新生大鼠心肌细胞培养技术
新生大鼠心肌细胞的培养和分离
1. 材料和方法
• 1.1心肌细胞的消化 • 取一只加盖烧杯，内放一块用乙醚饱和的纱布， 把 0~3 日龄的大鼠幼鼠放进该烧杯中麻醉，用 2 % 碘酒和 75 % 酒精消毒胸腹皮肤，在无菌条件 下开胸取出心脏，立即置于 4º C D-Hanks 液 (mmol/L：Nacl 137, Kcl 5.4, Na2HPO4 0.37, K2HPO4 0.44, NaHCO3 4.2)中剪取心室肌，洗净 残血，剪成约1mm³ 大小的组织块，弃去D-Hanks 液加入0.08% 胰蛋白酶液10~15ml，于37°C静 置5min，吸出上层悬液，并加入等量的含血清 培养基。经终止消化后离心 ( 1800 r/min) 弃上 清液，加入含血清的培养液。吹散沉淀细胞， 同条件下离心，用 10 % 血清培养液制成细胞悬 液，置于37°C含5%CO2培养箱中。
3.实验讨论
• 有很多文献报道新生大鼠心肌细胞的培养 时间为10~12天,本次实验的培养时间为3天, 与之比较成活时间较短,但本实验可以说明 低浓度胰蛋白酶消化液(0.08%)比一般浓度 (0.125%) 的消化时间效果好 , 消化时间在 3~5 分钟内可减少细胞死亡率 . 实验过程中 出现的细胞向一处聚集的现象和可见的连 续的形态变化,可以说明体外培养心肌细胞 重新连接成更大单位细胞团是可能的,它们 可能通过形态的变化相互钩连,连接成网.
1.3心肌细胞的无血清培养
• 当心肌细胞培养24小时后换无血清培养液 （含DMEM培养液，胰岛素10g/ml, 铁蛋 白 1 0 g/ml， 维 生 素 C100g/L 维 生 素 B121.5µ mol/L）继续培养 48 小时 , 每隔 8 小 时换液一次,尽量保持各添加成分浓度不变, 最后收集细胞,进行测定。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种重要的细胞类型，对于心脏生理学和病理学研究具有重要意义。
在研究心脏疾病发生发展机制、药物筛选及分子生物学研究中，大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养是必不可少的步骤。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 材料准备（1）动物：健康的大鼠（2）工具：手术刀、剪刀、镊子、针头、离心管、培养皿等（3）试剂：PBS、Hanks液、COLLAGENASE、TRYPSIN、DNA酶I2. 心肌细胞的分离（1）准备心肌组织：选取健康的大鼠，进行心肌组织的分离。
将动物取出心脏，迅速放入含有PBS的离心管中，冷藏备用。
（2）组织的机械分离：将心脏取出后进行机械分离，去掉多余的结缔组织等。
（3）酶消化：将组织加入COLLAGENASE、TRYPSIN等酶进行消化，使细胞释放。
（4）滤网过筛：将酶消化后的组织经过滤网过筛，得到心肌细胞的悬液。
（5）细胞纯化：使用密度梯度离心法或其他方法对心肌细胞悬液进行纯化，得到较纯的心肌细胞。
二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 形态学鉴定（1）显微镜观察：将得到的心肌细胞悬液放入培养皿中，通过显微镜观察心肌细胞的形态。
（2）心肌细胞的特征：心肌细胞具有两个或多个横纹和中央的单核的细胞核，且具有特殊的形状和排列方式。
2. 免疫细胞化学鉴定（1）选取适当的心肌细胞标记物：如肌球蛋白、酸性肌球蛋白等（2）进行免疫细胞化学染色：使用特异性抗体对心肌细胞进行染色，观察标记物的表达情况。
