Mg+离子存在的条件下，引物延长，新链合成。
几种模板的处理方法
1. 细菌
挑细菌于离心管中，加适量ddH2O，涡悬，于沸水浴中变性10min，迅速置冰浴中，然
后3000rpm离心数秒，取上清作为模板。
2. 细胞培养物
收集病变的细胞（不要冻融）悬液，10000rpm离心数秒，取细胞沉淀用适量Sample Buffer 悬浮，加入蛋白酶K至终浓度为100μg/ml，于37℃温箱中作用1h，取出于沸水浴中变性10min,立即置冰浴中，3000rpm离心数秒,取上清作为模板。
Sample Buffer
终浓度
KCl 50mM
Tris-HCl(pH9.0) 10mM
MgCl2 1.5mM
明胶 0.01%
Triton X-100 0.1%
NP-40 0.45%
Tween 20 0.45%
3. 质粒、病毒基因组DNA
沸水浴中变性10min，迅速置冰浴上备用。
4.病料与鼻拭子
1)用匀浆器将病料组织充分匀浆，用TEN缓冲液按1:5进行稀释。
2)收集悬液于离心管内，-20℃反复冻融三次。
3)取出，5000rpm离心5min。
4)取472.5μl上清液于另一离心管中，加入25μl 10%的SDS(终浓度为0.5%)
和2.5μl 20mg/ml的蛋白酶K(终浓度为100μg/ml)，混匀。
5)50℃水浴过夜
6)用等体积(500μl)的苯酚:异戊醇、苯酚:氯仿:异戊醇、氯仿:异戊醇各抽提一次
7)吸取上清，加2倍体积的无水乙醇、0.1倍体积的3M NaAc于－20℃沉淀30min，
10000rpm离心10min。
8)沉淀用70%乙醇洗一次，真空抽干，用20μl ddH2O溶解，－20℃保存备用。
病毒学检验
《病毒学检验》课程教学大纲 一、课程基本信息 课程名称：病毒学检验（Experimental Virology） 课程编码： 课程类别: 必修课(专业课) 适用专业: 卫生检验学本科 开课学期: 第七学期 课程学时: 63学时（理论学时27，实验学时36） 课程学分：3.5 先修课程：医学寄生虫学及检验、细菌学检验、临床医学概要等 课程简介：病毒学检验是卫生检验重要的专业课程之一，是卫生检验课程体系的重要组成部分，也是卫生检验专业学生必修的考试课程。本课程通过课堂讲授、实验实习、网络自学等方式进行教学。注重培养学生综合性思维能力，重视学生自主学习、自觉学习，分析和解决实际问题能力，以及创新思维和能力的培养。 选用教材：李洪源、王志玉主编：《病毒学检验》，人民卫生出版社，第一版，2006年7月。 参考书: 1. 张朝武主编：《现代卫生检验》，第一版，人民卫生出版社，2005。 2. 李影林主编：《中华医学检验全书》，人民卫生出版社，1996。 3. 王秀茹主编：《预防医学微生物学及检验技术》，人民卫生出版社，2002。 4. 贾文祥主编：《医学微生物学》，四川大学出版社，2005年1月。 5. 李凡、刘星晶主编：《医学微生物学》，人民卫生出版社，第七版，2008年1月。 二、课程教育目标 通过学习，使学生知悉病毒学检验的基本技术和分子生物学技术，知悉 常见重要致病病毒。要求学生掌握病毒的分离培养方法、血清学实验及分子 生物学技术在病毒学检验中的应用；掌握常见重要致病病毒的生物学性状、 检验方法和预防医学意义。为学生能独立开展各种病毒学检验打下良好基 础。
三、理论教学内容与基本要求 绪论 （一）学时：0.5 （二）要求 【掌握】病毒的特性；病毒学检验的内容及其应用范围；病毒学检验的一般原则。 【熟悉】病毒学检验的质量控制；病毒学实验室的生物安全管理。 【了解】病毒学和病毒学检验的发展史。 第一篇病毒学检验技术 第一章细胞培养技术 （一）学时：1.5 （二）要求 【掌握】体外培养细胞的生物学特性；体外细胞培养的条件；组织培养的种类；细胞系和细胞株的概念；细胞培养方法；细胞培养中平衡盐、消化液和血清的作用；细胞检查方法；细胞的冻存。 【熟悉】用于病毒培养的细胞选择、细胞培养操作过程和细胞培养污染与监测。 【了解】细胞培养技术在病毒学研究中的发展；细胞系的鉴定。 第二章鸡胚接种技术 （一）学时：1.5 （二）要求 【掌握】鸡胚的结构；鸡胚的孵育与检查；接种途径与方法及其用途；病毒的检测；鸡胚接种技术的应用。 【熟悉】实验材料、器械与准备。 【了解】鸡胚的解剖与生理。 第三章动物实验技术 （一）学时：1.5 （二）要求 【掌握】实验动物的分类；普通动物、清洁动物、无特定病原体动物、无菌动物、悉生动物；近交系动物、封闭群动物、突变系动物、杂交群动物及其特点；常用实验动物种类及其品系；
医学细胞生物学实验的目的和任务
第一章绪论 （一）名词解释 1.细胞学 2.细胞生物学 3.医学细胞生物学 （二）填空题 1.细胞生物学是从、和三个水平上研究细胞生命活动的科学。 2.细胞是生物体和的基本单位。 3.细胞生物学的发展可分、、和四个阶段。 4.1841 年Remak在观察鸡胚的血细胞时，发现了细胞的分裂；其后Flemming在动物细胞中、Strasburger在植物细胞中发现了分裂。1883 年Van Beneden、1886 年Strasburger分别在动、植物细胞中发现了分裂。 5.1944 年Avery等在微生物的实验中证明了是遗传物质。 6.1953 年和共同提出了DNA 分子的结构模型。 7.1958 年Meselson等利用放射性同位素与梯度离心法，分析了DNA 的复制过程，证明了DNA 的复制是。 8.R.Feulgen于1924年发明了染色法，用于检测细胞核内的。 （三）选择题 1.最早发现细胞并对其命名的学者是 A. R.Hook B. Leeuwenhook C. R.Brown D. W .Flemming E . C.Darvin 2.细胞学说的创始人是 A.Watson and Crick B.Schleiden and Schwann C. W.Flemming D. R.Brown E. R.Hook and Leeuwenhook 3.在1855 年提出“一切细胞只能来自原来的细胞”论点的学者是 A.Remark B.W.Flemming C. R.Virehow D.R.Brown E. Schleiden
