福建省稻田土壤细菌群落的 16S rDNA-PCR-DGGE.
利用16S rRNA测序、PCR-DGGE和qRT-PCR方法分析肉牛瘤胃上皮细菌群落特征
利用16S rRNA测序、PCR-DGGE和qRT-PCR方法分析肉
牛瘤胃上皮细菌群落特征
Li M;赵圣国
【摘要】目前对于附着于瘤胃上皮的细菌群落及其功能了解较少,本研究目的是利用16S rRNA测序、PCR-DGGE和qRT-PCR方法比较分析肉牛瘤胃上皮与瘤胃内容物细菌群落的多样性差异.从6个16S rDNA(～1.4 kb)文库中随机选取2785条序列,结果表明3个瘤胃内容物文库与3个瘤胃上皮文库的细菌群落存在差异.以97％的序列相似度进行计算,结果发现瘤胃内容物菌群文库的多样性指数
(4.12/4.42/4.88)比瘤胃上皮组织菌群文库的多样性指数(2.90/2.73/3.23)高.厚壁菌门和拟杆菌门分别是瘤胃上皮组织和内容物的优势菌群,纤维杆菌门、浮霉菌门和疣唯菌门仅在瘤胃内容物中存在.通过PCR-DGGE对22头阉牛瘤胃内容物和瘤胃上皮的细菌群落分析,进一步证实瘤胃上皮栖息着一类以厚壁菌为主的独特菌群,这类菌不仅具有消化饲料的作用,还有其他未知功能.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2013(040)001
【总页数】1页(P84)
【关键词】瘤胃细菌多样性;变形梯度凝胶电泳;16S rRNA序列分析;菌群比较【作者】Li M;赵圣国
【作者单位】;
【正文语种】中文。
三江平原根际微生物群落结构研究
三江平原根际微生物群落结构研究刘峰;王建波;谢立红;许修宏【摘要】The law of change of the Bacterial community structure of soil in Deyeuxia angutifolia community were studied on with the large generally used PCR-DGGE technology in the growing season (July 2012), the maturity (August 2012) and the autumn (September 2012). Results showed that Bacterial community struc-ture of soil in different period were Significantly different, in which the diversity index of soil bacterial community in the matu-rity was the highest, up to 3.23. By wetland soil fungi 16S rDNA gene sequencing analysis shows that proteobacteria were main groups of wetland soil bacteria in Sanjiang plain.% 采用PCR-DGGE技术，研究小叶章湿地土壤细菌群落结构的生长期（2012年7月）、成熟期（2012年8月）和凋落期（2012年9月）的变化规律。
结构表明各个时期的细菌群落结构差异显著的，其中成熟期土壤细菌群落的多样性指数最高为3.23；对湿地土壤真菌16S rDNA基因测序分析可知，其中变形菌纲（proteobacteria）为三江湿地土壤细菌的主要类群。
16SrDNA高通量测序技术分析油藏微生物多样性
16S rDNA高通量测序技术分析油藏微生物多样性*许颖1,2**马德胜1,2宋文枫1,2魏小芳1,21中国石油勘探开发研究院北京1000832提高石油采收率国家重点实验室北京100083摘要本研究以16S rDNA为分子标记，通过高通量测序技术对三口采油井的油藏微生物多样性进行了全面和深入的分析。
对三个DNA样本中细菌16S rDNA的PCR扩增产物进行高通量测序，得到123,360条优化序列，测序深度指数超过99.9%。
根据序列相似性进行聚类分析，得到139个OTU。
基于OTU的物种分类分析发现三个样本中的细菌种类覆盖91个属、29个纲和20个门，其中包括多种采油有益菌。
分别对各个样本的菌种组成和相对丰度进行分析，发现不同采油井的主要菌种组成和优势类群呈现出差异性。
结果表明，16S rDNA高通量测序能更加全面、准确和深入地反映油藏微生物多样性情况，为微生物采油技术提供有用和必要的背景信息。
