RNA加工与核糖核蛋白复合体
分子生物学问题汇总
Section A 细胞与大分子简述复杂大分子的生物学功能及与人类健康的关系。
Section C 核酸的性质1.DNA的超螺旋结构的特点有哪些？A 发生在闭环双链DNA分子上B DNA双链轴线高卷曲，与简单的环状相比，连接数发生变化C 当DNA扭曲方向与双螺旋方向相同时，DNA变得紧绷，为正超螺旋，反之变得松弛为负超螺旋。
自然界几乎所有DNA分子超螺旋都为负的，因为能量最低。
2.简述核酸的性质。
A 核酸的稳定性：由于核酸中碱基对的疏水效应以及电荷偶极作用而趋于稳定B 酸效应：在强酸和高温条件下，核酸完全水解，而在稀酸条件下，DNA的核苷键被选择性地断裂生成脱嘌呤核酸C 碱效应：当PH超出生理范围时（7-8），碱基的互变异构态发生变化D 化学变性：一些化学物质如尿素，甲酰胺能破坏DNA和RNA二级结构中的而使核酸变性。
E 粘性：DNA的粘性是由其形态决定的，DNA分子细长，称为高轴比，可被机械力和超声波剪切而粘性下降。
F 浮力密度：1.7g/cm^3,因此可利用高浓度分子质量的盐溶液进行纯化和分析G 紫外线吸收：核酸中的芳香族碱基在269nm 处有最大光吸收H 减色性，热变性，复性。
思考题：提取细菌的质粒依据是核酸的哪些性质？质粒是抗性基因，，在基因组或者质粒DNA中用碱提取法。
Sectio C 课前提问1.在 1.5mL的离心管中有500μL，取出10 μL稀释至1000 μL后进行检测，测得A260=0.15。
问（1）：试管中的DNA浓度是多少？问（2）：如果测得A280=0.078, .A260/A280=？说明什么问题？(1)稀释前的浓度：0.15/20=0.0075稀释后的浓度：0.0075/100=0.75ug/ml（2）0.15/0.078=1.92〉1.8，说明DNA中混有RNA样品。
2.解释以下两幅图（native:非变性的；denatured:变性的）图一表示dsDNA和RNA的热变性，中间的Tm值表示解链温度。
「端粒酶-是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合体属于反转录酶」
端粒酶-是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合体,属于反转录酶端粒酶-是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合体，属于反转录酶。
端粒酶以自身的ＲNA作为端粒DNA复制的模板，合成出富含脱氧单磷酸鸟苷的DNＡ序列后添加到染色体的末端并与端粒蛋白质结合，从而稳定了染色体的结构。
学术术语来源---人端粒酶反转录酶基因转染人胚胎大脑皮质神经元的凋亡文章亮点:1 既往对阿尔茨海默病研究多局限于动物实验，实验采用原代培养的人胚胎大脑皮质神经元模型,更具有实际意义。
2 实验的特点在于采用原代培养的人胚胎大脑皮质神经元为研究模型，观察人端粒酶反转录酶对β淀粉样蛋白诱导的人胚胎大脑皮质神经元细胞凋亡的影响，利用TUNEＬ法证实人端粒酶反转录酶可防止Aβ２5-3５诱导的人胚胎大脑皮质神经元的凋亡。
关键词：组织构建；组织工程;干细胞;胚胎干细胞;人端粒酶催化亚基；诱导；人胚胎大脑皮质神经元；阿尔茨海默病；凋亡;端粒酶;反转录酶;转染主题词：大脑皮质;细胞凋亡;端粒;端粒结合蛋白质类；转染摘要背景:人端粒酶反转录酶重组腺病毒转染原代培养的人胚胎大脑皮质神经元,可以促进细胞生存,抑制凋亡。
目的：观察人端粒酶反转录酶对β淀粉样蛋白(aｍyloid β－proｔeｉｎ,Aβ)诱导人胚胎大脑皮质神经元凋亡的影响。
方法：人胚胎大脑皮质神经元原代培养后,分为3组：对照组、Ａβ25-3５组和人端粒酶反转录酶组。
Aβ2５-35组和人端粒酶反转录酶组细胞在培养144 ｈ后，用Aβ25-35 5 μmol/L干预24 h。
人端粒酶反转录酶组在Aβ２5－355 μmoｌ/Ｌ干预72 h进行人端粒酶反转录酶基因转染。
结果与结论:原代培养的人胚胎大脑皮质神经元培养7 d后，出现凋亡细胞,而Aβ25-３5干预后使凋亡细胞数量增加,而人端粒酶反转录酶可防止Ａβ２5-3５诱导的人胚胎大脑皮质神经元的凋亡。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程。
RNA转录和加工
