水杨酸法测定羟自由基的清除能力实验
水杨酸甲酯清除羟基自由基活性的研究_马建华
水杨酸甲酯清除羟基自由基活性的研究马建华(集美大学生物工程学院 厦门 361021)马建华 女,48岁,教授,从事有机生物学的研究。
E -mail:ji anhuam1957@国家自然科学基金(30100035)、福建省自然科学基金(C0510029)及福建省教育厅(J A03134)资助项目2005-06-23收稿,2005-10-23接受摘 要 利用脉冲辐解技术研究了水杨酸甲酯清除羟基自由基反应的瞬态吸收谱,测定了水杨酸甲酯与羟基自由基反应的表观速率常数。
辅以常规检测方法,测定了水杨酸甲酯对羟基自由基的清除率。
结果表明,水杨酸甲酯能快速有效清除羟基自由基。
探讨了水杨酸甲酯清除羟基自由基的反应机制。
关键词 水杨酸甲酯 羟基自由基 脉冲辐解Study on the Scavenger Activities of Methyl S alicylateagainst Hydroxyl RadicalMa Janhua(Collegy of Biology Engineerin g ,Jimei Universi ty,Xiamen 361021)Abstract The scavenger activities of methyl salicylate towards the hydroxyl radical and its reaction mechanis m werestudied using pulse radiolytic technique and general test method.The apparent rate cons tan ts for reactions of hydroxyl radical and methyl salicylate were determined by growth trace of transient absorp tions arising from the scavenging of hydroxyl radical by methyl salicylate.Thus methyl salicylate is a good an tioxidant.Key words Methyl salicylate,Hydroxyl radical,Pulse radiolysis活性氧自由基能够引发癌症、自身免疫性疾病、炎症、肿瘤、心肌与脑损伤等性能已被生物医学界所证实,羟基自由基在活性氧自由基中反应活性最强、毒性最大,挖掘开发活性氧自由基清除剂尤其天然活性氧自由基清除剂是多年来医学界的研究热点[1~3]。
羟自由基清除能力测定原理
羟自由基清除能力测定原理一、引言羟自由基是一种高活性的化学物质，具有很强的清除能力。
羟自由基清除能力测定是一种常用的方法，用于评估化合物对自由基的抗氧化能力。
本文将介绍羟自由基清除能力测定的原理和相关实验方法。
二、羟自由基的产生羟自由基是一种带有羟基（OH）的自由基，具有很强的氧化能力。
羟自由基可以通过多种途径产生，例如光解水、氧化还原反应以及生物代谢过程中的产生等。
在实验室中，常用的产生羟自由基的方法是通过添加氢过氧化物和过氧化氢催化剂来进行。
三、羟自由基清除能力的评估方法1. 直接测定法直接测定法是最常用的羟自由基清除能力评估方法之一。
该方法利用特定的化学试剂（如5,5-二甲基-1-吡咯烷酮）与羟自由基发生反应，生成稳定的产物，通过测定产物的浓度变化来评估清除能力的强弱。
该方法操作简单、结果可靠。
2. 电子自旋共振法电子自旋共振法是一种基于电子自旋共振谱仪的测定方法。
该方法利用特定的探针与羟自由基反应生成稳定的产物，通过测定产物的电子自旋共振信号强度来评估清除能力的大小。
该方法对样品要求较高，需要配备专业的设备。
3. 化学计量法化学计量法是一种通过测定特定试剂的消耗量来评估羟自由基清除能力的方法。
该方法常用的试剂有抗坏血酸、谷胱甘肽等，通过与羟自由基反应生成稳定的产物，进而测定试剂的消耗量来评估清除能力的强弱。
该方法操作简单，适用于大批量样品的测定。
四、影响羟自由基清除能力的因素羟自由基清除能力受多种因素的影响，包括温度、pH值、浓度、反应时间等。
一般来说，较高的温度、适宜的pH值和较长的反应时间有助于提高羟自由基清除能力。
