蛋白质电泳操作步骤
蛋白质电泳操作步骤
SDS-PAGE电泳操作步骤：试剂配制：（实验中采用均为分析纯）（1）丙烯酰胺贮液（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）丙烯酰胺贮液（T=30%，C=3%）称取29.1 g丙烯酰胺和0.9 g甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至100 ml，过滤备用。
(试剂有毒，操作中注意防护)（2）浓缩胶缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）6.06 g Tris溶解于35 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至6.8，再用双蒸水定容至50 ml。
（3）分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）18.16 g Tris溶解于75 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8，再用双蒸水定容至100 ml。
（4）10% SDS（5）10% 过硫酸铵（APS）：使用前新鲜配制，低浓度APS一般当天用当天配制，勿过夜使用。
（6）尿素（7）TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)（8）电极缓冲液(1×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.025 mol/L Tris，0.192 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（9）电极缓冲液(2×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.050 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（10）样品缓冲液（pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）1.6 ml浓缩胶缓冲液（pH 6.8）+ 4 ml 10% SDS + 0.6 g二硫苏糖醇(DTT) +2.5 ml 87%甘油+0.1 mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20 ml.（11）考玛斯亮蓝R-250染色方法：a．固定液20%三氯乙酸b．脱色液250 ml乙醇，80 ml冰醋酸，加水稀释至1000 ml。
c．染色液称取0.29 g考玛斯亮蓝R-250溶于250 ml上述脱色液中样品处理：处理完样品应尽快使用，若存储，须于-20℃下。
(完整版)SDS-PAGE蛋白电泳方法
SDS-PAGE一. 实验原理SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。
在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。
由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。
蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。
基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。
二. 试剂器材30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制；注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。
分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3，无需再调)，4℃ 贮存，可重复使用5-6次；2×加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) 2.0mL10%SDS溶液 4.0mL甘油 2.0mL巯基乙醇 2.0mL溴酚蓝 0.02g，混匀后1mL分装，-70℃可贮存6个月；10%AP：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存；TEMED：分装成每份1mL，4℃避光贮存；水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。
蛋白质电泳与操作
3. 分离；
1
4. 染色和脱色。
2
3
应用：用于分析蛋白质的分子量，常用于蛋白质 纯度鉴定和相对定量。
案例二：2-DE分析
• 2-DE简介：2-DE即双向凝胶电泳，是一种分离复杂 蛋白质混合物的方法。通过第一向等电聚焦和第二 向SDS-PAGE分离蛋白质，可展示蛋白质的等电点和 分子量。
案例二：2-DE分析
采用自动化技术，减少人为误差，提高电泳操作的重复性和可靠性。
04 蛋白质电泳实验注意事项
安全注意事项
1 2
避免使用未经灭菌的器具
在实验过程中，应确保所有使用的器具均经过严 格的灭菌处理，以防止微生物污染。
避免直接接触缓冲液
某些缓冲液可能含有刺激性或腐蚀性成分，应避 免直接接触皮肤或眼睛。
3
正确处理废弃物
03 蛋白质电泳技术优化
优化电泳条件
01
02
03
缓冲液选择
根据蛋白质的性质选择合 适的缓冲液，以提高电泳 分离效果。
电压与电流控制
优化电泳过程中的电压和 电流，以获得更好的分辨 率和分离效果。
电泳温度
选择适当的电泳温度，以 减少热量对蛋白质的干扰， 提高分辨率。
改进样品制备方法
样品溶解与变性
采用适当的溶解和变性方法，使蛋白质充分溶解并保持其天然构 象。
琼脂糖凝胶电泳
根据蛋白质分子的电荷和分子 量进行分离，常用于基因工程 和分子生物学研究。
等电聚焦电泳
根据蛋白质分子的等电点进行 分离，常用于蛋白质组学和生
物医学研究。
蛋白质电泳的应用
蛋白质组学研究
用于鉴定、分离和比较不同组织和细胞类型的蛋 白质，有助于深入了解生命活动的分子机制。
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
SDS-PAGE蛋白电泳标准操作规程