套索结构的发现使人们认识到， 套索结构的发现使人们认识到，内含子的剪接是通过 两次转酯反应完成的。在第一次转酯反应中， 两次转酯反应完成的。在第一次转酯反应中，分支位 进攻5 剪接位点， 点A的2’－OH进攻5’剪接位点，使其断裂，同时这个A －OH进攻 剪接位点 使其断裂，同时这个A 与内含子的第一个核苷酸（ 形成2 与内含子的第一个核苷酸（G）形成2’ ， 5’ －磷酸 二酯键，内含子自身成环，形成套索结构。 剪接位 二酯键，内含子自身成环，形成套索结构。3’剪接位 点的断裂依赖于第二次转酯反应。上游外显子的3 － 点的断裂依赖于第二次转酯反应。上游外显子的3’－ OH末端攻击3 剪接位点的磷酸二酯键 促使其断裂， OH末端攻击3’剪接位点的磷酸二酯键，促使其断裂， 末端攻击 剪接位点的磷酸二酯键， 使上游外显子的5 －0H和下游外显子的 － 和下游外显子的5 使上游外显子的5’－0H和下游外显子的5’－磷酸基团 连接，并释放出内含子，完成剪接过程。 连接，并释放出内含子，完成剪接过程。被切除的内 含子随后变成线性DNA 随即被降解。 DNA， 含子随后变成线性DNA，随即被降解。
通过分析体外剪接反应中形成的中间体， 通过分析体外剪接反应中形成的中间体，发现内含子 是以一种套索结构（ 是以一种套索结构（lariat structure ）的形式被切除 即内含子5 端的鸟苷酸依靠 ， － 端的鸟苷酸依靠2 的，即内含子5’端的鸟苷酸依靠2’，5’－磷酸二酯键与 靠近内含子3 末端的一个腺苷酸连接在一起 末端的一个腺苷酸连接在一起。 靠近内含子3’末端的一个腺苷酸连接在一起。该腺苷 酸被称作分支位点 分支位点， 酸被称作分支位点，因为在套索结构中它形成了一个 RNA分支 分支。 RNA分支。
在内含子的剪接过程中， 在内含子的剪接过程中，剪接装置必须识别正确的 剪接位点，以保证外显子在剪接的过程中不被丢失， 剪接位点，以保证外显子在剪接的过程中不被丢失， 同时荫蔽的剪接位点要被忽略。 同时荫蔽的剪接位点要被忽略。所谓隐蔽剪接位点 （cryptic splice site ）是指与真正的剪接位点 相似的序列。已经知道一类被称为SR蛋白（ 相似的序列。已经知道一类被称为SR蛋白（SR SR蛋白 protein）的剪接因子在剪接位点的选择中发挥重要 protein） 作用。 作用。
核糖核蛋白复合体递送方式
核糖核蛋白复合体递送方式
核糖核蛋白复合体（RNP复合体）的递送方式有多种，具体取决于目标细胞和递送目的。
1. 直接入细胞：RNP复合体可以通过某些方法直接注射到目标细胞中。
这种方式非常直接，尤其适用于体外实验室研究。
然而，在体内应用时，由于细胞膜的存在，直接注射方法存在较大的难度和限制。
2. 载体介导递送：RNP复合体可以通过与合适的递送载体结合来进入目标细胞。
递送载体可以是病毒向量、脂质体、聚合物或纳米颗粒等。
这些载体可以提供负电荷、亲水性或靶向配体，以促进RNP复合体的递送。
例如，利用病毒向量作为载体，可以将RNP复合体装载入病毒颗粒中，利用病毒的感染能力将RNP复合体引入细胞内。
3. 目标细胞摄取：RNP复合体可以通过目标细胞主动摄取来进入细胞内。
例如，在体外培养的细胞中，可以将RNP复合体与细胞培养介质一起添加到细胞培养皿中，细胞通过摄取培养液中的RNP复合体来获取其功能。
4. 利用启动子或信号序列：RNP复合体可以通过与特定细胞启动子或信号序列结合，实现靶向递送。
例如，小干扰RNA （siRNA）和microRNA（miRNA）可以与特定细胞系列的启动子或miRNA结合，形成RNP复合体，然后通过细胞识别相应的启动子或miRNA序列，将RNP复合体递送到特定的细胞类型中。
总之，通过以上不同的方式，可以有效地将RNP复合体递送到目标细胞中，实现其功能。
不同的递送方式适用于不同的研究或治疗目的，选择合适的递送方式对于实现预期的效果非常重要。
RNA转录后的剪切与加工
45S rRNA
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•加工步骤：
（1）rRNA基因转录产生47S前rRNA初生转录物 （2）切除掉外部转录间隔区（ETSs，external transcribed
spacers), 形成45S前rRNA （3） 再切去内部转录间隔区（ITSs, internal transcribed