此外，样品的浓度也是影响清除能力的重要因素，适宜的浓度可以使清除能力得到准确的评估。
五、应用领域羟自由基清除能力测定在抗氧化剂的筛选和评估中具有广泛的应用。
抗氧化剂可以通过清除羟自由基来减轻氧化应激引起的损伤，具有重要的保护作用。
因此，羟自由基清除能力测定可以帮助筛选出具有较强抗氧化能力的化合物，并为新药开发和保健品研究提供依据。
羟自由基清除率测定方法
羟自由基清除率测定方法
1. 哎呀呀，你知道吗？有一种羟自由基清除率测定方法叫比色法呢！就好像我们通过眼睛看颜色的变化来判断一样，是不是很神奇？比如在做实验的时候，加入特定的试剂后，颜色一下子就变了，那就能知道羟自由基清除的情况啦！
2. 嘿，还有一种电子自旋共振法呢！这就好像是给羟自由基装上一个追踪器，能清楚地看到它们的动向和变化。
想象一下，在实验室里，我们能这么精准地捕捉到羟自由基的信号，是不是超厉害呀！就像警察抓小偷一样把它们都“逮住”呢！
3. 哇塞，化学发光法也是羟自由基清除率测定的好方法呀！这不就像夜晚的萤火虫一闪一闪地告诉我们它在哪里嘛！比如说当有物质能清除羟自由基时，那光芒就会减弱，多直观呀！
4. 哟呵！荧光分析法也很不错呢！它就像是一道光，照亮羟自由基的“踪迹”。
我们通过观察荧光的变化来了解羟自由基的清除效率，感觉自己就像个侦探一样在寻找线索呢！比如说在某个样品中加入特定试剂后，荧光发生了改变，那就是关键信息呀！
5. 哈哈，脉冲辐解法也能用来测羟自由基清除率哦！这就如同闪电划过，清楚地显示出羟自由基的状态呢。
就像闪电带来的瞬间光明一样，让我们能看清整个过程。
在实验中看到那些数据的变化，可有意思啦！
6. 哇哦！分光光度法也能担此大任呀！这就像用一个神奇的“眼睛”去观测羟自由基的世界。
我们按照步骤一步步操作，就能得到想要的结果啦。
比如说在特定波长下测量吸光度的变化，就知道羟自由基的清除情况如何啦！
我觉得这些羟自由基清除率测定方法都各有千秋，都为我们研究和了解羟自由基提供了有力的手段呀！。
几种常见食用菌清除羟基自由基能力的研究_马晓华
研究报 告
表 1 结果表明 , 食用菌粗多糖有显著的清除羟自 由基的能力 , 相当于每 100 m L 含 0.4 g 干品所得粗 多糖 的 清 除 羟 自 由 基 能 力 分 别 为 15.55 % 和 14.63 %。 但未经提取粗多糖的干菌浸提液本身的羟 自由基清除率远大于粗多糖溶液 。 说明在热水浸提 液中多糖具有一定的清除羟自由基能力 , 但由于粗多 糖溶液组成的复杂性 , 许多被沉淀下来的诸如蛋白质 等物质可能同样具有清除羟自由基能力 。 2.4 不同提取物清除羟基自由基能力的比较(图 3)
各取 8 g 由 1.2.2 制备的双孢蘑菇 、香菇和平菇 干菌粉 , 再将每种食用菌的 8 g 干菌粉等分为 4 份 , 2 g/ 份 , 各自分别加 20 m L 的双蒸水 、75 %乙醇 、无水 乙醇 、乙酸乙酯 , 充分搅拌 , 通风橱中各自密闭放置浸 提 14 h 后 , 过滤 , 各自取滤液即为不同提取溶剂的浸 提液 。 将浸提液放真空干燥箱中用真空泵抽取 12 h 后 , 在通风橱中自然挥发 5 d 至完全干燥得浸膏 。 分 别测定浸膏对羟自由基的清除能力 , 方法同 1.2.2 中 测定干菌粉对羟自由基清除能力的方法 。
物质活性的实验中检测其清除超氧阴离子自由基能 力的实验较多 , 研究表明 , 平菇多糖 、黑木耳多糖等具 有清除超氧自由基的作用[ 9～ 11] 。 羟自由基(·OH)是 最活泼的自由基 , 也是毒性最大的自由基 。它可以与 活细胞中任何分子发生反应造成损害 , 且反应速度极 快 , 被破坏的分子遍及糖类 、氨基酸 、磷脂 、核苷和有 机酸等[ 7] 。但几乎未见有人对食用菌清除羟自由基 能力进行研究 。 本文利用水杨酸法检测并比较研究 了几种常见食用菌鲜品及干品 的热水浸提液 、干菌 粉 、粗多糖 、冷水浸提液 、75 %乙醇浸提液 、无水乙醇 浸提液及乙酸乙酯浸提液的清除羟基自由基能力 , 初 步分析了几种食用菌清除羟基自由基物质的来源 。
羟自由基清除率测定
抗氧化活性的测定(参考)——测定活性物质对羟自由基的清除率（羟自由基清除试验）采用Fenton 试剂：过氧化氢/亚铁盐。
