分子病毒学实验方法
分子生物学实验方法
分子生物学实验方法1.DNA提取与纯化DNA提取是分子生物学实验中最常用的技术之一，用于从不同种类样本中提取纯化DNA。
常见的提取样本包括细菌、动植物组织以及人体样本。
提取过程通常包括细胞破碎、蛋白质除去、DNA溶解和纯化等步骤。
常用的提取方法包括酚/氯仿提取法、CTAB提取法和商业化提取试剂盒。
2.PCR（聚合酶链反应）PCR是一种高效扩增DNA的技术，可将一小段目标DNA序列扩增成数百万个拷贝。
PCR反应通常包括DNA模板、两个引物、dNTPs（四种核苷酸单元）和DNA聚合酶等成分。
反应的核心步骤是多个高温循环，包括变性（解开DNA的双链）、退火（引物结合到目标序列）和延伸（DNA聚合酶合成新链）等步骤。
PCR广泛应用于分子克隆、基因表达研究、疾病诊断等领域。
3.转染和转化转染和转化是将外源DNA导入宿主细胞中的技术。
转染是指将DNA导入非真核细胞（如细菌）或真核无性细胞中，常用的方法包括电穿孔法、化学法和病毒载体介导等。
转化是指将外源DNA导入真核多细胞直至整个个体范围内，常见的方法包括冷冻转化、冲击转化和基因枪法等。
4.蛋白质表达和纯化蛋白质表达和纯化是研究蛋白质结构和功能的关键步骤。
常见的表达系统包括细菌系统（如大肠杆菌）、酵母系统（如酵母菌）和哺乳动物细胞系统（如CHO细胞）。
表达后，蛋白质需要经过多个步骤进行富集和纯化，如离心、柱层析和亲和层析等。
以上仅是分子生物学实验方法中的一部分，随着技术的发展，分子生物学实验方法也在不断更新和扩展。
这些实验方法在疾病诊断、基因工程、生物学研究等领域发挥了重要作用。
病毒学实验技术 [病毒学,实验技术]
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病毒学实验技术 [病毒学,实验技术]病毒学实验技术病毒学实验技术目的要求通过实验掌握常用的病毒学实验技术和诊断方法。
操作步骤一、病毒诊断用病料的采集病毒分离用生物学材料的最理想的采集时期，是在机体尚未产生抗体之前的疾病急性期。
各种病料，例如血液、鼻咽拭子、粪、尿、脓汁、水泡液、皮肤病变、脊髓液和活体穿刺材料以及剖检时采取的组织，均可用于病毒分离。
每个具体疾病需要采取什么样的生物标本，可参考有关疾病的叙述，特别是其诊断部分。
有一些总的规则适用于病毒分离用的组织的正确选择。
呼吸道疾病在急性期，通常在鼻或咽分泌物排出病毒。
在痘病的水泡液中或痂皮内也可发现病毒。
许多全身性卡他性疾病具有病毒血症期，易于由血液中分离到病毒。
实际上急性发病期间，机体的所有分泌物中都含有病毒。
与中枢神经系统有关的疾病较特殊，但也可由血液或病死动物的脑内分离病毒。
采取组织标本时一个最为重要的注意事项，就是必须在动物死亡后立即进行--必要时可扑杀濒死动物，就更有利于病毒分离。
同时应采取该动物血液作血清学试验,在冰冻前必须先从全血中分离血清，因为溶血标本经常不再能做某些血清学试验。
各种病毒的生物物理学和生物化学特性明显不同。
许多病毒对热及酸敏感，故在采集材料时必须特别注意。
尤其是必须采取新鲜材料，并立即置-60℃至-70℃下冰冻。
此外，在用这些病料接种组织培养物或试验动物分离病毒时，时间尽量要短。
如无其他方法，可将组织标本低温冰冻后置-20℃保存，等待取来干冰后再贮藏和送往实验室。
将标本放入宽口保温瓶或以泡沫苯乙烯隔热的纸板盒内，再用冰充填，也可达到这一目的。
如果没有干冰，则可应用50%甘油;某些病毒在此种溶液中能比其他一些病毒存活更久。
将小块组织、粪或粘液装入小瓶内，再向瓶内注满50%甘油，并贮存于6℃。
组织标本应以无菌器械在无菌条件下采取。
如果想要了解组织中的病毒分布，则必须应用分开的器械采取每个组织。
经常应用紧盖的灭菌旋帽瓶子贮存可疑的组织和液体。
分子生物学实验方法与步骤【可编辑全文】
可编辑修改精选全文完整版分子生物学实验方法与步骤表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。
6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。
7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。
8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。
9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl 封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。
pcr技术原理实验步骤和应用过程
pcr技术原理实验步骤和应用过程引言聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是在分子生物学领域中广泛应用的一种技术。
它能够通过无限次地扩增目标DNA片段，从而获得大量的目标DNA。
PCR技术不仅在遗传病的筛查、基因克隆和DNA测序等方面具有重要应用，还广泛应用于法医学、农业科学和生物技术等领域。
PCR技术原理PCR技术是通过连续进行三个核酸酶切循环，将目标DNA片段扩增至大量数量。
具体步骤如下：1. 反应准备将待扩增的DNA样本和引物（用于导向扩增的寡核苷酸链）添加到一个反应管中，并混合均匀。
2. Denaturation（变性）将反应管加热至95°C，使DNA双链解开成两条单链。