SDS-PAGE蛋白电泳标准操作规程----(纯度检测)一.目的：检测蛋白质的纯度是否达到生产抗体的要求。
二.依据：《分子克隆手册》，Ab-mart公司内部标准。
三. 职责：质量控制部。
四.试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。
五. 器皿与耗品：所有玻璃器皿使用前用玻璃清洁剂清洗, 80℃烤干。
tube、tip一次性使用。
六. 仪器设备：电泳仪（电源1--300V）电泳槽灌胶模具染色具凝胶扫描仪七. 环境要求：相对洁净环境，室温。
八. 溶液的配置：1.A液：1.5MTris·HCl pH8.8称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）2.B液: 1MTris·HCl pH6.8称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）3.C液: 30%丙烯酰胺称取29.2g丙烯酰胺(分析纯),0.8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解,再定容至100 ml,用滤纸过滤,。
贴上标贴，避光4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）4.D液:10%SDS称取10gSDS(分析纯),用超纯水溶解至100 ml.贴上标贴，室温储存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）5.E液:10%过硫酸胺称取10g过硫酸胺(分析纯), 用超纯水溶解至100 ml。
贴上标贴，-20℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）6.F液:TEMED(amersco)7.电泳缓冲液(10X)称取60.57g Tris碱(分析纯),288.268g甘氨酸(分析纯),20gSDS(分析纯),加超纯水定容至2000ml，临用前加超纯水稀释10倍，贴上标贴，室温储存。
蛋白质sds-page凝胶电泳实验步骤
蛋白质sds-page凝胶电泳实验步骤嘿，朋友们！今天咱就来讲讲蛋白质 SDS-PAGE 凝胶电泳实验那些事儿。
首先呢，得准备好各种材料和试剂，这就好比要出门得先把鞋穿好一样重要。
什么电泳槽啦、玻璃板啦、丙烯酰胺溶液啦等等，一个都不能少。
然后就是配胶啦！这就像做菜，得把各种材料按照一定的比例调好。
先配分离胶，小心翼翼地把各种溶液倒在一起，搅拌均匀，可别搅出气泡来哟，不然就像蛋糕里有了疙瘩，可不好看啦。
接着让它静置一会儿，等它凝固得差不多了，再倒上浓缩胶，这浓缩胶就像是给蛋糕加上一层漂亮的奶油。
胶配好啦，接下来就是上样啦！把处理好的蛋白质样品加到孔里，就好像是给小格子里放上宝贝。
这时候可得细心点，别把样品洒出来啦。
接着就是电泳啦！通上电，让蛋白质在电场里欢快地奔跑起来。
它们就像一群小朋友在赛跑，跑得快慢不一样，最后就分开啦。
在这个过程中，可别闲着呀，要时刻盯着，就像看着自己的宝贝在比赛一样。
看看电泳液有没有变少呀，电泳的情况怎么样呀。
等电泳结束啦，就可以染色啦！把胶放到染色液里泡一泡，就像给它洗个彩色的澡。
等染上颜色了，就能清楚地看到蛋白质的条带啦。
哎呀，你说这蛋白质 SDS-PAGE 凝胶电泳实验是不是很有趣呀？就像一场小小的冒险，每一步都充满了惊喜和挑战。
虽然过程可能有点繁琐，但当你看到那清晰的条带时，就会觉得一切都值得啦！就好像辛苦种的花儿终于开了一样开心。
所以呀，别害怕，大胆地去尝试吧！只要按照步骤一步一步来，肯定能做出漂亮的结果。
就像学走路一样，一开始可能会跌跌撞撞，但只要坚持，总会走得稳稳当当的。
加油哦，朋友们！相信你们一定能在蛋白质 SDS-PAGE 凝胶电泳实验中找到属于自己的乐趣和成就感！。
蛋白质电泳步骤
蛋白质电泳是一种常用的分析蛋白质的方法，以下是一般的蛋白质电泳步骤：1.准备样品：将需要分析的蛋白质样品进行处理，如裂解细胞或组织，使其分离出蛋白质。
2.加载样品：将蛋白质样品加入到电泳槽的样品槽中，注意样品和缓冲液的比例和顺序。
3.开始电泳：将电泳槽放入电泳仪中，设置好所需的电流和电泳时间，开始电泳。
4.染色和可视化：电泳结束后，可以使用各种染色剂和染色方法对蛋白质进行染色，以便更好地可视化和检测。
5.分离和分析：根据蛋白质的大小和电荷差异，将其分离到不同的区域，并进行分析。
需要注意的是，不同类型的蛋白质电泳实验可能存在一些细节上的差异，例如电泳缓冲液的成分、电泳时间和电压等。
因此，在进行实验前需要仔细阅读实验方法和相关文献，以确保实验的准确性和可重复性。
垂直式蛋白质电泳的操作步骤
实验试剂和器材1.材料：低分子量标准蛋白试剂盒: 低分子量标准蛋白：兔磷酸化酶BMW=97,400 牛血清白蛋白MW=66,200兔肌动蛋白MW=43,000 牛碳酸酐酶MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂MW=20,100鸡蛋清溶菌酶MW=14,400 开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。
样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解。
2.实验试剂(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中，4℃贮存可用1-2月。
（2）10%SDS（十二烷基磺酸钠）（3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8，最后用蒸馏水定容至100ml。
（4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L 盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水定容至100ml。
（5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定容至100ml。
（7）10%过硫酸铵(AP)（8）TEMED（四甲基乙二胺）（9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/L pH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml。