（3）通过显微镜观察：观察心肌细胞的染色情况，以确定其特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 培养基的配制（1）培养基配方：DMEM/F12培养基+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素+适量营养因子（2）pH值调节：将配制好的培养基进行pH值调节至7.42. 大鼠心肌细胞的培养（1）培养皿涂层：将培养皿内涂覆明胶或胶原等基质蛋白，有利于细胞的附着生长。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种重要的研究对象，分离、鉴定和培养大鼠心肌细胞是进行相关研究的基础工作。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养方法。
1. 大鼠心肌细胞的分离方法：a. 准备消化液：将含有0.1%胰酶和0.05%胰蛋白酶的耗氧培养液(如DMEM/F12)预先加热至37℃。
b. 杀死大鼠：快速杀死大鼠，并立即进行心肌细胞的分离。
c. 开胸取心：通过剖开胸腔，将心脏暴露，并迅速取出。
d. 剪开心脏：用剪刀切开心脏的心室部分，将其放入预先加热的消化液中。
e. 贴壁处理：将心室组织液搅拌均匀，并放置在37℃培养箱中酶解。
每隔10分钟，用吸球轻轻吸取上清液，反复操作3-4次。
2. 大鼠心肌细胞的鉴定方法：a. 形态学观察：用显微镜观察分离得到的心肌细胞的形态，心肌细胞呈长条状，具有明显的纵纹和横纹。
b. 钙离子荧光染色：使用荧光染料如Fluo-4 AM来标记细胞内的钙离子，并观察细胞内钙离子的动态变化。
c. 免疫荧光染色：使用心肌细胞特异性标记物如肌球蛋白进行免疫荧光染色，观察标记物的染色情况。
3. 大鼠心肌细胞的培养方法：a. 培养基准备：将DMEM/F12培养液加入10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素溶液和1%胎牛血清补充物。
b. 细胞接种：将分离得到的心肌细胞加入培养基中，浓度为1 * 10^5 cells/ml，并将细胞悬浮液加入培养皿中。
c. 培养条件：将培养皿放入恒温培养箱中，温度设定为37℃，CO2浓度设定为5%。
d. 培养液更换：一般情况下，每2-3天更换一次培养基，同时可添加适量的生长因子和激素。
e. 心肌细胞传代：当心肌细胞达到80-90%的密度时，可以进行细胞传代。
传代方法与培养方法相似，注意细胞的保持适当的密度。
大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养是大鼠心肌细胞研究的关键步骤。
通过合适的操作和条件，可以获得纯度较高的心肌细胞，并进行相关研究。
需要注意的是，心肌细胞的分离和培养过程需要在无菌条件下进行，以避免细菌和其他微生物的污染。
新生大鼠心肌细胞培养技术
【 ｅ Ｏｄ】 Ｃ ｌ ｕｕｅ ｅ ｎ ｕｓ Ｍｙｃ ｄ ｌ Ｒ ｔ Ｋｙ ｌ Ｗ Ｓ ｅ ｔ ｈｉ ｅ； ｌｌ ｒ ｔ ｑ ｃ ｃ ｏ ｒｉ； ａ ａ ａ ｓ
原 代培 养心 肌 细胞作 为 一种 主要 的研 究模 型 ， 被广泛 地 应 用 于心 血 管 疾 病 的研 究 中。我 们 经 过 长期 摸索 总结 出一 套 简便 、 有效 的大 鼠心肌 细胞 的
【 要】 目的 探讨新生大鼠心肌细胞的分离、 摘 培养方法。方法 取 １ 龄新生大 鼠的心室肌细胞 ， ～３ ｄ
用胶原酶 １分离心肌 细胞 ， 离心收集心肌细胞 ， 差速贴 壁法 纯化后 培养于 ＤＭＥ 培养基 。显微镜 下鉴定 心肌细 Ｍ
胞的纯度和形态结构 ， 锥虫蓝染色检查心肌细胞成 活率 。结果 出现 同簇 细胞 的同步跳动 。结论
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取一窝 １ ～３ｄ龄新 生大 鼠， 不用 麻醉和处 死 ， 用手 固
定住 四肢 ，５ ７ ％的酒精消毒皮肤 ， 无菌 眼科剪 在剑 突上一肋 处 人剪 （ 注意避免剪破消化 道预 防污 染） 。开 口 ０ ５ｃ ， ． ｒ 心 ｎ 脏 自然 跳 出 ， 心 尖 部 组 织 剪 下 迅 速 置 于 预 冷 的 不 含 将