3. Annealing（退火）将反应管从95°C的高温状态快速冷却至50-60°C，并使引物与DNA单链结合。
4. Extension（延伸）将反应管温度提高至72°C，此时Taq DNA聚合酶开始引导DNA合成，从引物的末端开始延伸，并合成一条新的DNA链。
5. 延伸循环重复第2-4步骤，使得DNA的复制呈指数增长，产生大量扩增的DNA。
PCR技术应用过程PCR技术在科学研究和实际应用中有着广泛的应用，以下是几个典型的应用过程：1. 分子诊断PCR技术可以检测疾病相关基因的突变，用于遗传性疾病的早期诊断。
通过提取患者的DNA样本，通过PCR扩增技术可以检测出目标基因的突变，从而帮助医生确定诊断并制定合适的治疗方案。
2. 基因克隆PCR技术可以用于基因克隆。
通过设计合适的引物和使用PCR反应，可以在短时间内扩增出目标基因的DNA片段。
这些扩增的DNA片段可以被插入到表达载体中，进而在大量体外表达中使用。
3. 物种鉴定PCR技术在物种鉴定中也有应用。
通过选择一些特定的基因序列作为分子标记，我们可以通过扩增和测序这些序列来确定物种的身份。
这对于动植物的保护和种群遗传学研究非常重要。
常见分子生物学实验方法
常见分子生物学实验方法1.DNA/RNA提取DNA和RNA提取是进行分子生物学实验的第一步。
常见的提取方法包括酚/氯仿法、离心法、基于载体的提取等。
这些方法可以从细胞、组织或血液中提取出高质量的DNA或RNA用于后续实验。
2.PCR扩增聚合酶链反应（PCR）是一种常用的体外DNA扩增技术，用于复制特定DNA片段。
通过PCR，可以从少量的DNA样本中扩增目标序列，并与特异性引物一起进行扩增。
PCR具有高度特异性和灵敏度，广泛应用于基因克隆、基因检测和定量分析等领域。
3.基因克隆基因克隆是指将特定目标基因从一个有机体中分离并插入到另一个有机体中。
常见的基因克隆方法包括限制性内切酶消化、连接、转化、筛选等。
基因克隆可以用于生成重组DNA、构建表达载体、设计并构建突变基因、重组蛋白质等。
4.蛋白质表达和纯化蛋白质表达和纯化是研究蛋白质功能和结构的重要步骤。
常见的表达系统包括细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
表达后，通过亲和纯化、离子交换层析、凝胶过滤等手段纯化所得蛋白质。
5.基因敲除/敲入基因敲除或敲入是通过改变目标基因的DNA序列来研究基因功能的方法。
基因敲除可以通过CRISPR-Cas9系统、RNA干扰、转座酶介导的基因敲入等方法实现。
6.DNA测序DNA测序是分析DNA序列的方法。
常见的测序技术包括Sanger测序、下一代测序（包括Illumina、Ion Torrent、PacBio等）等。
DNA测序可以应用于基因组学、转录组学、评估其中一区域的突变等领域。
7.西方印迹西方印迹是一种蛋白质检测方法，用于检测和定量特定蛋白质的存在和表达水平。
通过电泳将蛋白质分离，然后转移到膜上，并使用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后通过酶标记二抗或荧光二抗的检测。
8.荧光定量PCR荧光定量PCR（qPCR）是一种用于定量分析DNA或RNA浓度的方法。
通过特异性引物、探针与目标序列的结合，实时检测并记录PCR扩增产物的信号，进而测定起始目标序列的数量。
分子生物学常用实验方法原理介绍
分子生物学常用实验方法原理介绍一、GST pull-down实验基本原理:将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
此方法简单易行,操作方便。
注：GST即谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)二、足印法（Footprinting）足印法（Footprinting）是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。
其原理为：DNA和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase（脱氧核糖核酸酶）分解，在对目的DNA 序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。
三、染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。
染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA 片段沉淀下来。
染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。
四、基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）技术基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。
病毒分子生物学鉴定常用技术
实验二十三病毒核酸检测常用技术（Techniques of Detecting Nucleic Acid of Viruses inCommon Use ）近年来随着分子生物学的发展，基因检测技术在微生物学实验室诊断中也取得了长足的进展。
