细胞培养溶液配制
含软脂酸的细胞培养液如何配制
含软脂酸的细胞培养液如何配制本人想用含软脂酸的细胞培养液处理细胞以观察软脂酸对细胞的影响，但软脂酸是不溶于水的，查了一些文献但说的都不够清楚，想请教一下曾配制过这种培养液的朋友。
谢谢如果是游离脂肪酸，一般浓度都不会很高，大部分是umol/L。
配制前，现用乙醇或石油醚溶解一定质量的脂肪酸，装进一个干净的瓶子中。
氮气吹干，然后用0.15M KOH溶解。
即可以使用。
如果你需要使用BSA，则事先和溶解于PBS中定量的BSA溶液按比例混合。
祝实验顺利！是的我想用的浓度是250umol/L 、500umol/L,也有可能用2mmol/L。
请问为什么要用氮气吹干呢，用超净工作台上的风把它吹干行吗，先将其溶解又将其吹干的道理是什么？我的确是要用BSA，您说“如果需要使用BSA，则事先和溶解于PBS中定量的BSA溶液按比例混合”，这个事先是什么意思？是不是说在用乙醇之前，另外乙醇的浓度是用多大的？还有按比例混合是按多大的比例呢。
linliangsong这位朋友能给详细解释一下吗？我还看到一些文献上说用蛋白吸附的机理来溶解游离脂肪酸，请问是否就是您告诉我的这个办法呢？哈哈，这个问题困惑了我好久，因为我的实验也是在培养基中加入脂肪酸。
为此问题专门阅读了大量的文献。
发现，国外几乎普遍的做法都是上面我向你介绍的那种。
因为我的脂肪酸特别少，只买了几十毫克，根本没有办法用天平称量，所以就全部拿来配溶液。
首先是用乙醇溶解试剂瓶中那点几乎肉眼看不到的脂肪酸，然后将其全部转移到一个具塞小试剂瓶中。
氮气吹干，用0.15M KOH溶液溶解。
我用的是fatty acie free BSA组分V。
文献中一般说明脂肪酸和BSA的摩尔比4：1。
所以将定量溶解于PBS中的BSA与脂肪酸溶液按照这个比例原则进行混合，制成高浓度的母液。
然后再按照试验要求，添加到培养基中。
其中氮气吹干在一定程度上起到保护的作用。
谢谢这位朋友，我算是问对了人。
我还想请问你一下你的FFA 和fatty acie free BSA是从哪里买的，我查了许多国内外文献几乎都是在SIBMA公司买的，而我在SIGMA公司的产品目录上看到最小的包装也是10g,而你知道我们做细胞培养只需要配umol/L数量级的浓度，所需量很少。
细胞培养过程中的注意事项及试剂配制
细胞培养过程中的注意事项及试剂配制一.常用设备准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。
配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。
培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。
必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO孵箱（孵育培养物）、2水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。
二.无菌操作无菌室的灭菌：1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。
2.CO孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者20.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。
2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75％酒精棉球擦净双手。
无菌操作的演示：1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。
3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。
如吸管不能碰到废液缸。
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。
三.器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：(1)新的玻璃器皿的洗消：1.自来水刷洗，除去灰尘。
2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
培养用液的配制
实验一培养用液的配制、除菌与分装【实验目的】1. 掌握常见培养用液的配制方法。
2. 掌握常用的灭菌方法。
3. 了解每种培养用液的作用。
【实验原理】常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和EDTA溶液。
PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和EDTA。
培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。
鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM 和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。
胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。
EDTA 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。
细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS 和EDTA 可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。
【试剂、材料与仪器】试剂：NaCl ；KCl；Na2HPO4；KH2PO4；EDTA；胰蛋白酶；HEPES；碳酸氢钠；MEM或PRMI-1640 培养基干粉；GPS材料：三蒸水，蒸馏水瓶，精密天平，药匙，称量纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH 试纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，消毒纱布，酒精喷壶，已高压灭菌试剂瓶（500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，移液管（5 mL、10 mL），封口膜仪器：超净工作台，加液枪，4℃冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。
第1组配制PBS并高压灭菌，第2组配制胰蛋白酶溶液并过滤除菌和分装，第3组配制EDTA溶液并分装高压灭菌，第4组配制培养基，第5组过滤除菌培养基并分装。