ｗｅｅ ｕ ｉ ｙ ｃ ｒｎ ｕｌ ． ｏ ｃｕ ｉ Ｔ ｉ ｉ ａ ｆ ｔ ｅｗ ｙ ｔ ｕ ｙｍｙ ｃｒ ｉ ｅ ｓ ｒ ｊｍｐｎ ｓｎ ｈｏ ｏ ｓ Ｃ ｎ ｌ ｏ ｇ ｙ ｓｎ ｈｓ ｓｎ ｅｆ ｉ ａ ｓ ｄ ｏａｄａ ｃｌ ． ｃ ｅ ｖ ｏ ｔ ｌ ｌ
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏组织的重要细胞之一，对于心脏疾病的研究和治疗具有重要意义。
在进行心脏细胞的研究和培养过程中，对大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是非常关键的步骤。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一关键技术。
一、大鼠心肌细胞的分离大鼠心肌细胞的分离是进行心肌细胞培养的第一步，其关键在于有效地分离心肌细胞，保证细胞的纯度和活力。
以下是常用的大鼠心肌细胞分离的方法：1. 心脏采集：首先需要从大鼠体内取出心脏组织，最好选择小鼠、大鼠等小型动物，以便于获取足够数量和较为纯净的心肌细胞。
2. 心室组织的分离：将心脏组织置于含有氧气的离心纯化液中，迅速剪下心脏，并去除心包膜、心尖等结缔组织，然后将心室组织切成小段。
3. 细胞的分离和纯化：将切成小段的心室组织放入含有0.1%胰蛋白酶和0.1%重组胰岛素的胰酶溶液中进行消化，去除结缔组织和细胞外基质，然后用离心分离出心肌细胞。
4. 心肌细胞的过筛和纯化：经过离心后，得到的上清液中含有大量的心肌细胞和其他细胞。
通过过筛的方法，可以进一步提取纯净的心肌细胞，并将其进行鉴定和培养。
1. 形态鉴定：观察分离得到的心肌细胞在显微镜下的形态特征，包括细胞形状、大小、结构等。
正常的心肌细胞应该呈长条形、有交叉条纹，并具有丰富的胞浆。
2. 免疫细胞化学鉴定：通过染色技术，使用与心肌细胞特异蛋白相关的抗体标记心肌细胞，如肌动蛋白、肌钙蛋白等，观察其在心肌细胞中的表达情况，以确定其纯度和特异性。
3. 功能鉴定：通过检测心肌细胞的功能特性，如心肌收缩力、电生理特性等，来判断心肌细胞的活性和健康程度。
可以通过贴壁法、钙离子荧光示踪等技术手段来进行功能鉴定。
通过以上的鉴定方法，可以全面地评估分离得到的心肌细胞的纯度和活性，为后续的心肌细胞培养和实验奠定基础。
在分离和鉴定得到的心肌细胞可以进行培养，为心脏疾病的研究和治疗提供重要的实验材料。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞是心肌细胞的主要来源之一，在心脏疾病的研究中具有非常重要的作用。
为了开展相关研究，需要对大鼠心肌细胞进行分离鉴定以及培养，以下是一份详细的操作
步骤。
1. 器材准备
（1）无菌试剂：试剂瓶/管、离心管、移液器、细胞培养基等。
（2）消毒器材：无菌吸管、离心机、高压灭菌器、悬浮液制备仪等。
（3）实验器材：显微镜、培养箱、细胞计数板、细胞离心机等。
2. 心肌细胞的分离
（1）准备新鲜的大鼠心脏组织。
（2）将心脏组织放入离心管中，加入PBS洗涤1-2次。
（3）将心脏组织切成小块，加入预先调配好的组织消化液（如DMEM/F12加入胰蛋白酶），37℃放入恒温水浴中消化2-3次。
（4）将消化的样本离心，去除上清液，加入预备的培养基，悬浮细胞。
（5）进行筛选，并将心肌细胞分离，最终得到心肌细胞。
（1）将分离好的心肌细胞放置在显微镜下观察其形态。
（2）进行免疫荧光染色，使用特定的心肌细胞抗体进行染色，观察细胞核及膜表达，判断其是否为心肌细胞。
（1）将鉴定好的心肌细胞放入预备好的细胞培养基中。
（2）放置于37℃恒温培养箱中，维持培养基液位。
（3）每2-3天更换一次新的培养基。
以上就是大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养的操作步骤，具体操作时应注意操作规范