由于部分病原微生物的基因组已成功地被克隆并进行了核苷酸序列测定，因此根据病原微生物的基因特点，应用分子生物学技术检测样品中有无相应病原微生物的核酸，从而可以特异、灵敏地判定标本中是否含有相应的病原微生物。
在微生物学的研究及感染性疾病的诊断中，最常使用的微生物核酸检测技术有PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术，现对病毒核酸（DNA、RNA）的分离、PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术的基本原理、操作方法、应用及影响因素等进行概述。
实验 1 PCR 检测传染性喉气管炎病毒核酸【目的要求】通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（DNA）的分离与PCR技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。
【基本原理】鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis, ILT)是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科的喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis Virus, ILTV)引起的一种急性上呼吸道传染病, 常表现呼吸困难、产蛋鸡产蛋下降和死亡, 是危害养鸡业发展的重要疫病之一。
但在临诊上极易与其它一些呼吸道疾病相混淆, 如禽流感、新城疫、传染性支气管炎、支原体感染等。
常规检测IL TV 的方法有病原分离鉴定和血清学试验, 这些方法虽经典，但费时且敏感性差, 不能检测亚临床感染, 而传染性喉气管炎潜伏感染是疾病的一种重要表现形式。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前比较快速、敏感、特异的检测手段，已被广泛应用在病毒核酸检测方面。
本实验以PCR方法检测鸡传染性喉气管炎病毒核酸为例，对PCR方法进行介绍。
病毒核酸的提取、扩增
注意事项
尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；
减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的 破坏，操作多在pH4-10的条件下进行；
减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高 温。机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌，使溶液快速地通过狭长 的孔道，细胞突然置于低渗液中，细胞爆炸式破裂以及DNA样本的反复冻 贮。这些操作细节在实验操作中应倍加注意。机械剪切作用的主要危害对 象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA。对分子量小的 环状DNA分子，如质粒DNA及RNA分子，威胁相对小些。高温如长时间煮沸， 除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏 作用。核酸提取过程中，一般在低温操作，但现在发现在室温快速提取与 低温提取，获得核酸的质量没有太大差异。
• 为了保证核酸结构与功能的研究，完整的 一级结构是最基本的要求，因为遗传信息 全部贮存在一级结构之中，核酸的一级结 构还决定其高级结构的形式以及和其它生 物大分子结合的方式
核酸的纯化应达到以下三点要求
1.核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机 溶剂和过高浓度的金属离子； 2. 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降到最低程度； 3. 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分 子时应去除RNA，反之亦然
分子实验步骤
RNA的提取包括Northern杂交在内的许多分子生物学实验均是以RNA为材料，mRNA的制备也需要一定质量的总RNA样品，RNA的数量、纯度与完整性将直接影响这些实验的结果。
RNA中rRNA的数量最多，占总量的80%～85%；tRNA及核内小分子RNA占15%～20%；mRNA仅占1%～5%。
由于各种rRNA、tRNA及核内小分子RNA的结构与功能已比较清楚，从基因克隆、表达与诊断的目的出发，目前对RNA的分离与纯化，主要集中在总RNA与mRNA上。
RNA制备的条件与环境为防止RNase对RNA 的水解，一要全力避免细胞外RNase的污染并抑制其活性，二要尽快地抑制细胞内RNase的活性并极力地去除RNase。
对广泛存在的细胞外RNase，应在RNA 制备的全过程中保持高度的警惕，并采取严格的措施以避免其污染和抑制其活性。
从RNA提取的初始阶段开始，就选择性地使用针对RNase的蛋白质变性剂（如酚、氯仿等有机溶剂以及强烈的胍类变性剂）、蛋白的水解酶（如蛋白酶K）和能与蛋白质结合的阴离子去污剂（如SDS、sarkosyl或脱氧胆酸钠等）并联合使用RNase的特异性抑制剂（如RNasin 与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的水解。