图6表1参27关键词油藏；微生物多样性；16S rDNA；高通量测序CLC TE357收稿日期Received: 接受日期Accepted:*中国石油天然气股份有限公司科技攻关专项（2014A-1006）Supported by CNPC Programs f or Science and Technology Development (2014A-1006).**通讯作者Correspondingauthor(E-mail:*************************.cn)16S rDNA-assisted analysis of microbial diversity in oil reservoirs by NGS*XU Ying 1,2**, MA Desheng1,2, SONG Wenfeng1,2& WEI Xiaofang1,21PetroChina Research Institute of Petroleum Exploration & Development, Beijing 100083, China2State Key Laboratory of Enhanced Oil Recovery, Beijing 100083, ChinaAbstractObjectives:Indigenous microbial community in oil reservoirs has great influenceon the application ofmicrobial enhanced oil recovery technology (MEOR). This paper aims to obtain accurate information about microbial diversity in oil reservoirsby the aid of a recently developed next generation sequencing technology(NGS). In this study, NGSand application of 16S rDNA molecular marker were combined.Methods:Total DNA of three samples was extracted separately, followed by amplification of bacterial 16S rDNA fragment. PCR productswere sequenced on the Illumina Miseq platform.Sequencing datasetwith high quality was collected for further analysis. Identification of bacteria at different taxonomic levels was performed basedon the result of blast against annotated16S rDNA database. Microbial diversity ineach samplewas analyzed separately and comparison among them was alsoperformed.Results: 123,360 16S rDNA sequences with high quality were obtained and thesequencing coverage was more than 99.9%. These sequences were clustered into 139 OTUs. Bacterial species detected in these samples covered 91 genera, 29 classes and 20 phyla, including many groups beneficial for MEOR.Bacteria(e.g.,Arcobacter, Pseudomonas and Acinetobacter)that can utilize petroleum hydrocarbons as sole carbon sources were detected,eventhose with extremely low abundance.Moreover, the analysis of microbial community structure for each sample showeddifferentpatterns ofcomposition characteristicsand dominant groups.Conclusions:The results indicate that analysis basedon high-throughput sequencing data of 16S rDNA fragments is powerful in reflecting microbial community structure accurately and provides more information for MEOR compared to traditional methods.Keywords oil reservoirs; microbial diversity; 16S rDNA; high-throughput sequencing/ next generation sequencing (NGS)油藏环境是一种独特的生态环境，其中存在着丰富的微生物资源[1-3]。
