第十四章 病毒学实验技术

第三篇病毒学实验技术

实验学时计划：实验一实验须知6小时；实验二细胞培养用水的制备及检验15小时；实验三组织培养技术20小时；实验四病毒的分离及其理化性质的测定20小时；实验五病毒提纯技术15小时。

实验一实验须知

一、实验室注意事项

1．凡参加病毒学实验的人员均应接种与实验有关的病毒疫苗。

2．实验室内，特别是组织培养操作室，须经常保持干燥、清洁。在进行病毒接种或无菌操作前后，均应用紫外线照射灭菌，必要时可用3～5%的酚或煤酚皂溶液擦拭或喷雾消毒。

3．进入操作室，须先洗净双手并用消毒药水严格消毒；更换拖鞋，戴口罩和帽子，穿消毒的实验服。

4．病毒实验操作完毕后，将所穿戴实验服、口罩、帽子和拖鞋等物，出操作室前须更换；两手须经消毒药水严格浸洗后方能外出。

5．一个接种操作室，严禁同时进行两株病毒株的传种；吸取病毒材料时，勿于悬空吹出或打出。

6．凡沾病毒材料的吸管、试管等器具，须随时投入5%煤酚皂或1%盐酸溶液内，浸泡过夜，或煮沸消毒后才能进行洗涤。

7．凡带有感染性的鸡胚或动物尸体，须立即投入炉内焚化或进行煮沸消毒，或盛入容器内进行高压消毒后，方能携出室外进行处理。

8．工作人员要随时注意安全操作，以免发生事故；如发生意外，应迅速采取有效措施补救。

二、病毒材料收集、运送和保存

（一）材料的收集

分离病毒的成功率与采集材料有密切的关系。采集病料必须在适当的部位和时间内进行，前者与各种传染的发病机理有关，后者常规在疾病早期，因为通常在疾病刚出现时病毒的滴度高。各种病毒感染所采适宜病料参见图1和图2。

由于许多病毒的不稳定性，欲作病毒分离的材料，都应尽快的冷藏。－30℃保存的病毒材料（除少数例外），至少可以活存几个月以上；而－70℃保存的病毒，甚至几年不见毒力降低。有些病毒需在潮湿环境下保存，有的则需干燥环境（如Orf virus）。

对于棉拭子标本，折断放入2 ml pH7.4等渗平衡盐溶液的小瓶内，内含0.2%的明胶或牛白蛋白，青霉素、链霉素每毫升含100 u、100 μg；对于粪便、脓汁、鼻液等分泌物或渗出物，除在等渗平衡盐溶液含高浓度青、链霉素〔1000 u（μg）/ml〕外，还加2.5 μg/ml 的两性霉素B(或40 μg/ml的制霉素）；对脑等组织材料可放在50%甘油缓冲液中。标本最好在冷藏的条件下尽快送到实验室。

病料要填写标签、临床病史和初步诊断。

（二）病毒材料的运送和保存

供分离病毒用的材料，要尽快送到实验室。如距离较远，可将熔封的材料容器放入冰筒，加冰块，盖严实后运送。如无法获得冰块时，可用冷水加入氯化铵（NH4Cl）按3：1的比例倒入冰筒内搅拌1-3分钟，使溶解后，再放入熔封的材料容器，封闭瓶口运送。

病毒材料的保存：病毒标本必需及时处理，接种动物或培养，否则应将标准保存在-25℃至-70℃的低温冰箱或-196℃的液氮中。病毒和病毒株真空干燥保存。

长期保存病毒，一般应用下述两种方法：

1．快速低温冰冻：于灭菌悬液中加入灭活的正常动物血清或其他蛋白保护剂，最好再加一些二甲基亚砜（5～10％），并迅速冷冻和保存于―70℃或―196℃。

含病毒的组织材料可以直接低温冰冻保存；先浸入50%的甘油缓冲液盐水中，再行低温保存，效果更好。

2．冷冻干燥：在真空条件下使冰冻的病毒悬液脱水。通常用低温脱水法，并以干燥剂或冷凝法除去凝器内尚未凝结的多余水汽。通常用的的干燥剂有五氧化二磷、硫酸钙、氯化钙和硅胶。

