枯草芽孢杆菌对免疫和未免疫黄河鲤免疫功能和抗病力的影响[1]

动物营养学报2013，25（7）：1559-1567Chinese Journal of Animal Nutritiondoi ：10．3969/j．issn．1006-267x．2013．07．021枯草芽孢杆菌对免疫和未免疫黄河鲤免疫功能和抗病力的影响殷海成赵红月黄进贾峰（河南工业大学生物工程学院，郑州450001）摘要：本试验旨在研究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )对免疫和未免疫黄河鲤免疫功能和抗病力的影响。

选择初始平均体重为(35．36ʃ0．46)g 的黄河鲤1920尾，随机分为8组(Ⅰ Ⅷ组)，每组3个重复，每个重复80尾。

Ⅰ Ⅳ组为注射抗原的免疫组，Ⅴ Ⅷ组为注射无菌生理盐水的对照组。

试验饲料中枯草芽孢杆菌的添加量分别为0(Ⅰ、Ⅴ组)、1．5ˑ1011(Ⅱ、Ⅵ组)、3．0ˑ1011(Ⅲ、Ⅶ组)、4．5ˑ1011CFU /kg (Ⅳ、Ⅷ组)。

各组试验鱼在投喂试验饲料28d 后，改喂基础饲料28d 。

于免疫后第7、14、21、28、35、42天测定各组试验鱼的白细胞吞噬活性、血清溶菌酶活性和血清抗体效价。

于免疫后第42天采用嗜水气单孢菌对各组试验鱼进行攻毒，14d 后统计各组的死亡率，计算免疫保护率。

结果表明:饲料中添加枯草芽孢杆菌能显著提高免疫和未免疫黄河鲤的白细胞吞噬百分比和吞噬指数以及血清溶菌酶活性(P ＜0．05)。

Ⅲ组黄河鲤的血清抗体效价最高，其几何平均值为486．7;其次是Ⅳ组，为372．6;再次是Ⅱ组，为234．6;而Ⅰ组最低，为192．8。

免疫组黄河鲤均获得了一定的免疫保护率，以枯草芽孢杆菌添加量为4．5ˑ1011CFU /kg 时的免疫保护率最高。

由此得出，在本试验条件下，饲料中添加枯草芽孢杆菌可提高免疫和未免疫黄河鲤的免疫功能和抗病力，建议添加量为3．0ˑ10114．5ˑ1011CFU /kg 。

关键词：枯草芽孢杆菌;黄河鲤;抗原;免疫功能;抗病力中图分类号：S963文献标识码：A 文章编号：1006-267X （2013）07-1559-09收稿日期：2013－01－04基金项目：河南省自然科学基础与前沿技术研究项目，黄河鲤专用肉品质改善饲料添加剂的研发（112300410079）作者简介：殷海成（1964—），男，河南汝南人，副教授，硕士生导师，硕士，主要从事水产动物营养与繁育技术研究。

E-mail ：yhch007@126．com黄河鲤是河南省水产科学研究院自1985年经连续8代的系统选育而培养出的优良养殖品种（品种登记号：GS01-001-2004）。

近10年来，随着黄河鲤养殖的迅速发展，各种病害也随之增加，使得抗生素的使用逐渐增多，危害人类健康。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）是被农业部认定的鱼类饲料益生菌添加剂，因其具有无残毒、无抗药性、不污染环境等优点在水产养殖业中被广泛使用。

Shen 等［1］对大菱鲆（Scophthatmus maximus ）仔鱼、Ziaei-Nejad 等［2］对印度明对虾（Fennero-penaeus indicus ）、Nayak 等［3］对露斯塔野鲮（Labeorohita ）的研究均表明，在饲料中添加枯草芽孢杆菌能提高免疫功能，增强抗病力。

目前，有关枯草芽孢杆菌对黄河鲤免疫功能和抗病力的研究较少。

因此，本试验拟在黄河鲤饲料中添加枯草芽孢杆菌，探讨其对免疫和未免疫黄河鲤免疫功能和抗病力的影响，为枯草芽孢杆菌在该鱼种养殖中的应用提供理论依据。

1材料与方法1．1抗原和吞噬原的制备依据郭玉娟等［4］的方法分别将本实验室保存动物营养学报25卷的鲤源嗜水气单孢菌（Aeromonas hydrophila，A．hydrophila）、黄色葡萄球菌（Staphylococcus au-reus，S．aureus）接种在淡水琼脂（FWA）培养基中，28ħ培养36h后，富集菌株备用。

然后在富集的菌株悬液中加入终浓度为0．5%的福尔马林，28ħ灭活24h，即为福尔马林灭活的A．hydrophi-la菌苗（抗原）和S．aureus菌体（吞噬原）。

经平皿法证实菌株已被彻底灭活后，置4ħ冰箱中保存备用。

1．2试验饲料1．2．1菌株培养用普通肉汤琼脂培养基，采用固体平板法培养枯草芽孢杆菌。

首先将枯草芽孢杆菌（本实验室保存）从保种斜面上转接于普通肉汤琼脂培养基中，培养18h后，再将培养的菌液接种在固体平板上，培养24h后收集菌体，加入适量的碳酸钙载体，55ħ烘干，稀释法检测菌粉活菌数，制作枯草芽孢杆菌菌粉（活菌数为1．0ˑ1010CFU/g）。