4.最早发现细胞直接分裂（无丝分裂）的学者是 A.W.Flemming B.Remark C. R.Virehow D.R.Brown E.Schwann 5.最早在动物细胞中发现间接分裂（有丝分裂）的学者是 A. Strasburger B. W.Flemming C. Remark D. Boveri E. Feulgen 6.最早在动物细胞中发现减数分裂的学者是 A. Van Beneden B. Strasburger C. Flemming D. Remark E. Boveri 7.Van Beneden和Boveri在1883年发现的细胞器是 A.线粒体 B.中心体 C.高尔基体 D.细胞核 E.纺锤体 8.Banda在1897年发现的细胞器是 A.中心体 B.线粒体 C.细胞核 D.高尔基体 E.纺锤体 9.最早提出染色体遗传理论的学者是 A.Schleiden and Schwann B.Watson and Crick C.R.Hook and Leeuwenhook D.Boveri and Sutton E. Van Beneden and Boveri 10.细胞遗传学的创始人是 A.Mendel B.Morgan C. Flemming D. Remark E. Feulgen 11.在1943 年应用高速离心机从活细胞中将细胞核和各种细胞器分离出来, 并研究其生理活性的学者是 A. Feulgen B. Brachet C. Casperson D. Cloude E. Ruska 12.在1924 年首创核染色反应，测定了细胞核内DNA的学者是 A. Cloude B. Brachet C. Feulgen
1生物学实验常用技术
生物学实验常用技术一、分子方面 1、基因工程 1)PCR (Polymerase Chain Reaction) (二楼PCR仪器全部会用) 2)RT-PCR;Q-PCR 3)琼脂糖凝胶电泳;胶回收 4)酶切/链接 5)转化 6)固体/液体LB培养基配制 (高压蒸汽灭菌锅使用方法) 7)质粒大/小抽原理及步骤 (手提、溶液I、II、III作用) 8)基因组DNA抽提 9)RNA提取; 2、蛋白质工程 1)蛋白收集 (蛋白裂解液+PMSF; 1×Loading 裂解(推荐)) 2)SDS-PAGE(电泳胶的配制) 2)考马斯亮蓝染色,银染 3)Western blot 4)蛋白定量常用的方法及原理, 以及熟练操作Bradford法蛋 白定量 (TRIZOL法原理、注意事项及步骤) 二、细胞方面 1)细胞培养、传代 2)细胞冻存与复苏 冻存液配制: (1)DMSO:血清=1:9(推荐)
(2)DMSO:培养基:血清=1:3:6 均可 DMSO为细胞专用型;现用现配,效果最好;冻存时细胞在-80℃中不要超过一周,最好在24-48h内放入液氮罐中保存。 3)细胞培养基配制(过滤除菌)、胰酶配制(过滤除菌),PBS配制(灭菌);(不同培养基的区别;谷氨酰胺(提供氮源),2周补充一次) 4)转染 5)MTT原理及操作(检测细胞存活率或死亡率) 6)碱性磷酸酶实验(ALP,检测细胞分化) (5、6 需学会SPSS软件及graphpad prism5软件使用) 7)Hoechst染色 8)结晶紫染色(不推荐) 9)苏木精/伊红染色 (9可以替代8,以后实验推荐使用9,图片漂亮) 10)荧光显微镜的使用 11)激光共聚焦显微镜样品制备(细胞固定,染色,洗脱) (7、8、9、10、11需学会Photoshop常用工具处理数据) 12)流式细胞仪样品制备(包括:转染效率与细胞凋亡染色标记)以及仪器操作(需学会FlowJo软件分析流式结果) 三、动物实验 1)小鼠的定制: 常见的小鼠: ICR小鼠(正常),9元/只
病毒学整理
第一章绪论 一、病的发展简史： A 病毒的发现时期 1.科赫法则内容： 1 .在每一病例中都出现相同的微生物，且在健康者体内不存在； 2 .要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中得到纯培养（pure culture）； 3 .用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的寄主，同样的疾病会重复发生； 4 .从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生物来。 B 病毒的化学时期 C 病毒研究的细胞水平时期 D 分子病毒学的研究时期 亚病毒定义subvirus：只含有核酸或蛋白质的病毒，称为亚病毒。包括类病毒、拟病毒（或病毒卫星）、朊病毒。 二、分子病毒学研究的主要内容： （1）病毒基因组的结构与功能 1、双义(ambisense)RNA：即基因组的一部分为正极性，另一部分为负极性。 2、病毒基因组的结构与功能 病毒基因组的核苷酸组成及其排列顺序 基因组中开放阅读框架(ORFs)的数量、位置及其功能 病毒基因组中重复序列元件、调节元件对病毒基因表达和基因组复制的影响 阐明病毒结构基因、调节基因及其编码产物在病毒复制循环中的作用，以及它们与细胞基因及其编码产物的相互作用关系等 （2）病毒表达的调控机理 通过对病毒增强子(enhancer)、启动子(promoter)、衰减子(attnuator)和转座子(transposon)等调控元件的研究，可以阐明病毒基因表达的调控原理。 转座子：用插入序列进行整合的遗传单位（能够重复插入到基因组中许多位点的特殊片段）。衰减子：特定的DNA片段，可以减慢、阻止或停止转录 （3）病毒感染的分子机制 （4）病毒致癌的分子机理 病毒癌基因定义：致癌病的所携带的一段基因，侵染敏感细胞使细胞癌变，转化为癌细胞，生长失去控制，无限分裂增殖。 （5）抗病毒活性物质 1. 抗病毒多肽物质 干扰素是一类能够抑制病毒增殖的重要细胞素。具有很强的抗病毒能力，还有免疫调节和肿瘤抑制的作用。利用DNA重组技术，可以在大肠杆菌中生产出干扰素 2. 淋巴因子：重组克隆生产的IL-1、IL-2肿瘤坏死因子TNF 3. 反义RNA(antisense RNA) 定义：指天然存在的或人工合成的一类RNA分子，它不能编码蛋白质，但它的核苷酸顺序可与相应的RNA或DNA互补配对，从而使蛋白质合成受阻。 将反义RNA与其相应的病毒mRNA或DNA杂交，可以使病毒mRNA编码合成蛋白的功能受阻，从而破坏病毒的复制循环。反义技术：利用反义RNA封闭某个基因的技术。