原理：H 2O 2与亚铁离子反应生成·OH,·OH 自由基一般存活时间比较短，具有较高的反应活性。
当在反应体系中添加水杨酸，便能快速的捕捉·OH 而产生紫色化合物（2,3-二羟基苯甲酸），该有色化合物在510nm 处有较大吸收峰，测其吸光度可表示羟自由基（•OH ）的多少，吸光度与羟自由基（•OH ）的量成正比。
反应体系中若加入羟自由基（•OH ）清除剂后，被氧化的水杨酸减少，则体系颜色变浅甚至消失，吸光度变小。
操作：样品处理：蔬菜水果切分，榨汁（切分后可放在2%的盐酸或草酸溶液中护色）。
将蔬菜汁或果汁放入50ml 离心管中（如有颜色加适量活性炭或白陶土），在3000~ 4000rpm 下离心10min~ 20min 后（若样品蛋白含量较高，需加适量乙酸锌，亚铁氰化钾）快速过滤，滤液备用。
取25ml 比色管2支（样品管、空白管），分别加入5ml 1mmol/L 硫酸亚铁溶液、5ml 3mmol/L H2O2溶液，样品管中加入1ml 样品溶液，空白管中加入1ml 蒸馏水，混合均匀后用3mmol/L 水杨酸溶液定容至刻度，在37℃(0.1±℃)的恒温水中反应15min 后，用分光光度计在510nm 的波长下测定各管的吸光度。
以3mmol/L 水杨酸溶液调零。
其对•OH 自由基的清除率SA （%），可根据下式进行计算：式中：A0—不加样品的吸光度； A1—加入样品的吸光度100A0A1-A0= SA(%)⨯清除率###【以往经验，不一定全适用】：若样品不进行脱色处理，则操作如下：在3支25ml 的比色管中（样品管、空白管、样品本底管）依次加入5ml1mmol/L 硫酸亚铁溶液，空白管和样品管中各加入5ml3mmol/L H 2O 2溶液，本底管中H 2O 2溶液用蒸馏水代替。
水杨酸检测放疗动物体内羟基自由基变化水平
水杨酸检测放疗动物体内羟基自由基变化水平
——动物实验方案
试剂:
水杨酸，2,3-二羟基苯甲酸，2,5-二羟基苯甲酸
生理盐水
实验内容：
捕捉剂注射液配制：将一定量水杨酸置于15ml容量瓶中，加入生理盐水溶解、稀释并定容至刻度，即得每ml含水杨酸60mg的均匀溶液。
捕捉剂注射：以1ml注射器吸取一定量捕捉剂注射液，通过腹腔注射。
最终剂量为300mg/kg。
注射时间如表、1所示
采学：通过尾静脉取血，在注射捕捉剂2h时后采集动物血样，置于预混有肝素的离心管中，混匀，4500rpm离心10min，收集血浆，置于-20℃保存。
采样时间如表、1所示
表、1 动物注射捕捉剂与采血时间点
动物1#2#3#4#5#
注射时间/min-15-0+01530
采样时间/min105120120135150
PS. 以上时间均以放射时间点为零点，
-0为注射捕捉剂后立即放疗
+0为放疗后立即注射捕捉剂。
羟自由基
羟自由基枸杞粉碎后，按照1:50（W/V)的料液比加入80%的乙醇溶液，70℃浸提3次，每次2.0h，抽滤并合并滤液，55℃下旋转浓缩至點稠状。
在比色管中依次加入2mmol/LFeSO4溶液3mL，1mmol/LH2O2溶液3mL，接着加入6mmol/L 的水杨酸溶液3mL摇勾后在37℃下水浴15min后取出，然后分别加入1mL不同浓度的样液，同时加入1mL超纯水作对照，以消除后加的1.0mL样液中水所造成的体系吸光度的降低，定容至10mL刻度线摇匀，再在37℃下水浴加热15min，取出于510nm下测其吸光值A1,对照所测吸光值A2。
样液对经基自由基清除率为：清除率(％)=(A2-A1)/A2×100%取1 ～5 g/L多糖样品溶液0. 5 mL，反应体系中加入再分别加入0. 5 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，10 mmol/L硫酸亚铁溶液，加入3. 5 mL 蒸馏水后，5 mL 10 mmol/LH2O2启动反应，混匀，37 ℃水浴保温15 min，在510 nm 处测A1，以蒸馏水代替样品溶液作为空白对照测定A0，用0. 5 mL 蒸馏水代替水杨酸-乙醇溶液作为调零组。
清除率计算公式同上。
4】9 mmol /L FeSO4 1 mL，9 mmol /L 水杨酸-乙醇1mL，不同浓度的待测溶液1 mL，8 ．8 mmol /L H2O21mL 最后加入混匀并启动整个反应。