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剪切与加尾过程： 1）特定蛋白因子识别序列元件并与mRNA结合，形成复 合体后即开始剪切。 2）聚腺苷酸聚合酶（PAP）在剪切后的3‘端加上多至250 个的A残基。
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poly A尾巴的功能： 1）稳定mRNA分子，抵抗3’-端外切酶攻击的作用。 2）有助于细胞质中成熟mRNA的翻译。
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作业：请填写下表的真核生物RNA
•以真核生物酵母菌tRNATyr的加工为例 •tRNATyr的前体5‘端有16nt的前导区，3’ 端有2个额外的核苷酸，有一个14nt的 内含子（右图） •初转录物前体形成特征茎环结构
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酵母菌tRNATyr的加工过程： （1）内切酶识别茎环结构切去5‘端前导区和3’端额外的
2个核苷酸。
（2）在tRNA核苷转移酶的作用下在3‘端加上5’-CCA-3‘成为 成熟的3’端。
1rrna基因转录产生47s前rrna初生转录物2切除掉外部转录间隔区etssexternaltranscribedspacers形成45s前rrna再切去内部转录间隔区itssinternaltranscribedspacers形成41s前rrna4释放出32s和20s的前rna5进一步修剪形成成熟的rrna包含了58srrna18srrna28srrna23mammalianprerrnaprocessingrnasernasernasernase24真核生物的trna加工trnaprocessingeukaryotes?以真核生物酵母菌trnatyr的加工为例?trnatyr的前体5端有16nt的前导区3端有2个额外的核苷酸有一个14nt的内含子右图?初转录物前体形成特征茎环结构25酵母菌trnatyr的加工过程
RNA转录后的加工与修饰
第二节RNA转录后的加工与修饰不论原核或真核生物的rRNAs都是以更为复杂的初级转录本形式被合成的，然后再加工成为成熟的RNA 分子。
然而绝大多数原核生物转录和翻译是同时进行的,随着mRNA开始的DNA上合成，核蛋白体即附着在mRNA上并以其为模板进行蛋白质的合成，因此原核细胞的mRNA并无特殊的转录后加工过程，相反,真核生物转录和翻译在时间和空间上是分天的,刚转录出来的mRNA是分子很大的前体，即核内不均一RNA.hnRNA 分子中大约只有10％的部分转变成成熟的mRNA，其余部分将在转录后的加工过程中被降解掉。
（一）mRNA的加工修饰原核生物中转录生成的mRNA为多顺反子,即几个结构基因,利用共同的启动子和共同终止信号经转录生成一条mRNA，所以此mRNA分子编码几种不同的蛋白质.例如乳糖操纵子上的Z、Y及A基因,转录生成的mRNA可翻译生成三种酶，即半乳糖苷酶，透过酶和乙酰基转移酶。
原核生物中没有核模，所以转录与翻译是连续进行的，往往转录还未完成，翻译已经开始了，因此原核生物中转录生成的mRNA没有特殊的转录后加工修饰过程。
真核生物转录生成的mRNA为单顺反子,即一个mRNA分子只为一种蛋白质分子编码。
真核生物mRNA的加工修饰，主要包括对5’端和3’端的修饰以及对中间部分进行剪接。
1．在5’端加帽成熟的真核生物mRNA，其结构的5’端都有一个m7G—PPNmN结构,该结构被称为甲基鸟苷的帽子。
如图17-9所示.鸟苷通过5’—5’焦磷酸键与初级转录物的5’端相连。
当鸟苷上第7位碳原子被甲基化形成m7G-PPNmN时，此时形成的帽子被称为“帽0”,如果附m7G-PPNmN外，这个核糖的第“2”号碳上也甲基化，形成m7G-PPNm，称为“帽1”，如果5'末端N1和N2中的两个核糖均甲基化，成为m7G—PPNmPNm2，称为“帽2”.从真核生物帽子结构形成的复杂可以看出，生物进化程度越高，其帽子结构越复杂。
分子生物学--名词解释(全)
1. 半保留复制（semiconservative replication）：DNA复制时，以亲代DNA的每一股做模板，以碱基互补配对原则，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为半保留复制。