分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
病毒学检验重点
病毒得特点: 1、形体微小,能通过细菌滤器,用电子显微镜才能观察到。 2、无细胞结构,其主要成分就是核酸与蛋白质 3、每种病毒只含有一种类型得核酸(RNA或DNA) 4、因缺乏完整得酶系统与能源,故只能寄生于活细胞内,依靠宿主细胞得代谢系统合成蛋白质与核酸 5、病毒以其基因为模板,在宿主细胞内复制出新得病毒颗粒 6、为了在生物界保存其种属,病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主得能力,并具有对敏感宿主得侵染性与复制性 7、在宿主体外,能以大分子状态存在,并可长期保持其侵染能力 8、有些病毒得核酸能整合到宿主细胞得基因组中,并能诱发潜伏感染 体外细胞培养得基本条件: 1、条件要求高,培养液组分复杂,需要添加血清才能满足生长需要 2、避免微生物污染,需要在培养液中加入抗生素。 3、体外细胞培养得基本要求主要包括细胞接种(尽量选择对数期细胞接种)、 4、培养液营养成分、 5、酸碱度(能耐受得ph范围为 6、6- 7、8,依靠缓冲系统调节)、 6、气体条件(细胞生长需要CO2 ,大规模培养需要有足够得氧气)、 7、温度(最适温度为35-37。C)、 8、水得纯度(一般要求去离子水或三蒸水)、 9、无菌条件等 实验动物得微生物控制分类: 1、普通动物,一级动物,要求不携带动物烈性传染病与人兽共患病病原 2、清洁动物,二级动物,在一级动物要求上,不携带对动物危害大、对实验干扰大得病原 体,外观健康,主要器官不得有组织病理学病变 3、无特定病原体动物,三级动物,除普通动物、清洁动物不得携带病原体外,还要求排除 潜在感染或条件致病菌得感染 4、无菌动物,四级动物,要求在体内外不得检出其它生命体 实验动物得遗传学分类 1、近交系,指经过连续20代以上全同胞或亲子交配培育得动物品系 2、封闭系,不从外界引入新得血缘,非近亲交配方式得实验动物群体 3、突变系,由于遗传基因发生突变而具有某些特殊形状得动物 4、杂交群动物,由不同品系杂交所产生得后代 5、转基因动物,插入外源基因后能正常繁殖得动物 大鼠、小鼠得采血方法 1、剪尾采血,动物麻醉后,将尾端剪去约5mm,待血液流出采集,小鼠可每次采血0、1ml, 大鼠约0、4ml 2、眼眶后静脉丛采血,拇指及食指抓住鼠两耳之间得皮肤固定,轻轻压迫颈部两侧,使眼 球充分外凸。采血管插入眼角与眼球之间,向眼底方向刺入,切开静脉丛,血流即流入取血管。 3、颈(股)动脉或颈(股)静脉采血,麻醉动物,剪去被毛,作颈静脉或劲动脉分离术后采血 4、摘眼球采血,采血时,用左手固定动物,压迫眼球,尽量使眼球凸出,右手用弯头镊子摘 除眼球,迅速采集血液 病毒得纯化方法:
医学细胞生物学实验课教学大纲.
医学细胞生物学实验课教学大纲 (供临床医学专业七年制使用) 汕头大学医学院细胞生物学与遗传学教研室 2007年6月
前言 细胞生物学是生命科学中最重要的基础学科和前沿学科，细胞生物学课程是培养医学生基础理论知识、实践能力、创新能力的关键环节。优秀的细胞生物学课程高等医学院校课程体系建设的重要内容。结合汕头大学医学院人才培养目标，我们将锻造理论与实践、临床与基础重组渗透，能力培养贯穿始终的、特色鲜明的医学细胞生物学课程体系作为本课程建设的目标，力争通过本课程的学习使临床医学专业学生掌握细胞生物学的基本原理、研究方法，掌握相关疾病的分子机制，提高科学素养，为其今后的终身学习、临床实践、科学研究奠定良好基础。 实验课教学是理论教学的重要补充，是人才培养的关键环节。在实验教学上我们以科研与教学相结合、科研应用于教学为指导思想，坚持实验内容的先进性和综合性，创造条件改善和提高学生的动手能力，为培养学生基本科研技能奠定基础。力争通过实验课学习使学生掌握医学细胞生物学的基本理论和实验技能，提高学生独立分析问题和解决问题的能力，培养学生学习的主动性，使其具备一定的科研思维和科研能力，提高科学素养，为其今后的终身学习、临床实践和科学研究奠定良好基础。 七年制细胞生物学实验课程包括基础性实验-综合设计性实验-科研活动三个层次的实验课课程体系。通过该课程体系对七年制学生实验能力进行全程培养。本教学大纲规定基础性实验和综合设计性性实验的内容。科研活动的内容和要求由学生和教师讨论后自行确定。 汕头大学医学院细胞生物学与遗传学教研室 2007年5月
七年制医学细胞生物学实验课内容 实验项目名称学时层次教学手段 实验一数码互动系统使用及细胞 基本形态观察4 基础实验 数码互动系统讲授 示教讨论 实验二细胞生理活动观察 4 基础实验数码互动系统多媒体演示 讲授、示教讨论 实验三细胞染色体标本制备 与观察4 基础实验 数码互动系统 讲授、示教讨论 实验四细胞的原代与传代培养 6 基础实验数码互动系统多媒体演示 讲授、示教讨论 实验五细胞组分的分离与鉴定>12 综合实验讨论多媒体 实验六细胞骨架对细胞、细胞器的影响>12 综合实验 讨论 多媒体 实验七药物对细胞增殖与凋亡 的影响>12 综合实验 讨论 多媒体 实验八定位信号与蛋白亚细胞 定位>12 综合实验 讨论 多媒体 大学生科研活动项目科研活动综合应用多种教学手段
2020智慧树知到《病毒学检验》章节测试题【完整答案】