1．2．2饲料配制根据鲤鱼配合饲料营养标准（SC/T1026—1998）配制基础饲料，其组成及营养水平见表1。

在基础饲料中分别添加0、1．5ˑ1011、3．0ˑ1011、4．5ˑ1011CFU/kg的枯草芽孢杆菌，制成4种试验饲料。

将试验饲料中各原料充分拌匀后，用SZLH系列高档水产制粒机（洛阳市洛达特机械设备有限公司）加工成直径为2．0mm的颗粒饲料，于45ħ下烘干，－4ħ保存备用。

1．3试验设计与饲养管理试验用黄河鲤购于河南省水产科学研究院种鱼繁殖场。

选择体格健壮、平均体重为（35．36ʃ0．46）g的黄河鲤1920尾，随机分为8组（Ⅰ Ⅷ组），每组设3个重复，每个重复80尾，以重复为单位饲养于规格为2mˑ2mˑ1m的水泥池中。

以0．65%的无菌生理盐水将灭活的A．hy-drophila菌苗浓度调整为1ˑ108mL－1后，对Ⅰ Ⅳ组试验鱼以0．2mL/尾的剂量进行腹腔注射，作为免疫组；Ⅴ Ⅷ组试验鱼以0．2mL/尾的剂量腹腔注射无菌生理盐水，作为对照组。

免疫注射后，试验鱼分别投喂枯草芽孢杆菌添加量为0（Ⅰ、Ⅴ组）、1．5ˑ1011（Ⅱ、Ⅵ组）、3．0ˑ1011（Ⅲ、Ⅶ组）、4．5ˑ1011CFU/kg（Ⅳ、Ⅷ组）的试验饲料；投喂28d后，所有试验鱼均改投Ⅰ或Ⅴ组的试验饲料，即基础饲料。

表1基础饲料组成及营养水平（风干基础）Table1Composition and nutrient levels ofthe basal diet（air-dry basis）%项目Items含量Content原料Ingredients鱼粉Fish meal20．50豆油Soybean oil1．25豆粕Soybean meal25．30菜籽粕Rapeseed meal20．00小麦麸Wheat bran12．25玉米蛋白粉Corn gluten meal12．50α－纤维素α-cellulose4．15氯化胆碱Choline chloride0．50维生素预混料Vitamin premix1）1．50矿物质预混料M ineral premix2）1．50DL－蛋氨酸DL-M et0．25L－赖氨酸L-Lys0．30合计Total100．00营养水平Nutrient levels粗蛋白质CP36．20粗脂肪EE5．03粗灰分Crude ash6．90粗纤维CF8．14 1）维生素预混料为每千克饲料提供The vitamin premix provided the follow ing per kg of the diet：VA5000IU，VD3 1000IU，VE30IU，VK2．5mg，VB15mg，VB28mg，VB6 7mg，VB120．01mg，VC35mg，烟酸nicotinic acid30mg，D－泛酸D-pantothenic acid25mg，叶酸folic acid0．5mg，生物素biotin0．2mg，肌醇inositol50mg。

2）矿物质预混料为每千克饲料提供The mineral premix provided the follow ing per kg of the diet：M n（as manganese sulfate）10mg，Zn（as zinc sulfate）30mg，Fe（as ferrous sulfate）60mg，Cu（as copper sulfate）3mg，I（as potassium iodide）1mg，Se（as sodium selenite）0．2mg。

试验鱼分组后先驯养2周，再进行为期56d 的正式试验，试验于2012年7月1日开始，至2012年8月25日结束。

在整个试验期间，水质为曝气自来水，采用自动循环微流水系统，保持溶氧6．0mg/L，pH6．8左右。

每日饲喂2次（08：00—08：30、17：30—18：00），每日投喂量为鱼体重的4．0% 4．5%。

1．4样品采集于投喂枯草芽孢杆菌前（第0天）和投喂后的第7、14、21、28天及停止投喂枯草芽孢杆菌后的第7、14天（即试验第35、42天）的相同时间内进行血样收集。

每重复取6尾鱼，尾动脉取血；取血06517期殷海成等：枯草芽孢杆菌对免疫和未免疫黄河鲤免疫功能和抗病力的影响后，将每尾鱼的血液分成2份，1份置室温1h，再置4ħ冰箱内4h，以3000r/min离心15min分离血清，供检测溶菌酶活性；另1份以肝素抗凝，供测定白细胞吞噬活性。

在相同时间以同样方法对每重复4尾鱼取血制备抗血清，用于测定血清抗体效价。

1．5指标测定1．5．1白细胞吞噬活性测定参照孟小亮等［5］介绍的方法统计细胞数，并按下式计算白细胞的吞噬百分比（phagocytic per-centage，PP）和吞噬指数（phagocytic index，PI）。

PP（%）=（100个白细胞中参与吞噬的细胞数/100）ˑ100；PI=被吞噬的细菌数/吞噬细菌的细胞数。

1．5．2血清溶菌酶活性测定采用溶菌酶试剂盒（南京建成生物工程研究所产品）测定。

1．5．3血清抗体效价测定采用96孔V型血凝板按常规方法进行，反应抗原为福尔马林灭活的A．hydrophila菌苗。

具体操作如下：取96孔微量滴定板，用微量移液管于第1孔中加入80μL生理盐水，其余各孔分别加50μL生理盐水；向第1孔中加入20μL的抗血清，吹吸混匀后取50μL加入到第2孔中，同样方法加入到第3孔中，依此类推至倒数第2孔，弃去50μL，最后1孔作为对照孔；将A．hydrophila培养液12000r/min离心后用等量生理盐水重悬，将菌悬液置于37ħ，水浴加温0．5h；向每个孔中加入50μL菌悬液，吹吸混匀，置于37ħ培养箱中1h，之后移至4ħ冰箱12h，用显微镜观察凝集反应的强度。

1．6攻毒试验于免疫后第42天采用A．hydrophila（1ˑ108个mL－1）对各组试验鱼进行攻毒。

每组分别取试验鱼40尾进行攻毒试验，按每千克体重注射3．5mL A．hydrophila活菌悬液计算，经胸鳍基部注射0．2mL（体重不同时，进行微调）。