2. 复制子replicon：由一个复制起始点构成的DNA复制单位。
57. 复制起始点(Ori C)DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸序列顺序的片段，即复制起始点。
24.（35）复制叉（replication fork）是DNA复制时在DNA链上通过解旋、解链和SSB蛋白的结合等过程形成的Y字型结构称为复制叉。
3. Klenow 片段klenow fragment：DNApol I（DNA聚合酶I）被酶蛋白切开得到的大片段。
4. 外显子exon、extron：真核细胞基因DNA中的编码序列，这部分可转录为RNA，并翻译成蛋白质，也称表达序列。
5.（56） 核心启动子core promoter：指保证RNA聚合酶Ⅱ转录正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游TATA区。
（Hogness区）6. 转录（transcription）：是在 DNA的指导下的RNA聚合酶的催化下，按照硷基配对的原则，以四种核苷酸为原料合成一条与模板DNA互补的RNA 的过程。
7. 核酶（ribozyme）：是具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂，可降解特异的mRNA序列。
8.（59）信号肽signal peptide：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列（有时不一定在N 端）。
9. 顺式作用元件（cis-acting element）：真核生物DNA中与转录调控有关的核苷酸序列，包括增强子、沉默子等。
10.错配修复（mismatch repair，MMR）：在含有错配碱基的DNA 分子中，使正常核苷酸序列恢复的修复方式；主要用来纠正DNA双螺旋上错配的碱基对，还能修复一些因复制打滑而产生的小于4nt的核苷酸插入或缺失。
RNA的种类及其作用解析
端粒酶RNA
端粒酶是一种逆转录酶，是染色体端粒的RNA序列。
功能: 端粒酶是真核生物端粒复制的模板，它可以 使 用其部分RNA作为模板来合成端粒重复单元。在大多 数真核生物中，染色体末端DNA的逐步丢失会被端粒 酶所抑制。在具有端粒酶活性的细胞内，它的任务是 作为反转录的模板然后加在端粒的末端以解决染色体 因复制而变短的问题。这种酶在大多数细胞里是没有 活性的，但在某些肿瘤细胞，转化细胞，干细胞以及 生殖细胞里活性较高。
RNA的种类及其作用
——遗传学
1.RNA的种类 2.各类RNA的作用
RNA的常见种类
1.核糖体RNA（rRNA） 2.转运RNA（tRNA） 3.信使RNA （mRNA）
RNA的其他种类
1.不均一核RNA（hnRNA） 2.小核RNA（snRNA） 3.核仁小RNA（snoRNA） 4.小胞质RNA（scRNA/7s-RNA) 5.microRNA 6.转移-信使RNA（tmRNA） 7.端粒酶RNA 8.反义RNA ……各类RNA的作用来自核糖体RNA（rRNA）
1. rRNA是核糖体的组成成分 rRNA一般与核糖体蛋白质结合在一起, 形成核糖体 （ribosome) 如果把rRNA从核糖体上除掉, 核糖体的结 构就会发生塌陷。
2. 定位（起始翻译） 16 S的rRNA3’端有一段核苷酸序列与mRNA的前导序 列是互补的, 这有助于mRNA与核糖体的结合, 进而起 始翻译。
体经过Dicer酶加工后生成。不同于siRNA（双链），但是和siRNA
密切相关。
功能: microRNA通过与相应的蛋白结合，形成一个“RNA诱导的 转录沉默复合体”。该复合体主要有4个作用: 1.降解靶mRNA；2. 抑制mRNA的翻译；3.在细胞核内募集组蛋白脱乙酰化酶等因子， 沉默DNA的表达；4.扩增相应的microRNA。
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• 在原核和真核生物中均有发现。
• 真核生物中RNase P位于核内，是一种核 内小分子RNP（snRNP)。
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2 .真核生物的tRNA加工