2020智慧树知到《病毒学检验》章节测试 题【完整答案】 2020智慧树知到《病毒学检验》章节测试答案 绪论 1、用于测量病毒大小的单位是： A.μm B.nm C.pm D.fm E.am 答案: nm 第一章 1、PCR反应的引物需要2条。 A:对 B:错 答案: 对 2、甲型肝炎病毒归属于嗜肝DNA病毒科 A:对 B:错 答案: 错 3、病毒只含有一种核酸，DNA或RNA A:对
B:错 答案: 对 4、乙肝大三阳时，以下哪些项应为阳性 A:HBsAg B:HBeAg C:HBcAg D:抗HBc E:抗HBs 答案: HBsAg,HBeAg,抗HBc 第二章 1、可传播HIV的途径有 A:分娩 B:共用牙刷、剃须刀等 C:输血、血浆及血液制品 D:手术器械 E:皮肤接触 答案: 分娩,共用牙刷、剃须刀等,输血、血浆及血液制品,手术器械 2、狂犬病防治措施有 A:捕杀病犬加强家犬管理 B:人被咬伤后应及时处理伤口 C:动物咬伤后应及时接种狂犬病疫苗
D:及时足量注射丙种球蛋白 E:对可疑患者或严重咬伤者在作用疫苗前注射抗狂犬病病毒血清 答案: 捕杀病犬加强家犬管理,人被咬伤后应及时处理伤口,动物咬伤后应及时接种狂犬病疫苗,对可疑患者或严重咬伤者在作用疫苗前注射抗狂犬病病毒血清 第三章 1、DNA的Tm值大小与下列哪个因素有关 A:温度的升高 B:酸碱度的改变 C:DNA的均一性 D:化学试剂 E:缓冲液 答案:B 2、下列哪项决定了PCR特异性与产量( ) A:变性温度 B:退火温度 C:延伸温度 D:循环次数 E:二价阳离子 答案:B 3、基因分型的传统方法是( )
病毒学检验
病毒的特点是：1、形体微小，能通过细菌滤器，用电子显微镜才能观察到。2、无细胞结构，其主要成分是核酸和蛋白质3、每种病毒只含有一种类型的核酸（RNA或DNA）4、因缺乏完整的酶系统和能源，故只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸5、病毒以其基因为模板，在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒6、为了在生物界保存其种属，病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力，并具有对敏感宿主的侵染性和复制性7、在宿主体外，能以大分子状态存在，并可长期保持其侵染能力8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中，并能诱发潜伏感染 细胞培养技术：是对由组织分散成的单个细胞或某一型细胞群进行的体外培养方法，即模拟体内的生理环境条件，提供细胞适宜的营养条件和温度，在无菌操作的基础上，使离体组织细胞生长增殖并进行传代的技术 二、单层细胞培养： 用于培养病毒的细胞有原代细胞、传代细胞（二倍体细胞株和传代细胞系） 三、鸡胚的接种途径：1、羊膜腔接种2、绒毛尿囊膜接种3、尿囊腔接种4、卵黄囊接种 四、 间接计数在病毒检验过程中较为常用，是判定病毒感染性的定量方法，常用的有：空斑形成单位法，50%终点法，血凝试验和干扰测定 空斑形成单位（PFUs）试验：是将不同稀释倍数的动物病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合，当病毒颗粒在一大片宿主细胞上引发感染时，会造成细胞被溶解而形成空斑，每个空斑系由一个病毒颗粒所造成，计算空斑数目再乘以稀释倍数，即可得知原来的病毒感染单位的浓度 凡事能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可用空斑技术来测定其滴度。 50%终点法：是将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞，将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变做曲线，找出造成50%动物、鸡胚死亡或病变的终点稀释度。 LD50：为造成50%动物或鸡胚死亡的病毒含量 ID50：即是指可造成50%动物或鸡胚感染的剂量 CCID50：造成50%细胞培养产生病变效应的剂量 五、病毒纯化的一般原则：1、释放病毒至细胞外2、去除细胞碎块3、病毒悬液浓缩 六、病毒的保存：1、用低温（-60~25℃）、超低温（-70以下）冰箱或液氮罐（-196~150）保存 2、冷冻干燥保存 七、血清学实验的方法很多，最常用的是中和试验、补体结合试验、红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验 中和试验：是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存的病毒感染力的一种方法。 中和抗体：凡是能与病毒结合，并使其失去感染力的抗体称为中和抗体 中和试验必须在敏感的动物体内（包括鸡胚）和细胞培养中进行
智慧树知到《病毒学检验》章节测试答案
智慧树知到《病毒学检验》章节测试答案绪论 1、用于测量病毒大小的单位是： A．μm B．nm C．pm D．fm E．am 答案: nm 第一章 1、PCR反应的引物需要2条。 A:对 B:错 答案: 对 2、甲型肝炎病毒归属于嗜肝DNA病毒科 A:对 B:错 答案: 错 3、病毒只含有一种核酸，DNA或RNA A:对 B:错 答案: 对
4、乙肝大三阳时，以下哪些项应为阳性 A:HBsAg B:HBeAg C:HBcAg D:抗HBc E:抗HBs 答案: HBsAg,HBeAg,抗HBc 第二章 1、可传播HIV的途径有 A:分娩 B:共用牙刷、剃须刀等 C:输血、血浆及血液制品 D:手术器械 E:皮肤接触 答案: 分娩,共用牙刷、剃须刀等,输血、血浆及血液制品,手术器械 2、狂犬病防治措施有 A:捕杀病犬加强家犬管理 B:人被咬伤后应及时处理伤口 C:动物咬伤后应及时接种狂犬病疫苗 D:及时足量注射丙种球蛋白 E:对可疑患者或严重咬伤者在作用疫苗前注射抗狂犬病病毒血清 答案: 捕杀病犬加强家犬管理,人被咬伤后应及时处理伤口,动物咬伤后应及时接种狂犬病疫苗,对可疑患者或严重咬伤者在作用疫苗前注射抗狂犬病病毒血清