另外，在变性液中加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）等还原剂可以破坏RNase中的二硫键，有利于RNase 的变性、水解与灭活。
总RNA的分离与纯化由于RNase的影响，为获得完整的RNA分子，就必须在总RNA分离纯化的最初阶段，尽可能快地灭活胞内RNase的活性。
在β-巯基乙醇的协同作用下，高浓度的(异)硫氰酸胍可以极大极快地抑制RNase的活性，能从胰腺等富含RNase的组织细胞中分离出完整的RNA分子，目前已成为常规使用的试剂。
pH8.0的Tris饱和酚用于DNA的制备，但在RNA纯化时，应使用pH4.5～5.5的水饱和酸性酚，这既有利于DNA的变性又有利于RNA的分离。
病毒的研究方法
三、组织和细胞培养技术
指从机体中取出组织或细胞，模拟 机体内的生理条件在体外进行培养， 使之生存和生长。
1、组织培养的原理
组织培养主要是为病毒易感的组织细 胞提供一个良好的生存环境，使细胞 对环境产生适应性，获得生长繁殖的 能力。
群体培养（左）和克隆培养（右）
群体培养: 将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶 中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层。 克隆培养: 将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶 中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增 殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。
细胞病变效应（CPE）
由病毒增殖引起的细胞改变，称细胞病变 效应。
3、细胞培养的基本条件
细胞接种数：接种传代细胞一般为10—30万/ml 合成培养液：如Eagle氏液，RPMI1640， Eagle’s MEM。 酸碱度：细胞生长最适宜的PH范围是7.0–7.4。 温度：细胞培养的最适温度与细胞来源的动物体 温一致。 无菌条件 培养器皿的处理
聚合酶链反应（PCR） 转印杂交 ：Southern blot、Nouthern blot和Westhern blot 蛋白质组学：肽图谱 基因组学：核酸序列测定及基因功能 基因工程 ：抗病毒疫苗或抗病毒的大分子 多肽 、病毒载体
特点：相间无物质传递
离心
常用于病毒的纯化
A:等速度沉降，B:等密度沉降
2、传质分离
平衡分离过程：
蒸发、蒸馏、吸收、萃取、结晶、离子交换、吸附、 干燥、浸取、泡沫吸附等 传质分离 速率控制分离过程： 气体扩散 热扩散 电渗析 电泳 反渗透 微滤、超滤和纳滤
3、反应分离
可逆反应（如离子交换、反应萃取）；不 可逆反应（反应吸收、反应结晶）；分解 反应（生物分解、电化学反应、光化学反 应）等。
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Influenza virus, negative stain
X线晶体衍射法
分子生物学方法
Polymerase Chain Reaction (PCR)
ustcwhm@
Kary B. Mullis
*One Friday night I was driving, ……. My girlfriend, Jennifer Barnett, was asleep. I was thinking. ……. *However, shocking to me, not one of my friends or colleagues would get excited over the potential for such a process. *In September I did my first experiment. I like to try the easiest possibilities first. So one night I put human DNA and the nerve growth factor primers in a little screw-cap tube with an O-ring and a purple top. I boiled for a few minutes, cooled, added about 10 units of DNA polymerase, closed the tube and left it at 37°. It was exactly midnight on the ninth of September. *The first successful experiment happened on December 16th. I remember the date. It was the birthday of Cynthia, my former wife from Kansas City, who had encouraged me to write fiction and bore us two fine sons. I had strayed from Cynthia eventually to spend two tumultuous years with Jennifer.