和实验安全，保证实验结果的准确性和可靠性。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是生物医学研究中常见的实验步骤。
下面将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法步骤。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 准备工具和试剂- 离心管、培养皿、组织研磨器、离心机、反应管等；- 消化酶（如胰蛋白酶、胰酶、胶原酶）、细胞分离缓冲液（如Hank's液、DMEM/F12液）- 磷酸盐缓冲液、磷酸缓冲液、PBS缓冲液等。
2. 动物安乐死和心脏取出- 通过适当的麻醉方法将大鼠处死；- 固定大鼠，将心脏迅速取出。
3. 大鼠心脏组织的处理- 将心脏放入含有预冷的磷酸盐缓冲液的离心管中；- 用螺旋式切割器将心脏切碎并加入含有消化酶的组织研磨器中；- 用搅拌器均匀搅拌、体外消化。
4. 细胞的分离和纯化- 将组织胶块转移到筛网上，用PBS缓冲液冲洗细胞；- 收集细胞上清液，离心沉淀；- 用细胞分离缓冲液重新悬浮沉淀细胞。
二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 大鼠心肌细胞鉴定试剂- 法斯琪染色试剂；- cTnI、cTnT等心肌特异标志物抗体；- 免疫荧光显微镜。
2. 法斯琪染色鉴定- 采用法斯琪染色方案对心肌细胞进行染色；- 使用显微镜观察是否出现蓝色染色反应，标志细胞为心肌细胞。
3. 免疫荧光鉴定- 使用抗体与心肌特异标志物结合；- 使用免疫荧光显微镜观察细胞是否出现荧光信号。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 大鼠心肌细胞的培养基- 常用的培养基有DMEM/F12液、Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）等。
2. 细胞培养条件- 培养基中添加适当的血清（如胎儿牛血清）和抗生素；- 培养箱中保持37℃、5% CO2含量。
3. 大鼠心肌细胞培养步骤- 将分离得到的心肌细胞加入培养基中；- 在培养箱中培养细胞，定期更换培养基；- 进行细胞观察和实验。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种可供研究心脏疾病和相关生理学过程的重要模型细胞。
分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞对于心脏病研究具有重要意义。
本文将详细介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定方法以及培养步骤。
1. 动物准备根据实验需要选择2-3个月大的健康雄性大鼠。
提前饲养大鼠，使其适应实验环境，避免压力引起心肌细胞损伤。
实验前一天，禁食12小时但允许饮水。
2. 心肌细胞分离将大鼠按麻醉操作，使用90mg/kg的琥珀胆碱或90mg/kg的乙酯进行麻醉。
确认大鼠麻醉后，通过软组织剪刀取出心脏，将其置于冷却的Buffer A中。
(Buffer A: 含有137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 0.44 mM KH2PO4, 4.19 mM NaHCO3, 5.5 mM glucose, 10 mM HEPES的PBS液)将心脏移至工作台上，用毛刷清洁心脏表面的血液和附着物。
然后将心脏转移至10cm 培养皿内，将血管外壁剪除。
将心房和心尖切掉，将心脏切割成小块，并转移到15 mL离心管中。
加入5 mL Buffer A，并使用移液器缓慢混合。
使用1000 rpm进行梯度离心 (5 min)。
根据实验需要，可以选择制备低密度（20%离心液缓冲液）或高密度（50%离心液缓冲液）梯度离心。