第三章 1、DNA的Tm值大小与下列哪个因素有关A:温度的升高 B:酸碱度的改变 C:DNA的均一性 D:化学试剂 E:缓冲液 答案:B 2、下列哪项决定了PCR特异性与产量（）A:变性温度 B:退火温度 C:延伸温度 D:循环次数 E:二价阳离子 答案:B 3、基因分型的传统方法是（） A:反向杂交 B:质谱 C:基因芯片技术 D:焦磷酸测序技术 E:超深度焦磷酸测序 答案:A
病毒学检验重点
病毒的特点： 1、形体微小，能通过细菌滤器，用电子显微镜才能观察到。 2、无细胞结构，其主要成分是核酸和蛋白质 3、每种病毒只含有一种类型的核酸（RNA或DNA） 4、因缺乏完整的酶系统和能源，故只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸 5、病毒以其基因为模板，在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒 6、为了在生物界保存其种属，病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力，并具有对敏感宿主的侵染性和复制性 7、在宿主体外，能以大分子状态存在，并可长期保持其侵染能力 8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中，并能诱发潜伏感染 体外细胞培养的基本条件： 1、条件要求高，培养液组分复杂，需要添加血清才能满足生长需要 2、避免微生物污染，需要在培养液中加入抗生素。 3、体外细胞培养的基本要求主要包括细胞接种（尽量选择对数期细胞接种）、 4、培养液营养成分、 5、酸碱度（能耐受的ph范围为6.6-7.8，依靠缓冲系统调节）、 6、气体条件（细胞生长需要CO2 ，大规模培养需要有足够的氧气）、 7、温度（最适温度为35-37。C）、 8、水的纯度（一般要求去离子水或三蒸水）、 9、无菌条件等 实验动物的微生物控制分类： 1、普通动物，一级动物，要求不携带动物烈性传染病和人兽共患病病原 2、清洁动物，二级动物，在一级动物要求上，不携带对动物危害大、对实验干扰大的 病原体，外观健康，主要器官不得有组织病理学病变 3、无特定病原体动物，三级动物，除普通动物、清洁动物不得携带病原体外，还要求 排除潜在感染或条件致病菌的感染 4、无菌动物，四级动物，要求在体内外不得检出其它生命体 实验动物的遗传学分类 1、近交系，指经过连续20代以上全同胞或亲子交配培育的动物品系 2、封闭系，不从外界引入新的血缘，非近亲交配方式的实验动物群体 3、突变系，由于遗传基因发生突变而具有某些特殊形状的动物 4、杂交群动物，由不同品系杂交所产生的后代 5、转基因动物，插入外源基因后能正常繁殖的动物 大鼠、小鼠的采血方法 1、剪尾采血，动物麻醉后，将尾端剪去约5mm，待血液流出采集，小鼠可每次采血 0.1ml，大鼠约0.4ml 2、眼眶后静脉丛采血，拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤固定，轻轻压迫颈部两侧， 使眼球充分外凸。采血管插入眼角与眼球之间，向眼底方向刺入，切开静脉丛，血流即流入取血管。
常规病毒学实验技术
常规病毒学实验技术 （一）病毒的培养 实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠 主要用于： ①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒 ②培养病毒，制造抗原和疫苗 ③测定各毒株之间的抗原关系，（用实验动物作中和试验和交叉保护实验） ④制备免疫血清和单克隆抗体 ⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等 注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。 鸡胚 （一）条件要求 SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。 （二）优点 组织分化程度低，可选择不同的日龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。 （三）接种途径 1．绒毛尿囊膜接种（10-12日龄鸡胚） 主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。 1）方法一（造人工气室） ①在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的 烤焦圈。 ②用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。 ③在气室端中央钻一个小孔。 ④用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。 ⑤滴加滴生理盐水于刺破处，用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压， 使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。 ⑥用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。 ⑦用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的 小孔用石蜡密封。 ⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。 2）方法二 ①在气室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的口。 ②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。 ③滴入接种物。 ④用透明胶纸封闭开口。 2．尿囊腔接种（10-11日龄） 用于正粘病毒和副粘病毒（NDV）