（10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。
（11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用。
（12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。
（13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。
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SDS-PAGE电泳操作步骤：
试剂配制：
（实验中采用均为分析纯）
（1）丙烯酰胺贮液（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）
丙烯酰胺贮液（T=30%，C=3%）
称取29.1 g丙烯酰胺和0.9 g甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至100 ml，过滤备用。
(试剂有毒，操作中注意防护)
（2）浓缩胶缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）
6.06 g Tris溶解于35 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至6.8，再用双蒸水定容至50 ml。
（3）分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）
18.16 g Tris溶解于75 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8，再用双蒸水定容至100 ml。
（4）10% SDS
（5）10% 过硫酸铵（APS）：使用前新鲜配制，低浓度APS一般当天用当天配制，勿过夜使用。
（6）尿素
（7）TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)
（8）电极缓冲液(1×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）
0.025 mol/L Tris，0.192 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3
（9）电极缓冲液(2×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）
0.050 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3
（10）样品缓冲液（pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）
1.6 ml浓缩胶缓冲液（pH 6.8）+ 4 ml 10% SDS + 0.6 g二硫苏糖醇(DTT) +
2.5 ml 87%甘油+0.1 mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20 ml.
（11）考玛斯亮蓝R-250染色方法：
a．固定液
20%三氯乙酸
b．脱色液
250 ml乙醇，80 ml冰醋酸，加水稀释至1000 ml。
c．染色液
称取0.29 g考玛斯亮蓝R-250溶于250 ml上述脱色液中
样品处理：
处理完样品应尽快使用，若存储，须于-20℃下。
○1.CytC酶解样
每管分别加入8 µl细胞色素C（20 mg/ml），10 ul 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）,1 µl 胰蛋白酶（细胞色素C：胰蛋白酶=50：1）。
37℃水浴，2 h。
立即放入-20 ℃冰箱冷冻保存备用。
上样前加15μІ上样BUFFER，75℃水浴5-10min
○2.大肠杆菌蛋白
取10μІ工程菌种接入10nml LB液体培养基里，过夜培养12h，取出1ml菌液离心10000g/r，5min。
弃上清，用1ml Tris-Hcl （pH 8.0 50mM）洗涤1-2次，后分别加入20μІ（pH8.0 5mM）、10μІEDTA，-20℃保存。
上样前加入2μІ5%X，再加入50μІ上样BUFFER，75℃水浴5-10min
○3.CytC
15μІCytC加入15μІ上样BUFFER，75℃水浴5-10min
○4.低分子量肽标准
取8-10μІMaker（2mg/ml）,加入10μІ上样buffer，再加入5μІddH2O，75℃水浴5-10min
○5.SPI多肽的制备
Ⅰ材料及试剂（试剂均为分析纯）
纯大豆粉
木瓜蛋白酶（sigma P3250 500-2000AU/g）
正己烷
巯基乙醇
Tris-HCl缓冲液（0.03 M、pH 8.0）
0.2 M HCl
叠氮钠
考马斯亮蓝G250
标准牛血蛋白
Ⅱ制备方法
ⅰ.SPI制备：大豆分离蛋白的制备参照Iwabuchi 和Yamauchi [9]的方法, 具体步骤如下: 全脂豆粉加正己烷(1/5)室温下搅拌1 h脱脂，于3 000 g 离心5 min, 取沉淀反复脱脂两次, 于沉淀中加入15～20 倍含10 mM 巯基乙醇0.03 M、pH 8.0 的Tris-HCl 缓冲液, 室温搅拌1～2 h, 于20 ℃ 6 000 g 离心25 min,取
上清液,用0.2 M HCl 调节pH 至4.8, 置于冰箱下层冷沉过夜, 再于4 ℃9
000 g 离心20 min, 取沉淀分散于少量水中, 调节pH 至7.0, 搅拌1 h 充分溶解后于4 ℃下用含0.05 % 叠氮钠的蒸馏水透析2 d, 再用蒸馏水透析两次去叠氮钠, 冷冻干燥即得大豆分离蛋白(SPI)。
（可能透析会损失掉一定量的多肽。
）ⅱ.SPI蛋白含量测定：利用考马斯亮蓝蛋白含量测定法，根据牛血蛋白作出的标准蛋白曲线，测定SPI的蛋白浓度：（具体方法参见《生物化学实验原理和方法》P174）
标准蛋白曲线
1.160
0.2
0.4
0.6
0.8
11.2
1.4
00.010.020.03
0.040.050.06
蛋白浓度吸光度
测得1%（1mg/ml ）的SPI 吸光度为0.779，求得即在SPI 质量分数为1%的情况下，其蛋白浓度约为3mg/ml.