37 ℃反应0．5h 后，4000 rpm 离心10 min，然后以蒸馏水作为空白，在510 nm 下测定吸光度。
以上混合溶液中以蒸馏水代替H2O2作为待测溶液的本底吸收值。
清除率( %) = A0 －( Ax －AX0)A0× 100式中: A0为空白对照液的吸光度，Ax为加入待测溶液后的吸光度，Ax0为不加显色剂H2O2待测溶液的本底吸收值。
超氧阴离子邻苯三酚自氧化法测定按参照文献[11]的方法并略有改动，按照表3进行加样，在325 nm 波长下，每隔0.5 min记录一次值，连续记录3 min。
水杨酸在羟基自由基检测中的应用
综述水杨酸在羟基自由基检测中的应用管荷兰,王永顺,林国华(镇江船艇学院,镇江212003)摘要:对近二十年来国内外有关水杨酸为捕捉剂的羟基自由基的测定方法,包括高效液相色谱法及其联用法、比色法、气相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法等进行了综述,引用文献25篇。
关键词:水杨酸;羟基自由基;检测中图分类号:O657.7文献标志码:A文章编号:1001-4020(2010)03-0333-03Applications of Salicylic Acid to Determination of the Hydroxyl Free RadicalGUAN He-lan,WANG Yong-shun,LIN Guo-hua(Zhenj iang W ater cr af t College,Zhenj iang212003,China)Abstract:A review on the pro gr ess of application of salicy lic acid to the det erminatio n of hydrox y l free r adica l w as pr esented,relating mainly on to pics of H PL C and its c hy phenat ion techniques,Color imetry,GC,G C-M S,LC-M S etc(25r ef.cited).Keywords:Salicy lic acid;Hy dr ox yl free r adical;Deter mination羟基自由基(#OH)是一种氧化能力很强的自由基,它可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用,造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤,使细胞坏死或突变;将其应用于环境污染物的处理,可降解环境中大多数有机物,生成二氧化碳和水,无二次污染物产生,且操作条件较容易控制,这些都是许多传统污染治理方法所无法比拟的优点。
羟基自由基清除能力测定法的简易操作图解-脱氧核糖降解法-脱氧核糖分析法
羟基自由基(·OH)清除能力测定法的简易操作图解（适用于各种抗氧化剂）文献来源[1] XicanLi. Solven t effect s and improv ement s in the deoxyr ibose degrad ation assayfor hydrox ylradica l-scaven ging. Food Chemis try, 2013, 141(3):2082-2088.操作图解图1 羟基自由基(·OH)清除能力测定法（脱氧核糖降解法）的实验操作图具体方法1 溶液配制0.2 MKH2PO4溶液: 100mL蒸馏水+2.7218gKH2PO4。
0.2 M Na2HPO4溶液: 500mL蒸馏水+35.814g Na2HPO4·12H2O。
磷酸盐KH2PO4－Na2HPO4缓冲液p hosph ate buffer（0.2M, pH7.4, 100mL）：19mL0.2 MKH2PO4+ 81mL 0.2 MNa2HP O4. （注意：19：81是大概的体积比，具体的比例以pH=7.4为准）。
Na2EDT A溶液：（1mM, 25mL）：8.4 mg+25mL蒸馏水。
FeCl3溶液：（3.2mM, 5mL）：4.2 mg+5mL蒸馏水。
抗坏血酸溶液：（1.8mM, 50mL）：15 mg+50mL蒸馏水。