• 真核生物酵母菌tRNA前体含有： • 一个16nt 5’端前导区 • 一个14nt 内含子 • 两个额外的3’端核苷酸
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• 初生的转录物形成一个具有特征茎环的 二级结构，内切酶正是识别这种结构并 切除5’端前导区和2个额外的3’端核苷酸。
• 3’端的两个核苷酸被切除后，tRNA核酸 转移酶将5’-CCA-3’序列添加到tRNA的3’ 端，产生出成熟的tRNA3’端。（原核生 物成熟tRNA3’端的CCA是基因编码的， 但真核生物编码tRNA不属于这种情况）
• 切除内含子，由内切酶将内含子两端切 除后，再将两个半个的tRNA分子连接在 一起。
• 运用紫外光照射经过和和未经过化学试 剂交联的交联实验，可以显示出哪一部 分RNA与蛋白分子在复合体中是紧密结 合在一起的
• 中子和X射线最终可以给出RNP完整的三 维结构
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5. 原核生物的核糖体
• 大肠杆菌核糖体占干重的25%（总蛋白 的10%和总RNA的80%）。
• 70S核糖体约为2750KD • 由一个50S大亚基和一个30S小亚基组成
• 转录物通过内部互补序列间的碱基配对 折叠形成一些茎环结构。
• 茎环结构的形成使得一些蛋白与之结合 形成核糖核蛋白复合体（RNP）。
• 在结合完成以后，一些修饰就开始了。
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3. 真核生物rRNA的加工
• 真核生物中的rRNA也是由一个长的单链 前体分子经过特定的修饰和剪切步骤后 形成
• 过程还不是十分清楚
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二、tRNA的加工、RNA酶P和核酶
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tRNA 3-D structure
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1. 原核生物的tRNA加工
• 成熟的tRNA分子可以从操纵子的前体 转录物加工
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初级转录本
RNase D,E,F and P 具有成熟末端的tRNA
碱基修饰 成熟的 tRNA
B. 向初生RNA转录物或剪切产物的3’端 和5’端添加核苷酸
C. 向某些特殊的核苷酸碱基或糖苷进行 修饰
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RNA processing
Cytoplasm Nucleus or Nucleolus
primary transcript
Romoval of nucleotides
addition of nucleotides to the 5’- or 3’- ends
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• 核糖体是最大且最复杂的RNP，在加工 过程中由rRNA和特定的核糖体蛋白复合 而成。
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• 用于研究RNP的方法有：
• 分离可将RNP纯化后分解为RNA分子与蛋白， 应结合在一起的规则， 如果这些组分可以被修饰，就可以获得一些关 于它们各自功能的线索
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6. 真核生物的核糖体
• 80S核糖体由一个60S大亚基和一个40S小 亚基
• 大亚基包含大约45种蛋白、一个5S rRNA 分子、一个5.8 S rRNA及一个28S rRNA 分子（后两者相当于原核生物23S rRNA)
• 小亚基包含18S rRNA和大约30种不同蛋 白。
• 每秒总共可以生成约100万个肽键。
第十章 RNA加工与核糖核蛋 白复合体