将上清液去除，将沉淀与Buffer A混合。
将混合液过滤，去除残留的大块异物。
可使用0.22 μm的滤膜将上清液过滤。
收集上清液至50 mL离心管中，离心10 min(1000 rpm)。
去除上清液，保留沉淀。
再次挤压沉淀，使其成为小碎片。
将沉淀与37°C的Buffer B液混合。
(Buffer B: 含有137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.5 mM MgCl2, 0.9 mM CaCl2, 0.44 mM KH2PO4, 4.19 mM NaHCO3, 5.5 mM glucose, 10 mM HEPES, 10 mM taurine, 10 mM BDM的PBS液)以500 rpm离心5 min，去掉上清液，保留沉淀。
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基金项目:新疆石河子大学科学技术研究发展计划项目(ZRK X2006 Q04)新生大鼠心肌细胞培养技术新疆石河子大学医学院(832002) 李润琴 慕晓玲摘 要 目的 探讨新生大鼠心肌细胞的分离、培养方法。
方法 取1~3d 龄新生大鼠的心室肌细胞,用胶原酶!分离心肌细胞,离心收集心肌细胞,差速贴壁法纯化后培养于DM EM 培养基。
显微镜下鉴定心肌细胞的纯度和形态结构,锥虫蓝染色检查心肌细胞成活率。
结果 心肌细胞纯度为96%,平均成活率95 43%,并出现同簇细胞的同步跳动。
结论 该方法简单有效,为研究心肌细胞的人员提供了一种实验手段。
关键词 细胞培养技术; 心肌; 大鼠Culture method of the myocardial cell in Neonate Rats LI Run qin,M U X iao lin.M edical College of Shi hez i Uni versity ,X inj iang 832002,ChinaAbstract Objective T o find an easy way to separ ate and cultur e myocardial cells of neonate rats.Methods T o obtain ventr icular myocardium of neonate rats about 1~3years o ld.We separate myo cardial cell w ith collag enase I,and collect myocar dial cell w ith centrifug alization.M yocar dial cell was cultur ed in DM EM and was separated by the t ime of adherence.W e observed the structure of myocar dial cell from lig ht microscope and stained living my ocardial cell with trypan blue.Results W e find 96percent cells ar e myocardial cells and 95.43percent ar e alive.A ll the myocardial cells were jumping synchronously.C onclusion T his is an effective w ay to study myocardial cells.Key words Cell culture techniques; M yocardial; Rats原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型,被广泛地应用于心血管疾病的研究中。