PCR-DGGE技术及其在环境微生物领域中的应用
PCR-DGGE技术及其在环境微生物领域中的应用于洁;冯炘;解玉红;刘淑琮【摘要】变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术目前已被广泛应用于环境微生物领域.介绍了DGGE的基本原理和技术步骤,分析了该方法的主要影响因素及其优点和存在的问题;概述了PCR-DGGE技术在环境微生物领域,包括在微生物处理技术、微生物生态多样性研究和功能菌种优化筛选中的应用现状,并展望了其应用前景.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(038)006【总页数】8页(P227-234)【关键词】变性梯度凝胶电泳;微生物处理;微生物多样性;菌种筛选【作者】于洁;冯炘;解玉红;刘淑琮【作者单位】天津理工大学,环境科学与安全工程学院,天津,300384;天津理工大学,环境科学与安全工程学院,天津,300384;天津理工大学,环境科学与安全工程学院,天津,300384;天津理工大学,环境科学与安全工程学院,天津,300384【正文语种】中文【中图分类】Q93-33变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术,是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术[1]。
此后，DGGE技术一直被较多地应用于基因突变的检测[2-3]，以及癌症和遗传病的筛查及诊断中。
1993年，Muyzer等[4]首次将DGGE技术应用于研究微生物菌苔和生物膜系统的群落多样性，证实了这种技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。
在此之后，DGGE技术开始在环境微生物研究中应用并得到发展[5-6]。
该法在应用中除其自身具有的明显优势外，也出现了一些不足之处。
本文对DGGE技术原理和技术步骤进行了分析，并对该技术在环境微生物领域中的应用情况进行了整体评述，以期为DGGE技术更好地应用于环境微生物研究提供更多的理论依据。
细菌16S rDNA V3区的PCR-DGGE分析
1.16S rDNA-V3高变区的扩增1) 细菌基因组总DNA16S rDNA-V3高变区的扩增，50 µL体系：10×缓冲液（不含Mg2 +） 5 µLdNTP(10 mmol L-1) 1 µL引物341F、517R(10 μmol L-1)各0.5 µLMg2 + (25 mmol L-1) 2.5 µL普通Taq DNA聚合酶 2.5 UBSA（牛血清白蛋白1 mg mL-1） 5 µLDNA模板100 ngddH2O 补至50 µL2) PCR 扩增条件为：94℃ 5 min94 ℃ 1 min65℃ 1 min 降1℃72℃ 1 min94℃ 1 min 10个循环65℃ 1 min 降1℃72℃1min94℃1min55℃1min 20个循环72℃1min72℃10 min2.变性梯度凝胶电泳（DGGE）PCR产物用基因突变检测仪分析，PAGE(聚丙烯酰胺)胶浓度为8%（w/v），变性梯度为40%～60% (100%的变性剂为100 mL溶液中含有42 g的尿素和40 mL的甲酰胺)。
a)配制40％变性溶液:试剂8％胶40％丙烯酰胺／二聚丙烯酰胺20 mL50×TAE 缓冲液 2 mL甲酰胺（去离子）16 mL尿素16.8 gddH2O 补至100 mLb)配制60％变性溶液:试剂8％胶40％丙烯酰胺／二聚丙烯酰胺20 mL50×TAE 缓冲液 2 mL甲酰胺（去离子）24 mL尿素25.2 gddH2O 补至100 mLc)按说明书组装梯度制胶器；d)在电泳槽中装入7 L 1×TAE 电泳缓冲液；e)取40%和60%变性溶液各15 mL，分别加入过硫酸铵（10%）150 µL，TEMED15 µL，混匀，灌胶；f)标记为低浓度（L）和高浓度（H）的注射器分别吸入全部40％和60％变性胶溶液，通过一系列连接装置，按说明书灌至自上而下浓度由低到高的连续梯度凝胶；g)小心插入梳子，让凝胶聚合大约一个小时,并把电泳控制装置打开，预热电泳缓冲液到60℃；h)PCR产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，用注射针进样；i)电泳条件：60℃，40 V，20 min 预电泳；150 v，约7 h；j)电泳完毕后，先拨开一块玻璃板，然后将胶放入盘中。