新乡医学院医学细胞生物学简答题
供基础医学院临床17、20班参考使用 医学细胞生物学简答题集锦 第一章绪论 1.简述细胞生物学形成与发展经历的阶段 （1）细胞的发现与细胞学说的建立：R.Hook最早发现细胞并命名为cell，施莱登和施旺建立细胞学说。 (2)细胞学的经典时期：细胞学说的建立掀起了对多种细胞广泛的观察和描述的热潮，主要的细胞器和细胞分裂活动相继被发现。 (3)实验细胞学时期：人们广泛的应用实验的手段研究细胞的特性、形态结构和功能。 (4)分子生物学的兴起和细胞生物学的诞生：各个学科相互渗透，人们对细胞结构与功能的研究达到了新的高度。 第二章细胞的统一性与多样性 1.细胞膜的流动性有什么特点，膜脂有哪些运动方式，影响膜脂流动性的因素有哪些？ （1）膜脂既具有分子排列的有序性，又有液体的流动性；温度对膜的流动性有明显的影响，温度过低，膜脂转变为晶态，膜脂分子运动受到影响，温度升高，膜恢复到液晶态，此过程称为相变。（2）膜脂的运动方式有：侧向扩散、旋转运动、摆动运动、翻转运动，其中翻转运动很少发生，侧向扩散是主要运动方式。（3）影响流动性的因素：脂肪酸链的长短和饱和程度，胆固醇的双重调节作用，卵磷脂/鞘磷脂比值越大膜脂流动性越大，膜蛋白与周围脂质分子作用也会降低膜流动性。此为环境因素（如温度）也会影响膜的流动性，温度在一定范围内升高，流动性增强。2.简述膜蛋白的种类及其各自特点，并叙述膜的不对称性有哪些体现 (1)膜蛋白分为膜外在蛋白、膜内在蛋白、脂锚定蛋白。膜外在蛋白属于水溶性蛋白，分布在膜的两侧，与膜的结合松散，一般占20%-30%； 膜内在蛋白属于双亲性分子，嵌入、穿膜，是膜功能的 主要承担者，与膜结合紧密，占70%-80%。 脂锚定蛋白通过共价键与脂分子结合，分布在膜两侧， 含量较低。 (2)膜的内外两侧结构和功能有很大差异，称为膜的不对称 性，这种不对称决定了膜功能的方向性。 膜脂：磷脂和胆固醇数目分布不均匀，糖脂仅分布于脂 双层的非胞质面。膜蛋白：各种膜蛋白在质膜中都有一定 的位置。膜糖类：糖链只分布于质膜外表面。 3.比较说明单位膜模型与液态镶嵌模型有哪些不同点 单位膜是细胞膜和胞内膜等生物膜在电镜下呈现的三夹 板式结构，内外两层为电子密度较高的暗层，中间是电子 密度低的明层，“两暗夹一明”的结构叫做单位膜，单位膜 仅能部分反映生物膜的结构特点。 流动镶嵌模型强调膜的流动性和膜蛋白分布的不对称性 以及蛋白质与脂双层的镶嵌关系。认为膜蛋白和膜脂均能 产生侧向运动，膜蛋白有的在膜表面、有的嵌入或横跨脂 双分子层。该模型能解释膜的多种性质，但不能说明具有 流动性的细胞膜在变化过程中如何维持膜的相对完整。 第四章细胞连接、细胞黏附和细胞外基质 1.什么是细胞连接，细胞连接有哪些类型 细胞表面可与其它细胞或细胞外基质结合的特化区称为 细胞连接。分为紧密连接、黏着链接和通讯连接。 紧密连接的特点是细胞膜之间连接紧密无空隙，一般位 于上皮细胞间。 黏着链接中，与肌动蛋白纤维相关的有黏着带:分布于上 皮细胞，黏着斑:分布于上皮细胞基部；与中间丝有关的有 桥粒：分布于心肌和上皮，半桥粒：分布于上皮细胞基底 部。 通讯连接分为缝隙连接和突触，缝隙连接几乎存在于所 有类型的细胞之间，突触仅存在于可兴奋细胞之间用来传 到兴奋。 2.什么是细胞外基质，叙述细胞外基质的组成 细胞外基质是指由细胞分泌到细胞外间充质中的蛋白 质和多糖类大分子所构成的网络结构。 （1）纤维成分：如胶原、弹性蛋白。胶原是细胞外基质最 基本成分之一，是动物体内含量最丰富的蛋白，刚性及抗 张力强度最大。 （2）糖胺聚糖和蛋白聚糖：透明质酸是唯一不发生硫酸化 的糖胺聚糖，是增殖细胞和迁移细胞的细胞外基质的主要 成分，透明质酸向外膨胀产生压力，使结缔组织具有抗压 的能力；蛋白聚糖见于所有结缔组织和细胞外基质及许多 细胞的表面，可与多种生长因子结合，可视为细胞外的激 素富集与储存库，有利于激素分子进一步与细胞表面受体 结合，完成信号转导。 (3)层粘连蛋白和纤连蛋白：层粘连蛋白是个体细胞外基质 中出现最早的蛋白，对基膜的组装起到关键作用。纤连蛋 白主要介导细胞黏着，也能促进巨噬细胞和其它免疫细胞 迁移到受损部位。 3.叙述黏着带和黏着斑的区别 粘着带是细胞与细胞间的粘着连接,而粘着斑是细胞 与细胞外基质相连。 ①参与粘着带连接的膜整合蛋白是钙粘着蛋白,而参 与粘着斑连接的是整联蛋白,即细胞外基质受体蛋白; ②粘着带连接实际上是两个相邻细胞膜上的钙粘着 蛋白与钙粘着蛋白的连接,而粘着斑连接是整联蛋白与细 胞外基质中的粘连蛋白的连接,因整联蛋白是纤粘连蛋白 的受体，所以粘着斑连接是通过受体与配体的结合; 第五章小分子物质的跨膜运输 1. 以Na+-K+泵为例说明细胞膜的主动转运过程 Na+-K+泵又称Na+-K+ATP酶，由α和β两个亚基组成，均 为穿膜蛋白。在α亚基的外侧（朝向胞外）有两个K+的结 合位点，内测有3个Na+的结合位点和一个催化ATP水解 的位点。 工作中，细胞内的Na+与大亚基上的Na+位点相结合，同 时ATP分子被催化水解，大亚基改变空间构象，使3个Na+ 排除胞外，同时K+与α亚基外侧面相应位点结合，α亚基 空间结构恢复原状，将2个K+输入细胞，完成循环，每次 循环消耗一个ATP分子，3个Na+出胞，2个K+入胞。 第六章胞质溶胶、蛋白酶体和核糖体 1.核糖体有几种，合成的蛋白质在功能上有什么不同 核糖体分为游离核糖体和附着核糖体。 分布于细胞质基质中的核糖体是游离核糖体，主要合成 细胞本身所需的结构蛋白。附着在内质网膜和核膜表面的 是附着核糖体，主要合成外输性蛋白质。 第七章内膜系统与囊泡运输 1.内质网有哪些类型，在细胞中的作用是什么 内质网主要由脂类和蛋白质组成，是单层膜结构，分为 粗面内质网和光面内质网。 粗面内质网主要呈囊状，表面有核糖体附着，主要功能 是合成、加工修饰、分选转运一些蛋白质，提供核糖体附 着的支架。 