我们经过长期摸索总结出一套简便、有效的大鼠心肌细胞的培养技术,为研究心肌细胞的人员提供一种实验手段[1]。
1 材料和方法1 1 主要试剂和仪器1 1 1 试剂:小牛血清:购自Sigma 公司。
DM EM (Dulbcc co ∀s M odified Eagle M edium)合成培养基:购自Sigma 公司,含10%的小牛血清,100万U 青霉素,100万U 链霉素。
胶原酶!0 8g/L:购自Sig ma 公司(现用现配)。
磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline,PBS ):购自Sigma 公司。
锥虫蓝:购自G ibco 公司,加无菌三蒸水配成浓度0 04%备用。
1 12 仪器:超净工作台,CO 2培养箱,倒置相差显微镜,离心机等。
所有手术器械高压灭菌。
玻璃品均强酸浸泡过夜,流水冲洗20遍,蒸馏水冲洗3遍,烤干后高压灭菌备用。
1 2 实验动物Wistar 大鼠,1~3d 龄,新生大鼠心肌细胞在出生后3d 内具有部分增殖能力,大鼠出生时间越短,其心肌细胞分离后成活率越高,越容易贴壁生长。
1 3 心肌细胞的制备和培养取一窝1~3d 龄新生大鼠,不用麻醉和处死,用手固定住四肢,75%的酒精消毒皮肤,无菌眼科剪在剑突上一肋处入剪(注意避免剪破消化道预防污染)。
开口0 5cm,心脏自然跳出,将心尖部组织剪下迅速置于预冷的不含Ca 2+、M g 2+的PBS 中,反复冲洗3遍,洗去残留的血细胞,将其剪成0 5~1mm 3大小的组织块,放入锥形瓶中[2],加入8mL 0 8g/L 的胶原酶!,在37#水浴,磁力搅拌器转速为100r/min,消化10min 。
将黏附在搅拌子上的心肌组织吹散,当组织液由红转白呈半透明状态时,应停止消化。
用吸管吸取第一次消化后的上清液弃去,再次以同上的方法消化3次,收集以后每次的消化后的上清液,加适量含10%的小牛血清的DM EM 培养基,终止胶原酶!对心肌细胞的继续作用。
将收集到的上清液在500r/min 的离心机上离心10min,弃去上清液,用PBS 吹散沉淀细胞,同条件下再次离心,弃上清,然后加含10%的小牛血清,100万U 青霉素,100万U 链霉素,p H =7 2的DM EM 培养基制成细胞悬液接种于培养瓶中,放入37#,5%CO 2培养箱中静置培养90min 后,轻轻振摇后倾出尚未贴壁的心肌细胞,重新接种。
将纯化的心肌细胞以1 5∃106/mL 接种于预先用50mg /L 多聚赖氨酸涂布的25mL 培养瓶中,每瓶3mL ,放入37#,5%CO 2培养箱中培养,每48h 更换1次培养基,取培养72h 的单层细胞进行实验。
1 4 心肌细胞质量评价1 4 1 心肌细胞纯度鉴定[3]:显微镜下观察、计数纯化后的细胞,心肌细胞成圆型,成纤维细胞成梭形,计算心肌细胞纯度=心肌细胞数/(心肌细胞数+成纤维细胞数)∃100%。
1 42 心肌细胞成活率检查:于心肌细胞培养24h后取细胞悬液以0 04%锥虫蓝适当稀释,混匀后吸取一滴于血球计数器上,置显微镜下观察细胞形态,杆状着色为死亡的心肌细胞,杆状未着色为存活的心肌细胞。
每瓶计数500个心肌细胞,计算心肌细胞的成活率=(成活的心肌细胞/ 500)∃100%。
1 4 3 心肌细胞形态学观察:光镜观察,常规倒置显微镜观察细胞形态。
2 结 果2 1 纯度鉴定结果:用差速贴壁法纯化后计数1000个细胞,圆形心肌细胞960个,梭形成纤维细胞40个,心肌细胞纯度为96%。
2 2 心肌细胞成活率:见表1。
表1 心肌细胞成活率培养瓶存活数死亡数总计成活率(%)平均成活率(%) 14752550095.024802050096.034762450095.244742650094.854782250095.664802050096.095.432 3 心肌细胞形态学观察:未贴壁前心肌细胞为圆形或椭圆形。
4h后开始贴壁生长,并不断分裂增殖,逐渐呈梭形,多角形,核多为一个或两个,呈圆形,核仁清楚。