对二氯苯对湿地土壤细菌群落多样性的影响
对二氯苯对湿地土壤细菌群落多样性的影响摘要:利用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)考查了对二氯苯胁迫对湿地土壤细菌群落多样性的影响｡通过不同培养时间(4､18和45 d)和不同培养浓度(120､240､360和600 mg/kg)对二氯苯污染下湿地土壤细菌群落基因组的变性梯度凝胶电泳(DGGE)多样性分析｡结果表明,各处理下的土壤细菌群落多样性在不同处理时间有明显差异｡培养初期对二氯苯对土壤细菌群落抑制作用非常显著,土壤细菌中某些群落的生长受到抑制;不同处理在处理后期差异很小｡在土壤培养初期,含对二氯苯240 mg/kg的培养基上出现一条新增条带,为对照和低浓度对二氯苯土壤所没有,说明土壤中存在对二氯苯生长优势菌｡关键词:变性梯度凝胶电泳(DGGE);对二氯苯;湿地土壤细菌菌群;多样性Effect of 1,4-Dichlorobenzene on Diversity of Bacteria Communities in Wetland SoilAbstract: The effect of different concentration of 1,4-dichlorobenzene(120,240,360 and 600 mg/kg) with different cultivation time (4, 18 and 45 d) on wetland bacterial community diversity was studied using PCR-DGGE technique. The results showed that the effect of each concentration of 1,4-dichlorobenzene on genetic diversity of soil bacteria differed at different treating time. In early treatment period, soil bacterial community was inhibited obviously. The difference among different treatments in later period was little. In early treatment period, a new medium band emerged in the culture medium of 240 mg/kg of 1,4-dichlorobenzene treatment, indicating that there were special microbial species resistant to 1,4-dichlorobenzene existed in the soil. Key words: DGGE; 1,4-dichlorobenzene; wetland soil bacteria communities; diversity土壤微生物在土壤生态中扮演了重要角色[1],并且参与地球生物生态系统的化学循环,进行污染物质的降解[2,3]｡但是由于土壤微生物个体微小､数量众多､土壤环境条件复杂等原因,用常规的分离培养法很难全面有效地评估土壤中微生物群体多样性及环境污染对土壤微生物的影响,极大地限制了人们对土壤微生物的认识[4]｡伴随分子生物学技术在环境科学领域的不断应用,不经传统培养,直接从土壤中抽取出土壤微生物总DNA,利用微生物遗传多样性及区系基因变化来进行污染物环境效应的评价,正在被广泛采用[5-7]｡研究排除其他因素,通过提取湿地土壤细菌群落总DNA,经PCR扩增､变性梯度凝胶电泳(DGGE),获得土壤细菌群落16S rDNA V3序列分布,以此研究对二氯苯对土壤细菌群落多样性的影响｡旨在为更直接更可靠地反映对二氯苯胁迫下湿地土壤细菌群落的组成情况,评估污染条件下土壤微生物的多样性｡1 材料与方法1.1 供试土壤供试土壤取自盐城海滨湿地土壤,无人为污染｡收集10~20 cm处新鲜土壤,室内阴干,研磨,充分混匀,过40目筛｡1.2 试验设计试验选择20 cm × 40 cm的塑料桶,桶内加入2 kg土壤,加入适量去离子水,使水面浸过土壤1~2 cm｡桶内加入配制好的对二氯苯母液,使桶内对二氯苯浓度分别为0､120､240､360和600 mg/kg,每组3次重复,室温20 ℃培养｡培养过程中不断补水,保证水位高于土壤1~2 cm｡分别在第四天､第18天和第45天时,从桶内0~10 cm深度处取土样10 g,采集后的土壤样品-20 ℃保存｡