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1
一、rRNA加工与核糖体
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2
1. RNA的加工类型
• 成熟的RNA分子很少是转录形成的 • 大多数新生RNA分子经历多种修饰才成
为成熟的产物
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3
• RNA加工是对初生转录物进行修饰的 总称，常见的加工类型包括：
A. 内切核酸酶和外切酶对核苷酸的切除
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• 在许多真核生物中，rRNA基因呈串联重 复排列，包含100个或更多的转录单位， 在核中由RNA聚合酶I转录。
• 在各种生物体中前体有特定的大小（酵 母菌中为7000nt，哺乳动物中为 13500nt)，在不同的生物个体之间也有 轻微的差异。
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• 前体含18S、5.8S、及28S编码区域的各 一拷贝，后两者和起来相当于原核生物 中的23S rRNA。
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• 真核生物的5S rRNA由聚合酶III转录散在 基因产生出121nt转录物，而且几乎不需 要加工。
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4. 核糖核蛋白复合体及其研究
• 在细胞内，RNA分子通常与蛋白复合存 在，特定的蛋白与特定的RNA结合。这 种RNA与蛋白复合体称为核糖核蛋白 （ribonucleoprotein，RNP）。
modification of certain nucleotides
mature RNA.
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2. 原核生物的rRNA加工
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• 在E.coli中，有7种不同的rRNA操纵子 分散在基因组中
• 每一个操纵子都包含5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA序列各一个，还包含 1~4个 tRNA的编码序列
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• 酵母菌前tRNA中的内含子可在脊椎动物 细胞内加工，真核生物tRNA加工机制在 进化中可能是高度保守的。
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3. 核糖核酸酶P
• RNase P是由一个RNA分子和一个蛋白分 子组成的一种内切酶，是一种很简单的 RNP。
• 作用：修剪前tRNA分子产生出成熟的5’ 端。
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• 初生转录物的沉降系数为30S（约 6000nt），但存在时间很短
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7
pre-5S rRNA
Pre-16S rRNA Pre-tRNA Pre-23S rRNA
Pre-tRNA
Promoters
Terminators
rRNA操纵子
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8
• 大肠杆菌rRNA转录后加工要经历一系列 步骤：
• 电子显微镜直接观察RNP
• RNP或它们单一组分的抗体来纯化，也可以用 来封闭RNP的功能，与电子显微镜联用可以确 定特定的组分在整个结构中的大致位置
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• RNA结合实验显示一种特定蛋白与某一 RNA的结合，然后用RNA酶处理RNA-蛋 白复合体可以显示出结合蛋白保护了 RNA的哪一部分（Raase保护实验）