每个实验小组需准备试剂有：胰酶50 mL；EDTA 50 mL；培养基90 mL（使用前加入10 mL血清）。
293细胞培养
293细胞培养1.培养基DMEM ++丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：（1）37度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml离心管，加5ml培养基，500g离心5min，弃上清，加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml左右，记得晃匀。
3. 传代吸出旧培基，加5mlPBS洗1-2遍，用移液管加1ml胰酶，滚2遍吸出，37度放1min左右计时，看到变圆即加入新培基吹打，几下就好了，分到新瓶里。
我个人认为：293细胞贴壁后形成圆形，可能是细胞本身状态不是很好，细胞不够饱满，细胞的贴壁后的棱角不易显露出来，所以看上去类似圆形，而且细胞较小。
293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。
它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与ey 于1976年用DNA转染技术构建而成。
293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。
293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好。
一般来讲，1:10传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
BHK-21传代细胞培养
BHK-21传代细胞培养BHK是仓鼠肾细胞[原理]细胞在培养瓶壁上长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
[材料和试剂]1、细胞：贴壁BHK-21细胞株2、试剂：0.25％胰蛋白酶、配制好的DMEM培养液、小牛血清、双抗溶液、7.5%碳酸氢钠3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、胶塞、量筒、注射器、针头、酒精灯、污物缸等[操作步骤]1、应需要计算好培养液的总用量，按10%的比例加入血清，按1%的比例加入双抗。
用7.5%的碳酸氢钠调PH至7.0~7.2左右。
2、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
3、加入0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中为宜。
4、瓶口塞好胶塞，平放在实验台上。
约2~3分钟会看到贴壁细胞层出现细针孔空隙，赶紧将胰酶弃去，加入少量培养液终止消化。
5、用注射器将贴壁的细胞反复吹打，使其均匀分散成悬液，再加入足量的培养液，分成两到三瓶。
塞好胶塞，置37℃温箱中继续培养。
细胞培养常用溶液的配制一、青、链霉素溶液青霉素钠盐(80万IU／瓶) 5瓶链霉素(100万IU／瓶) 4瓶将两者溶于400ml0.9％的无菌生理盐水，分装小瓶，-20℃保存。
双抗在培养基中的终浓度为100IU/ml为宜。
二、7.5%碳酸氢钠溶液的配制称取碳酸氢钠7.5g，加入超纯水使总体积为100ml。
高压灭菌，分装于小瓶中，4℃贮存。
三、1%酚红溶液的配制首先配制1mol/L的NaOH溶液。
称取NaOH4.0g，加入100ml超纯水，使NaOH 完全溶解，在室温或4℃贮存（最好现用现配）。
配制好NaOH溶液后，再称取1.0 g 酚红置研钵中，加1mol/L的NaOH（不多于7.0ml），研磨使酚红完全溶解，加超纯水至100ml，高压消毒，在室温或4℃贮存。
四、0.25%胰蛋白酶溶液的配制氯化钠8.0g氯化钾0.2g柠檬酸钠(Na3C6H5O7•5H2O) 1.12g磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O) 0.056g碳酸氢钠 1.0g葡萄糖 1.0g胰蛋白酶（1：250） 2.5g超纯水加至1000ml放4℃冰箱过夜，待胰蛋白酶充分溶解后，用0.2um微孔滤膜过滤除菌，分装于小瓶中，-20℃保存。
细胞培养液配制的流程
细胞培养液配制的流程
细胞培养液配制的流程：
①材料准备：
- 准备所需的所有化学试剂、培养基粉末、抗生素、血清、pH指示剂、无菌水或三蒸水。
②滤器消毒：
- 准备0.45μm和0.22μm孔径的滤膜，浸入三蒸水中，然后置于滤器上，打包后进行高压蒸汽灭菌。
③容器准备：
- 确保所有使用的容器（如烧杯、量筒、移液管等）都是干净且无菌的。
④溶解培养基：
- 将培养基粉末倒入无菌容器中，加入预热的三蒸水，使用磁力搅拌器充分搅拌直至完全溶解。
⑤添加补充成分：
- 按照实验需求，向溶解的培养基中加入nahco3、抗生素（如青霉素和链霉素）、L-谷氨酰胺等成分。
⑥加入血清：
- 如果配方需要，加入胎牛血清或其他类型的血清，通常为10%或20%体积比。
⑦ pH调节：
- 使用pH计检测溶液的pH值，根据需要加入1N HCl或1N NaOH进行调节，直至达到目标pH值。
⑧温度控制：
- 将配制好的培养液加热至接近细胞培养的温度（37°C左右），以防止温度骤变影响细胞。
⑨过滤除菌：
- 通过0.22μm孔径的滤器过滤培养液，以除去任何可能存在的微生物。
⑩分装：
- 将过滤后的培养液转移到无菌的细胞培养瓶或培养皿中，避免空气中的微生物污染。
⑪标记与记录：
- 在容器上标记培养液的类型、批号、配制日期以及有效期，并记录所
有操作细节。
⑫储存：
- 将配制好的培养液储存在适当的温度下，通常是4°C，直到使用前再恢复至室温或培养温度。
L02细胞培养及转染
L02细胞培养--复苏/传代/转染/计数/冻存主要试剂：1.培养基：RPMI1640（gibico）2.胎牛血清（天津灏洋）3.质粒小抽试剂盒（美国Omega生物技术公司）4.Lip2000（invirtrogen）5.0.25% 胰酶EDTA溶液：0.25 g 胰蛋白酶0.02 g EDTA-Na2溶解于100 mL冰冷PBS中，0.22 m滤器过滤，-20℃分装保存。
6.细胞冻存液：10% DMSO加全血清。
7.青链霉素混合液（100×）（天津灏洋）8.10×PBS80gNaCL，2gKCL，2.4gKH2PO4，14.4gNa2PO4·H2O溶解于800ml双蒸水中定容至1L。
【复苏：】细胞复苏的原则：快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