干燥毒种的保护剂，一般应用脱脂牛奶、灭活正常动物血清、饱和蔗糖溶液等。真空干燥时，将病毒悬液与5－10倍量的保护剂混合，分装安瓶，每支0.2～0.5 ml，立即放入事先预冷的－30℃～－40℃酒精中冻结1～2 h，随后迅速置于盛有干燥剂的干燥器内，立即抽气干燥。充分干燥后，打开干燥器取出毒种安瓶，再抽真空并封口。这样冻干的毒种，一般可在4℃冰箱内保存几年至十年以上。

以上冷冻干燥可在真空干燥机里进行，十分方便。

（三）病料的处理

1．咽喉拭子：放入盛有2～5ml Hanks液的容器内，内含2%犊牛血清和相应浓度（200～500 u或μg/ml）的青、链霉素。通过机械震动，并反复冻融3～5次后，以2000 rpm离心10～20分钟取上清液即可。

2．脑、肝、肌肉等器官或组织：充分剪碎后置乳钵中加石英砂（或玻璃砂）研磨，或置组织研磨器磨碎而制成1︰10的悬液，常用稀释液有pH7.2～7.6的PBS，pH7.2～7.6的肉汤，10%脱脂乳盐水，0.5%乳汉液（乳蛋白-Hanks液），每毫升含有青、链霉素200 u或200 μg。反复冻融3～5次（－20℃下的酒精中迅速冰冻，37℃温水中融化）后，以2000 rpm 离心取上清即可。如中性甘油保存的标本，先用生理盐水冲洗后再研磨。

3．鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物：用含青、链毒素的Hanks液（每ml含1000 u或1000 μg）将其稀释3～5倍，充分混匀悬浮后，置4℃冰箱内过夜，离心取上清。

4．粪便：用含青、链毒素（1000 u或1000 μg/ml），含2%犊牛血清的Hanks液，4℃

过夜，离心取上清。

5．无菌的体液或鸡胚液等：不作任何处理，可直接用于接种。

Orf virus的复壮、收毒及保存

一、病毒液的制备

取脓疱痂皮，充分剪碎置乳钵中加玻璃砂（或石英砂）研成粉末，用pH7.2的PBS或生理盐水按1︰10比例制成悬液，内含500 u和500 g的青、链霉素，－20℃，37℃反复冻融3次，2000 rpm以上离心后，取上清液进行无菌检验（需氧和厌氧培养24小时以上）后即可。

二、易感动物

从非疫区选用1周岁以下的绵羊羔，越小越好。

三、接种动物

1．动物准备：先将羊腹下和股内侧剪毛、脱毛，用水洗刷干净，再用灭菌水冲洗一次，擦干。

2．在羊腹下和股内侧皮肤上用灭菌针头连续划痕，以不划透皮肤，刚见到一点血丝为好。

3．将前所制备的病毒液涂擦在划痕处，均匀涂布，完毕后，等水份蒸发干后，将放开。

4．感染羊要隔离饲养严防散毒。

四、采毒时间及方法

羊感染后一般在3～4天后开始出疹，4～6天后出现水疱，6～8天后出脓疱。采毒可在水疱期－脓疱期之间进行，当完全化脓，甚至结痂之后病毒滴度下降。

采毒方法直接用刀片刮下皮痂，装入灭菌容器内，写明标签。

五、保存

本病毒耐干燥，在保存中，将装病料的容器置于装有干燥剂（如氯化钙）的容器内，密封，置于低温冰箱或超低温冰箱保存。保存时间可达一年以上，2年时还有一定毒力。据有些书籍记载可存活15年之久。

附：真空冰冻干燥法，可见《新实验病毒学》P22～23。

参考文献

1．戴华生等编著. 新实验病毒学.中国学术出版社，1983，20～23

2．殷震，刘景华. 动物病毒学（第一版）.科学出版社，1985，275～276