ⅲ.SPI 多肽制备：本实验采用木瓜蛋白酶水解SPI ，制取SPI 多肽。
标准的酶解体系为溶于0.05 mol/L, pH8.0Tris -HCl 缓冲溶液的SPI 溶液(质量分数为2%),含质量分数为0.05%的叠氮钠,先于38℃下预热5 min,分别添加蛋白酶至750 AU/mL ，然后继续于反应温度下反应，反应时间也很影响SPI 多肽的产率，木瓜蛋白酶持续低温水解16小时也可以产生较多小肽。
反应混合物可定期取样并分别加入X- PAGE 样品缓冲液终止反应(1: 1, v/v)。
实验上样一般采用过夜酶解透析样(2%*5%)。
上样前应将酶解样与样品缓冲液混合物水浴。
操作方法：
所制均为1.0mm 小板所需体积
（1）配制分离胶（16.5%T, 3%C ）：
丙烯酰胺贮液—3ml 分离胶缓冲液—1.5ml 尿素—2.16g 10%SDS —72μІ
（2）配制浓缩胶（4%T, 3%C ）
丙烯酰胺贮液—0.34ml 浓缩胶缓冲液—0.24ml ddH 2O —1.4ml 10% SDS —24μІ
（3）将上两步配制的分离、浓缩胶真空抽气15min ，同时配制10%过硫酸铵:
准确称量0.1g过硫酸铵固体（因其易氧化，操作尽量快，且尽量从底部取样），溶于1ml双蒸水中，即配即用，低浓度APS只限当天使用。
（4）吸取22µl过硫酸铵及5µlTEMED于分离胶中，轻轻混匀，灌胶，小心的在分离胶的表面加封一层水，封住胶面。
注意分离胶与浓缩胶的比例。
（5）大约40min，待分离胶聚合形成界面后，吸掉水，加11µl过硫酸铵及4µlTEMED于浓缩胶中，轻轻混匀，灌注浓缩胶，慢慢斜插入梳子（以免产生气泡）。
胶配制完成之后可直接放置于室温下，而且切忌即配即用及4℃下冷藏，应使其充分凝固，这样可以在一定程度上提高分辨率。
（6）样品处理【此省略】
（7）上样：将处理好的样品依据其蛋白浓度加入上样buffer，水浴后离心，去适量体积加入上样孔内，切忌样品直接互相污染（上样量一般8-12µg，视样品不同而异）
（8）电泳：将电极缓冲液注入电泳槽中。
恒流情况下，电压一般设为最大值(300V),在分离胶内电流一般为10mA左右，大约30min左右，样品前沿跑过分、浓界面后，电流加大为20-25mA，整体电泳时间约2 h；恒压条件下，浓缩胶内电压取60V，电流一般设最大值，样品跑至分、浓界面后电压加大到120V，整体电泳时间约2.5h。
（9）染色：利用考玛斯亮蓝R-250染色系统固定、染色和脱色：电泳完毕后，将胶置于固定液中固定1 h，然后放置于染色液中染色过夜，转置脱色液中脱色，并多次更换脱色液，直至背景清晰。
（10）观察分析电泳结果。