（一）实验前准备：1、将水浴锅预热至37℃2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
3.、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等4、将RPMI1640培养液、胎牛血清、从4℃冰箱拿出5、配制适量含10％的胎牛血清及青莲霉素混合液（1×）的完全培养液放入4℃冰箱内备用。
（二）细胞复苏：1.取液氮中冻存细胞，于37°C水浴锅中不断的摇动，使管中的液体在1min 内迅速融化，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，拿入超净台内，将冻存管内细胞吹打混匀后吸入10ml离心管内，缓慢加入5-8 ml含胎牛血清和青链霉素的完全培养液。
2.离心机内配平离心，1000 r/min 离心5min，吸弃上清液，将剩余细胞吹打混匀制成悬液转移入培养瓶内，加入完全培养液6ml，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内孵育。
【消化及传代】1.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
常用细胞培养基配方及缓冲液
常用细胞培养基配方及缓冲液细胞培养基是为了在体外维持细胞生长和增殖所设计的一种营养液。
细胞培养基的配方要求提供细胞所需的基本营养物质，如氨基酸、糖类、维生素和激素，并提供适当的pH和离子平衡。
同时，缓冲液也是细胞培养过程中不可或缺的一部分，用于稳定细胞培养基的pH，维持细胞正常的生长环境。
下面列举几种常用的细胞培养基配方及缓冲液：1. DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)-细胞培养基配方：-DMEM培养基粉末-对应体积的无菌水-10%火马骅胎血清(FBS)-1%青霉素/链霉素(P/S)-缓冲液：无2. RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute Medium) -细胞培养基配方：-RPMI1640培养基粉末-对应体积的无菌水-10%火马骅胎血清(FBS)-1%青霉素/链霉素(P/S)-缓冲液：HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)溶液，浓度为25mM，用于稳定pH。
3. MEM (Minimum Essential Medium)-细胞培养基配方：-MEM培养基粉末-对应体积的无菌水-10%火马骅胎血清(FBS)-1%青霉素/链霉素(P/S)- 缓冲液：盐酸/NaOH缓冲体系，通常用NaHCO3/N-2-羟乙基piperazine-N'-2-乙磺酸(HEPES)缓冲。
4. Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)-细胞培养基配方：-HBSS培养基粉末-对应体积的无菌水-缓冲液：无5. L-15 Medium (Leibovitz's L-15 Medium)-细胞培养基配方：-L-15培养基粉末-对应体积的无菌水-10%火马骅胎血清(FBS)-缓冲液：HEPES溶液，浓度为25mM。
6. DMEM/F12 Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium and Ham's F-12 Medium)-细胞培养基配方：-DMEM/F12培养基粉末-对应体积的无菌水-10%火马骅胎血清(FBS)-1%青霉素/链霉素(P/S)-缓冲液：HEPES溶液，浓度为25mM。
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1 PBS液
溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4•H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2 g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。
用HCl或NaOH调PH到7.4。
消毒后即可使用
2 胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。
搅拌混匀，置于4℃内过夜。
3.青、链霉素溶液：
所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。
具体操作均在超净台内完成。
青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。
链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。
分装于－20℃保存。
使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。
4 血清的灭活：
细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭活30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。
5谷氨酰胺一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。
可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。
配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液
6.肝素溶液的配制：
含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ ml。
因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为??℃。
使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。
7.Hanks液：
称取KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2H PO4.H2O 0.06g，加H2O至1000ml
注：Hanks液可以高压灭菌。
分装于4℃下保存。
8.D-hanks液：
1液：NaCL:8.00g/L，KCL : 0.04g/L，Na2HPO4.2H2O:0.06g/L，KH2PO4:0.06g/L，配500毫升；
2液：NaHCO3：0.35g/L，配100毫升；
3液：酚红：0.02g，用数滴NaHCO3溶解酚红
将2，3液移入1液中。
定容到1000毫升PH值是7.4左右。
分装于4℃下保存。