H2O2溶液：（50 mM,5mL）：30 mg 30% H2O2+5mL蒸馏水。
脱氧核糖溶液：（50 mM, 2 mL）：15 mg脱氧核糖+2 mL蒸馏水(该用量约可做40个数据) 。
三氯乙酸溶液TCA（10%, 10 mL）：1 g + 10 mL蒸馏水。
硫代巴比妥酸溶液TBA：（5%, W/V, 20mL）:取1gTBA+20mL蒸馏水+20mgNa OH (临用时配，超声溶解. 该用量可做40个数据)。
水杨酸在羟基自由基检测中的应用
水杨酸在羟基自由基检测中的应用
水杨酸是一种有效的抗氧化剂，广泛用于食品、润滑油、建筑材料、农业等诸多领域，以其抗氧化能力在抗衰老领域具有重要的应用价值。
最近，研究人员发现，水杨酸可用于羟基自由基检测，用于观察细胞中的自由基积累。
羟基自由基是过氧化氢（H2O2）和氢原子（H）的特殊混合物，是生物体最普遍的氧化和还原物质，广泛存在于细胞和体液中，可参与多项生物反应。
它们具有十分强的活性，可以攻击和破坏细胞结构，影响细胞表面活性物质的合成，对生物体有着极其重要和不可忽视的影响。
因此，对羟基自由基积累量精确检测及时采取正确的干预措施对生物体具有重要意义。
传统的羟基自由基检测方法，需要大量的试剂以及长时间的实验流程，效率极其低下。
一些研究人员研究发现，水杨酸可以代替实验中常用的试剂，用于羟基自由基检测，并且该方法较其他检测方法的效率更高、试剂更少。
特别是水杨酸具有明显的k-氧化物抑制作用，研究表明，当水杨酸和一定浓度的过氧化氢一起施加到细胞当中时，可以在较短时间内取得较高回收率。
此外，水杨酸可以利用其自身的氧化效应，在检测中产生一定量的三元羟基酸和醛，实现对有五种自由基的同时检测。
最后，值得一提的是，作为一种绿色、安全的抗氧化剂，水杨酸检测羟基自由基无须任何外部试剂，也无需复杂的步骤，只需涂抹到细胞表面即可完成检测，具有很高的经济价值。
从上述信息可以看出，水杨酸用于羟基自由基检测具有显著优势，整个检测过程可以在较短时间内达到较高回收率，有良好的应用前景。
此外，水杨酸较少的检测试剂及其无害的特性也使它在羟基自由基检测方面受到研究者的广泛关注和追捧。
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水杨酸法测定黄酮对羟自由基清除能力的实验
一、实验原理
利用Fenton 反应产生羟自由基：H2O2+Fe2+ =·OH+H2O+Fe3+在反应体系中加入水杨酸，Fenton反应生成的羟自由基与水杨酸反应，生成于510 nm处有特殊吸收的 2,3- 二羟基苯甲酸，反应式如下：如果向反应体系中加入具有清除羟自由基功能的被测物，就会减少生成的羟自由基，从而使有色化合物的生成量相应减少。
采用固定反应时间法，在 510 nm 处测量含被测物反应液的吸光度，并与空白液比较，以测定被测物对羟自由基的清除作用。
其清除率计算公式为：羟自由基清除率(%)=A0－(A x－A x0) /A0·100
其中A0 为空白对照的吸光值，A x 为加样品的吸光值， A x0 为不加显色剂 H2O2
二、实验步骤
各溶液的加入量按照表 1 所示，在比色管中依次先加入 9 mmol / L FeSO4， 9 mmol / L 乙醇 - 水杨酸，接着加入适量去离子水，最后加入 8.8 mmol / LH2O2 后摇匀，37℃水浴加热 15 min 后取出，测其吸光度 A0。
A0 测定时，参比溶液为不加双氧水的体系。
按上述方法，加入表 1 所示的各溶液，来测定吸光度 A x、A x0。
A x 和 A x0 测定时，参比溶液为去离子水。
三、试剂配制
9 mmol / L 乙醇 - 水杨酸配法：称 1.243 g 水杨酸，乙醇溶解，定容至 100 mL，然后稀释 10 倍；9 mmol / L 硫酸亚铁配法：称 2.502gFeSO4·7H2O，去离子水溶解，定容至 100 mL，然后稀释10倍。
8.8 mmol/L H2O2 配法：称 9.926 g 30 % H2O2，去离子水定容至 100 mL，然后稀释 100 倍。
四、实验结果
羟自由基清除率（水杨酸法）公式为：清除率I％=（Ao+Axo-Ax）/Ao x100％样品（干花豆）为0.1313g/60ml水
样品：0.0250gVC加500ml娃哈哈纯净水。