1.3 土壤中细菌群落DNA的提取2 g土壤样品加0.25 g直径0.1 mm 玻璃珠,再加2 mL 0.1 mol/L pH 8.0磷酸缓冲液,混匀5 min,室温3 000 r/min离心2 min;提上清液,室温12 000 r/min离心15 min,弃上清液,加入370 μL消化液(100 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L磷酸钠,1.5 mol/L NaCl,1% CTAB,pH 8.0),30 μL 10% SDS,10 μL溶菌酶,46 ℃水浴1 h,加10 μL蛋白酶K(20 mg/mL)水浴4 h;加500 μL氯仿､苯酚混合物,混匀10 min,室温12 000 r/min离心,留上清液,加等体积氯仿-异戊醇(24∶1,V/V) 混匀10 min;室温8 000 r/min离心5 min,留上清液,加醋酸钠30 μL 12 000 r/min离心15 min,加1 mL 70% 乙醇,室温10 000 r/min离心5 min;弃上清液,倒置风干,加50 μL pH 8.0 TE缓冲液｡取一定量样品进行1%的琼脂糖凝胶电泳,检测土壤细菌群落总DNA 的提取质量[8]｡1.4 PCR扩增扩增反应体系:10×PCR缓冲液5 μL,MgCl2(25 mmol/L) 4 μL,dNTP 2 μL,上下游引物各1.5 μL,模板DNA 1 μL,Taq酶(10 000 U/mL) 0.5 μL,加去离子水至50 μL｡反应条件为:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共进行30个循环;72 ℃延伸10 min｡PCR反应在Eppendorf AG公司的22331型PCR仪上进行｡反应结束后取5 μL反应液在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测｡用于16S rDNA的PCR扩增反应的引物序列为:338F(CCTACGGGAGGCAGCAG)和518R(ATTACCGCGGCTGCTGG)｡1.5 变性梯度凝胶电泳和染色PCR产物加入到8%(m/V)聚丙烯酰胺凝胶中,凝胶的变性范围为40%~60%｡利用DGGE-1B型电泳系统,在60 ℃､150 V､1×TAE Buffer下电泳330 min｡电泳结束后,用固定液(10%冰醋酸)固定凝胶20 min,用去离子洗涤凝胶3次,每次2 min,取出凝胶板竖起控水15 s,将洗后的凝胶浸泡在染色液(含0.15%硝酸银和150 μL甲醛的混合液)中20 min,然后取出凝胶,在去离子水中浸洗10 s,立即浸泡在显影液(含2.5%无水碳酸钠和25 μL甲醛的混合液)中,缓慢地摇晃至条带完全显现｡将凝胶置于中止液(0.5 mol/L EDTA-Na2)中浸泡10 min,再用去离子水浸洗凝胶3次,取出凝胶竖起控水[9]｡1.6 指纹图谱生物信息学分析采用Ward法计算各样品间的相似指数,DGGE指纹图谱分析借助于Bio-Rad公司的凝胶成像系统进行条带判读,以配套软件Quantity One进行迁移率､强度､面积计算,并计算样品间的相似指数､绘制泳道间遗传图｡2 结果与分析2.1 对二氯苯处理4 d后湿地土壤细菌群落总DNA的DGGE分析图1为不同浓度对二氯苯处理土壤4 d后土壤细菌群落DGGE分析结果｡由图1可知,试验初期,不同浓度对二氯苯胁迫下湿地土壤细菌群落的基因条带出现较明显的差别｡与对照相比,低浓度对二氯苯胁迫下条带变化不大,但其中条带a､b亮度变暗消失,条带c､d亮度增加｡表明湿地土壤中大多数细菌群落对低浓度对二氯苯有一定的耐受性,基本不受影响,甚至对某类微生物具有一定的刺激作用,产生新条带,如条带e｡而360 mg/kg时,某些微生物对较高对二氯苯胁迫较为敏感,数量大大降低,达到DGGE分辨率下限｡电泳图谱泳道间的遗传簇关系(图2)同样印证了上述结果,在图2中,对二氯苯浓度为120 mg/kg时与对照最为接近,第3､第4和第5泳道则与对照的相似性为57.8%~75.0%,较处理初期时明显降低｡随着土壤中对二氯苯浓度的增加,土壤中细菌群落基因多样性受到的影响也逐渐增强,到土壤对二氯苯浓度为240 mg/kg时,整个泳道条带出现明显差别｡值得注意的是,在土壤处理4 d时,240 mg/kg对二氯苯浓度下,出现一条新增条带,而对照及其他浓度下土壤都没有,说明土壤中可能有在对二氯苯较高浓度下良好生长的微生物种｡2.2 对二氯苯处理18 d土壤细菌群落总DNA的DGGE分析图3为不同浓度对二氯苯处理18 d土壤中细菌群落DGGE分析结果｡由图3可知,在处理18 d时,与对照相比,120 mg/kg对二氯苯胁迫与对照土壤的细菌群落有77.4%的相似性,再次说明湿地土壤中大多数细菌对对二氯苯有耐受性,另一些细菌则受到了抑制,表现出条带亮度变暗,如图3中的条带a､b｡