光面内质网不合成蛋白质，是脂类合成和转运的场所， 并参与糖原的代谢，是细胞解毒的场所（肝细胞），SER特 化成肌质网可作为肌细胞储存钙离子的场所。 2.叙述高尔基体的组成，及主要功能 高尔基体是一种膜性囊泡复合体，由扁平囊泡、小囊泡、 大囊泡组成。 高尔基体是细胞内蛋白质运输分泌的中转站，是胞内物 质加工合成的主要场所，参与糖蛋白的加工合成、蛋白质 的水解加工、胞内蛋白质分选和膜泡定向运输的枢纽。 3.简述分泌蛋白的运输过程 ①核糖体阶段：合成并转运分泌蛋白；②内质网阶段： 运输并粗加工分泌蛋白；③细胞质基质运输阶段：分泌蛋 白以小泡的形式脱离粗面内质网并移向高尔基复合体与其 结合；④高尔基体加工修饰：分泌蛋白进一步在高尔基复 合体内进行加工，并以囊泡的形式释放到细胞质基质；⑤ 储存与释放：释放时，囊泡浓缩发育为分泌泡，与质膜融 合，释放到体外。 4.以肝细胞吸收LDL为例，说明受体介导的胞吞作用的过 程 肝细胞需要利用胆固醇合成生物膜时，细胞合成LDL受 体并分散嵌入细胞膜，当LDL与受体结合后，细胞膜向内 凹陷形成有被小窝。LDL受体集中在有被小窝内不断内陷， 进入细胞，脱离细胞膜形成有被小泡。 有被小泡脱去网格蛋白被摸与其它囊泡融合形成内体， 内体内LDL与受体分离，受体返回细胞膜，LDL被溶酶体 酶降解。如果游离胆固醇过多，LDL受体和胆固醇就会暂 停合成，这是一个反馈调节的过程。 5.叙述信号肽假说的内容 新合成的蛋白质分子N端含有一段信号肽，该信号肽一 经合成可被胞质中的信号识别颗粒（SRP）识别并结合，通 过信号肽的疏水性引导新生肽跨脂双分子层进入内质网腔 或直接整合在内质网膜中。 信号肽具有决定蛋白质在胞内去向或定位的作用。 第八章线粒体 1. 为什么说线粒体是一个半自主性的细胞器? 线粒体有自己的DNA(即mtDNA)，存在线粒体核糖体， 通过自己的蛋白质合成系统可以进行mtDNA的复制转录 翻译。 然而mtDNA的信息量少，只能合成近10%的线粒体蛋白， 绝大多数线粒体蛋白质仍依靠核基因组进行编码，再转运 进线粒体中；构成线粒体的蛋白质合成系统的许多酶仍依 靠核基因编码合成。 故线粒体是一种半自主性细胞器。 2.线粒体的半自主性有哪些体现 线粒体有自己的mtDNA，是动物细胞质中唯一含有DNA 的细胞器。有自己的核糖体和蛋白质合成系统，供mtDNA 复制转录翻译。遗传密码相较其它细胞有差异。有自己的 物质转运系统，指导线粒体蛋白运输进线粒体，不与细胞 质交换DNA和RNA，也不输出蛋白质。 3.画图显示线粒体的结构，并表明各部分名称（答案略） 4.说明线粒体基粒的结构组成和功能 基粒又称ATP酶复合体，由头部、柄部、基部组成； 头部又称偶联因子F1，具有酶的活性，能催化ADP磷酸 化生成ATP；柄部是一种对寡霉素敏感的蛋白质，能抑制 ATP的合成；基部又称偶联因子F0，起到连接F1与内膜的 作用。 5.叙述化学渗透假说的内容 线粒体内膜是完整的、封闭的，内膜中的电子传递链是 一个主动转移氢离子的体系，电子传递过程像一个质子泵， 将氢离子从内膜基质泵至膜间隙，由于膜对氢离子不通透， 形成膜两侧的浓度差，质子顺浓度梯度回流并释放出能量， 驱动结合在内膜上的ATP合酶，催化ADP磷酸化合成ATP。 第九章细胞骨架 1.何谓细胞骨架?细胞骨架有哪些类型和功能? 细胞骨架是指真核细胞质中的蛋白质纤维网架体系，细
第十四章 病毒学实验技术
第三篇病毒学实验技术 实验学时计划：实验一实验须知6小时；实验二细胞培养用水的制备及检验15小时；实验三组织培养技术20小时；实验四病毒的分离及其理化性质的测定20小时；实验五病毒提纯技术15小时。 实验一实验须知 一、实验室注意事项 1．凡参加病毒学实验的人员均应接种与实验有关的病毒疫苗。 2．实验室内，特别是组织培养操作室，须经常保持干燥、清洁。在进行病毒接种或无菌操作前后，均应用紫外线照射灭菌，必要时可用3～5%的酚或煤酚皂溶液擦拭或喷雾消毒。 3．进入操作室，须先洗净双手并用消毒药水严格消毒；更换拖鞋，戴口罩和帽子，穿消毒的实验服。 4．病毒实验操作完毕后，将所穿戴实验服、口罩、帽子和拖鞋等物，出操作室前须更换；两手须经消毒药水严格浸洗后方能外出。 5．一个接种操作室，严禁同时进行两株病毒株的传种；吸取病毒材料时，勿于悬空吹出或打出。 6．凡沾病毒材料的吸管、试管等器具，须随时投入5%煤酚皂或1%盐酸溶液内，浸泡过夜，或煮沸消毒后才能进行洗涤。 7．凡带有感染性的鸡胚或动物尸体，须立即投入炉内焚化或进行煮沸消毒，或盛入容器内进行高压消毒后，方能携出室外进行处理。 8．工作人员要随时注意安全操作，以免发生事故；如发生意外，应迅速采取有效措施补救。 二、病毒材料收集、运送和保存 （一）材料的收集 分离病毒的成功率与采集材料有密切的关系。采集病料必须在适当的部位和时间内进行，前者与各种传染的发病机理有关，后者常规在疾病早期，因为通常在疾病刚出现时病毒的滴度高。各种病毒感染所采适宜病料参见图1和图2。 由于许多病毒的不稳定性，欲作病毒分离的材料，都应尽快的冷藏。－30℃保存的病毒材料（除少数例外），至少可以活存几个月以上；而－70℃保存的病毒，甚至几年不见毒力降低。有些病毒需在潮湿环境下保存，有的则需干燥环境（如Orf virus）。
关于医学细胞生物学实验教学的几点体会