24h后细胞呈杆状,长宽比约4~6&1,形成同心圆放射状细胞簇。
第3天形成单层细胞铺满瓶底,并出现同簇细胞的同步跳动,搏动频率、节律、强度稳定,80~120次/min左右。
3 讨 论自从1960年H arary首次对Wistar乳鼠的心肌细胞进行培养,并成功地维持其自发性节律搏动长达40d以来,国内外学者致力于心肌细胞的研究,体外培养的心肌细胞具有简便、定量、重复性好以及不受神经体液因素影响等特点,可以开展心肌细胞的生长发育、生理、代谢、病理、药理等方面的基础研究[4 7],我们参照国内外文献方法,成功地完成了新生大鼠的心肌细胞培养,成活率95 43%。
我们在心肌细胞培养过程中总结如下。
3 1 心肌细胞的分离:∋新生大鼠鼠龄的选择:新生大鼠在出生后3d内具有部分增殖能力,成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞,不再具有分裂增殖的能力,因此,大鼠出生时间越短,其心肌细胞分离成活率越高,越容易贴壁生长,大量实验观察,尤其半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳。
(手术操作过程应该严格消毒,注意无菌操作,避免损伤消化道,动作迅速,尽量缩短心肌缺血缺氧时间。
)分离心肌细胞通常用胰蛋白酶和胶原酶,胰蛋白酶作用较强,容易造成心肌细胞损害,通常使用浓度为0 05%~0 25%,分次消化。
胶原酶作用较缓和,能消化细胞间质中的胶原纤维,对心肌细胞损伤较小,且在新生大鼠心肌组织中以胶原!为主,故我们选用胶原酶![8],现配现用。
分次消化可减轻胶原酶或胰蛋白酶对单细胞的破坏作用。
消化温度在35~37#左右,过高温度会增加胶原酶或胰蛋白酶的毒性,温度过低会降低胶原酶或胰蛋白酶的活性。
∗心肌细胞的收集:无论何种酶消化的心肌细胞,第1次消化后静置的上清液均应弃去,因其含有残留血细胞和从组织边缘消化下来的坏死心肌细胞。
收集消化后液体进行离心时,转速多为60~750r/m in,因为离心时速度太快可对心肌细胞造成损伤,本研究采用500r/min获得成功。
+换液时间:为避免成活的心肌细胞随换液被丢弃,多采用48h后换液。
3 2 心肌细胞的纯化:体外培养的心肌细胞中通常存在两类细胞,心肌细胞和成纤维细胞。
由于成纤维细胞增殖迅速,培养3~5d后在数目上可大大超过心肌细胞数目,而对心肌细胞的生长和收缩功能有很大影响,因此体外培养心肌细胞的纯化方法就显得很重要。
目前国内外常用的纯化分离方法有:∋差速贴壁法:根据心肌细胞和成纤维细胞在培养器皿表面贴壁生长的速度不同而分离的方法。
此方法具有操作简便、时间短、对细胞影响小、分离纯度高等优点,国外实验室多采用这种方法。
纯化后培养的心肌细胞较混合培养的细胞搏动时间长,开始搏动的时间提前,易形成同步,且收缩力强。
但该法的不足之处在于不适用于心肌细胞长期培养实验,因培养数天后成纤维细胞的比例就大大增大,本实验采用差速贴壁分离法纯化心肌细胞,纯度为96%。
(化学试剂抑制法:是某些化学物质对成纤维细胞有抑制作用,而对心肌细胞则无明显影响。
非心肌细胞分化较快,有丝分裂率较高,在培养基中加入有丝分裂抑制剂如:溴脱氧尿苷(Brdu)、阿糖胞苷(Ara C)等抑制剂,抑制成纤维细胞DNA和蛋白质合成,达到抑制成纤维细胞增生的目的。
但其对心肌细胞或多或少也会有一定的影响,这是不足之处。
3 3 心肌细胞的培养:∋接种的细胞密度:心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触,而且影响长期培养细胞的成活率。
一般根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量,范围多在5∃107~5∃109/L。
细胞数目过多易发生营养不良;细胞数目过少,心肌细胞不能相互接触,心肌细胞间无法进行信息交流,心肌细胞收缩不易同步,收缩持续时间变短。
本研究接种密度1 5∃109/L,获得成功。