PCR反应混合物
Mg Mn
2+
和 或
Taq DNA 多 聚 酶 rTth DNA 多 聚 酶 AmpErase
（UNG酶）
2+
和
dCTP dGTP dUTP dATP
引 物
1.Choice of Polymerases for PCR
DNA Polymerase Taq Amplitaq®
Amplitaq (Stoffel fragment)®
95 °C half-life 5'3' exo 3'5' exo Extension rate (nt/sec) RT activity Resulting ends Strand displacement M.W. (kDa)
40 min +
2.Buffers and MgCl2 in PCR reactions
Chorio-allaac Yolk sac
Allantoic fluid
组织培养技术
¾ 1949年John Enders等在原代人体细胞中繁殖出脊髓灰质炎 病毒； ¾ 组织培养技术促进了病毒疫苗的研究； ¾ 1952年，R. Dulbecco利用组织培养技术发展出空斑定量病 毒的方法，首次测定脊髓灰质炎病毒和西方马脑炎病毒的侵 染性颗粒。
Mg2+ ions: form a soluble complex with dNTP's which is essential for dNTP incorporation stimulate polymerase activity increase the Tm (melting temperature) of primer/template interaction (i.e. it serves to stabilize the duplex interaction Generally, low Mg2+ leads to low yields (or no yield) high Mg2+ leads to accumulation of nonspecific products (mispriming).
The Nobel Prize in Chemistry 1993 "for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry" "for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method"
病毒学研究方法
活的宿主体系 组织培养技术 血清学/免疫学方法 病毒超微结构的研究方法 分子生物学方法
活的宿主体系：植物、动物
¾ 起初的病毒学研究是建立在活的宿主体系之上的。 ¾ 动物宿主体系主要应用在生产不能体外繁殖的病毒、研究 病毒感染的病理作用、检测疫苗的安全性等。 ¾ 植物宿主体系目前应用仍较广泛
Natural or recombinant Natural Recombinant Recombinant Natural Natural Recombinant Recombinant Recombinant Natural Recombinant
Source Thermus aquaticus T. aquaticus T. aquaticus Thermus flavis T. flavis Thermococcus litoralis Pyrococcus GB-D Thermus thermophilus Pyrococcus furiosus Thermotoga maritima
A typical reaction buffer for PCR would something like: 10mM Tris, pH 8.3 50mM KCl 1.5mM MgCl2 0.01% gelatin
The MgCl2 concentration in the final reaction mixture is usually between 0.5 to 5.0mM, and the optimum concentration is determined empirically (typically between 1.0 - 1.5mM).
Fibroblasts in culture
Epithelial cells in culture
Cytopathic effect induced by adenoviruses
Uninfected cells
Infected cells
Measles virus - induced polykaryocytes
Hot Tub™ Pyrostase™ Vent™ Deep Vent™ Tth Pfu ULTma™
Properties of DNA polymerases used in PCR
Taq/ Amplitaq® Stoffel fragment 80 min Vent™ 400min Deep Vent™ 1380 min Pfu >120 min Tth 20 min + + 75 Weak 3' A >50 Weak 3' A >80 ? >95%blu nt + 94 61 ? + ? ? >95% blunt + ? 92 94 70 + 60 ? blunt >33 Yes 3' A + ? ? blunt ULTma™ >50 min
血清学/免疫学方法
• 免疫沉淀法 • 中和试验 • 补体结合试验 • 免疫荧光法 • 酶联免疫吸附测定法
Hemagglutination- inhibition assay
(Differentiates between members of the same group)
RBC
RBC + Virus
病毒学研究方法
诊断技术的发展历史
20世纪60、70年代 免疫学技术-电镜-动物实验-细胞培养: 20世纪80年代 分子生物学:
HBV，HAV ，HDV HCV ，HEV
1995年 美国GBV-C/HGV ？ 1997年 日本TTV (Transfusion Transimitted Virus) ？ 最近 SEN (在一位首写名为SEN的HIV静脉吸毒者患 者血液中发现了一种新的DNA病毒) ？
RBC + Virus + antibody to homologous virus
RBC + Virus + antibody to heterologous virus
病毒超微结构的研究方法
物理分析方法： 不同孔径的滤膜：测定病毒粒子的直径 超速离心：病毒粒子沉降特性的研究和纯化病毒 分光光度计：病毒的核酸、蛋白比率和物理学性质 电泳：从蛋白质和核酸分子水平分析病毒粒子的组成 X-射线晶体衍射技术：原子水平上测定病毒的结构 核磁共振 电子显微镜技术：病毒粒子的数量、病毒的三维外观和结构。 电子显微镜技术
¾ 20世纪初．鸡胚开始用于病毒的研究。 ¾ 1943，我国学者黄祯祥就开始利用鸡胚组织块在试管内进行 病毒传代、定量滴定及中和实验。 ¾ 1948-1955年，动物病毒的研究从利用实验动物整体过渡到 利用组织培养。小鼠、昆虫、鱼、猪、狗以及各种灵长类包括 人的Hela细胞系的体外培养相继建立。