关于医学细胞生物学实验教学的几点体会 发表时间：2017-09-15T11:57:15.953Z 来源：《临床医学教育》2017年8月作者：张云齐 [导读] 医学细胞生物学是医学与细胞生物学结合的一门学科，是医学专业的基础课程，也是一门实验性很强的学科，为医学生学习生理、生化、微生物、临床检验等奠定重要的基础。 武汉中原医院武汉市 430000 【摘要】医学细胞生物学是一门重要的基础医学类课程。由于其内容繁杂、概念抽象，学生难以掌握，教学难度较大。应本着边实践边研究的原则，理论和实验教学相结合，在实验教学中从教学内容及教学手段和考核方法等方面进行研究和探讨，提高学生主动学习的积极性和兴趣，从而提高教学质量，培养高素质的医学人才。 【关键词】医学细胞生物学实验教学教学改革教学方法 医学细胞生物学是医学与细胞生物学结合的一门学科，是医学专业的基础课程，也是一门实验性很强的学科，为医学生学习生理、生化、微生物、临床检验等奠定重要的基础。医学细胞生物学实验课独立于理论教学体系，又与理论教学密切相关，在理论知识的验证和理解方面有着理论课无法代替的作用，因此医学细胞生物学教学必须注重学习能力与创新能力的培养，要力求培养学生独立思考、独立操作的能力，敏锐的观察能力，以及科学分析、归纳、总结问题的能力，培养高素质、综合能力强的人才，是新形势下实验教学改革的一项重要而艰巨的任务。我们经过总结医学细胞生物学理论与实验教学中的经验，对临床、药学等专业的医学细胞生物学实验教学改革进行了一些尝试和摸索，有了一些体会，现从实验内容、实验教学方法和考核方法等方面进行总结。 一优化实验教学内容培养医学生科学素质 根据医学细胞生物学实验的教学目的，我们在强调细胞生物学实验基本操作的基础上，结合学理论知识及学科知识的更新与进展，以及科研工作的实际需要，完善了实验内容体系，选择注重结合临床医学知识，增加探索性和综合性的实验，共开设有24个学时，6个实验。医学细胞生物学是一门实验性很强的学科，理论课上的概念、原理和规律都需要通过实验推导和论证，实验教学是医学细胞生物学课程的主要组成部分之一，实验内容是对细胞生物学理论的验证和补充。例如。通过对细胞有丝分裂各个时期细胞内形态结构的观察，能够使学生对有丝分裂这一动态过程有更直观和深刻的理解。 医学细胞生物学作为生命科学的前沿学科，新的技术和手段不断涌现，并且许多方法在医学领域都得以应用。因此实验教学的内容本身必须不断更新，除了经典的细胞生物学实验内容外，其他如光学显微镜技术、电子显微镜技术、细胞的有丝分裂与减数分裂、细胞化学技术、细胞器的观察与显示等新的实验内容应尽可能地增添进来，以涵盖细胞生物学前沿知识和技术方法。近年来，我们根据实验条件的改善逐步增加了细胞生理的一些实验内容，如细胞吞噬和细胞融合等，并且计划继续增加有关免疫荧光细胞染色内容，如细胞的原代与传代培养、细胞增殖和细胞凋亡的诱导，以及观察绘制细胞生长曲线等。这些实验旨在培养学生实验设计能力和综合分析能力，使学生能够用所学过的理论知识和实验技术解决实际问题，培养学生的创新意识，这是高校培养创新人才的重要环节之一。 二运用多元化实验教学方法激发学生的学习兴趣 在重视基础实验教学的基础上，改变传统灌输式的教学，建立以学生为中心的教学模式，灵活运用多种教学方法和手段，鼓励学生发现、思考和探索，培养并激发学生兴趣，增进教学效果。应用启发式教学、PBL教学模式和开放式教学等多种方法组合加强对实验课程的监控，在某些综合性、验证性实验课中，采用实验与课堂分析讨论相结合的形式，充分调动学生的主观能动性，使学生在构建广博而灵活的理论知识基础之上，能真正地掌握一些细胞生物学最基本的实验技术。 1.启发式教学法 采用启发式教学，引导学生积极思考，培养学生思维能力。例如，在讲授细胞蛋白质分布和显示实验时，可以向学生提出以下问题：蛋白质种类有哪些、分别有什么化学性质、根据其化学性质采用什么样的方法进行显色才能确定蛋白质在细胞中分布位置等。这样，一方面调动了学生的学习积极性，另一方面，鼓励学生运用理论知识进行积极思考，加深对实验原理的理解，掌握实验方法。 2.PBL式教学法 PBL式教学是近年来兴起的一种新式教学模式，是在实验教学的相关环节中以问题为中心展开讨论的一种教学方法。PBL模式实验教学能促进师生间的互动交流，激发学生的自主学习兴趣，提高学生对某一方面知识、资料的查找和自我观点的表达，是增强学生综合素质的有效手段，是现代教育中颇具潜力的一种教学模式。教师在实验课的课前、课中和课后有计划有步骤地向学生提出问题，学生学习时以一个问题为起点，由此带出一系列相关的基础知识的问题。其中，问题设计和选择的好坏直接关系到最终的教学效果。我们对生物技术专业学生进行了探索研究性实验教学，收到了良好的效果，具体为：带教教师布置相关实验课题，以每4～5位同学自由组成小组后通过图书馆和上网查阅相关的参考文献后，由其中一位同学做好PPT在实验课堂上演示实验设计方案，带教教师予以点评及修正，其他同学参与讨论。这样可以充分调动学生的学习积极性，培养学生主动分析问题、小组成员间分工协作、查阅相关文献资料、运用所学知识解决实际问题的能力。PBL模式实验教学打破了传统的以学科为基础，以教师为中心，以课堂讲授为主的教学模式，是将医学细胞生物学和其他临床或基础学科相结合的一种教学方法，能与多种教学模式相融合，是一个自学、讨论、再自学、再讨论的学习过程，学生成为学习和教学的主体。将PBL模式融入到细胞生物学实验教学后，发现学生的自学能力及独立分析解决问题的能力明显提高，同学们能更深入地学习和理解细胞生物学的相关实验内容，同时也增强了学生书面材料的整理归纳能力及口头表达能力等。 3.开放式教学 所谓开放式实验教学，指的是实验资源、实验内容、实验时间、教学方法和教学评价等对学生开放，充分发挥学生的主体作用，提倡其自主学习，提高其动手能力和创新能力的实验教学模式。对进行开放式实验教学的实验室应实行全天候开放制，使学生能够合理利用时间，自行安排实验计划，随时可以到实验室进行实验，大大丰富了教学的多元化和多样性，满足了不同层次学生学习的需求。开放式实验教学可由学生自己选定实验内容，制订实验步骤，选择仪器设备，处理、分析实验结果和实验数据等，在此过程中教师可以为学生提供解答实验中出现的问题等方面的服务，主要是起一个把关作用。在开放式实验教学中，教师的主导作用应着重于启发、引导，充分发挥学生的积极主动性；教师应指导学生放手去做，鼓励学生多尝试。在教学评价方面，对学生实验能力的评价，不能只重视实验的结果，更要重视实验的过程，特别是实验过程中学生所表现的独立分析问题、解决问题的能力及创新意识等。除以上几种教学方式之外，我们还对五年制临床本科专业学生进行了双语实验教学，提高学生的英语学习能力，掌握必要的专业词汇，为学生英文文献查阅提供了扎实的基