第3和第4泳道上出现的条带c则表明在240 mg/kg和360 mg/kg浓度下有适应该浓度的细菌,在240 mg/kg浓度处理4 d时出现的新条带反映的可能是此种细菌,随着土壤中对二氯苯的挥发,原来360 mg/kg浓度降低至该种细菌能适应的浓度｡由处理18 d时电泳图谱泳道间的遗传簇关系(图4)可见,第2､第3和第4泳道与对照的相似性为73.4%~76.5%,较处理初期相比有所提升,而对二氯苯含量600 mg/kg的相似性也从处理初期的62.7%提高到了69.4%｡造成这种情况的原因可能是随着对二氯苯的在土壤中的降解以及挥发,在土壤中的有效浓度降低,微生物的生长受到的抑制作用减小所引起的｡值得注意的是,在土壤处理18 d时,原来在240 mg/kg浓度时出现的新条带也在360 mg/kg时出现了,而对照及其他处理都没有,更加肯定了此种微生物能适应土壤中适宜的对二氯苯浓度｡2.3 对二氯苯处理45 d土壤细菌群落总DNA的DGGE分析对二氯苯处理45 d时土壤细菌群落DGGE电泳图谱与处理4 d时相比发生了较大的改变,各浓度对二氯苯处理下条带数目有所增加(图5),在土壤培养45 d时,不同处理土壤样品之间差异开始变小,对二氯苯浓度为120 mg/kg时谱型与对照的相似性为84.3%,但亮度稍变暗;对二氯苯浓度为360 mg/kg时谱型与对照的相似度达到71.5%｡图6中不同处理谱型与对照的相似性都在70.0%以上,其中120 mg/kg处理时更是达到84.3%｡表明在土壤培养45 d时,不同对二氯苯浓度的土壤样品之间的差异开始变小｡3 结论通过对不同处理时间､不同浓度对二氯苯胁迫下湿地土壤的细菌群落总DNA 进行DGGE多样性分析,结果表明,不同浓度对二氯苯对湿地土壤细菌组成产生了明显影响｡不同浓度对二氯苯不仅影响了组成细菌群落的细菌种群数目,还使细菌群落结构以及多样性发生了改变｡说明土壤细菌群落中各个种群是相互作用的,各土壤样品细菌群落遗传多样性是对各种群的群体性反映｡但是细菌群落遗传多样性并不是简单地随着对二氯苯浓度提高而减小｡在较低浓度对二氯苯污染的样点,DGGE图谱条带数目虽然变化不大,但组成图谱的条带亮度不同｡说明不同种类的细菌不仅对对二氯苯的敏感性不同,而且对不同程度的对二氯苯污染敏感性也不同｡考虑到细菌种群之间诸如偏利､协同､共生､偏害､竞争等复杂的关系,可能是一定程度的对二氯苯污染改变了群落内部种群之间的关系,某些对对二氯苯敏感的细菌的消亡或者一些耐受对二氯苯的细菌产生的抗性保护了其他种群的细菌｡细菌群落的耐受性可能是因为后天适应､基因突变或者通过群落结构中种群组成的改变而更具有耐受性｡对二氯苯污染土壤微生态环境与细菌多样性的内在关系主要表现在作用与反作用､抑制与适应､稳定与变异､诱导与重建的相互依存､相互影响､共同演化,其结果使得适应对二氯苯胁迫环境的优势菌群得以保留,群落结构和多样性发生变化,耐受性提高｡在研究中,在土壤处理初期含对二氯苯240 mg/kg的培养土中出现一条新增条带,为对照及其他处理土壤所没有,处理后期随着对二氯苯浓度降低而消失,说明土壤中存在着适应对二氯苯适宜浓度而良好生长的细菌｡参考文献:[1] ARTURSSON1 V, FINLAY R D, JANSSON J K. 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用PCR-DGGE和16S rDNA测序解析吐温对绵羊瘤胃细菌多样性的影响
Ａｂｓｒ ｃ ： Ｆｉ ｅ Ｃｈ ｎｅ ｅ Ｍ ｅ ｉ ａ ｅ ｓ ｅ ｐ ｆｔ ｅ ｔ ｅ ｐｅ ｕａ ｕ ｅ ｉ ｔ ａ ｗｅ ｅ ｕｓ ｄ ｉ ｔａ ｔ ｖ ｉ ｓ ｒｎｏ ｍ ｌ ｈ ｅ ｉｔ ｄ ｗｉｈ ｐ ｒ ｔ １ｒ ｍ ｎ ｆｓ ｕｌ ｒ ｅ ｎ ａ ５× ５ Ｌａ ｉ ｔｎ ｓ ａ ｅ ｄ ｓｇｎ ｄ ｅ ｐｅ ｉ ｅ Ｏ ｅ ａ ｎｅ ｔ ｅ ｅ ｆ ｃ ｓ ｏｆｓ ｐｌ ｍｅ ｔ ｔｏｎ Ｔｗｅ ｎ ８ ｎ ｑｕ ｒ ｅ ｉ ｅ ｘ ｒｍ ｎｔｔ ｘ ｍｉ ｈ ｆｅ ｔ ｕｐ ｅ ｎ ａ ｉ ｅ Ｏ ａ ｄ Ｔｗｅ ｎ ２Ｏ ｏ ｈｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｕ— ｍｅ ａ ｔ ｒａ ｉ ｅ ｓｔ ．Ｔｈｅ ｆｖ ｒ ａ ｍ ｅ ｔ ｒ ｈ ｓ ｌｄ ｅ ｔ ｏ ｒ １ ｎｄ ｔ ａ ａ ｉ ｔｓ ｐｌｍ ｅ ｎ ｂ ｃ ｅ ｉ ｌｄ ｖ ｒ ｉｙ ｉ ｅ ｔ ｅ ｔ ｎ ｓｗｅ ｅ ｔ ｅ ｂａ ａ ｉ ｔ（ ｈｅ ｃ ｎｔ ｏ ）ａ ｈｅ ｂ ｓ ｌｄ ｅ ｕｐ ｅ ｎ—
优势菌种类增加 ， 温 ８ 吐 Ｏ和低 剂 量 的 吐 温 ２ Ｏ使 优 势 菌 种 类 下 降 。在 绵 羊 瘤 胃细 菌 中 ， 吐 温 ２ 受 Ｏ和 吐 温 ８ Ｏ影 响 的
种类 不 同 。
关 键 词 ： 非 离 子 表 面活 性 剂 ； 羊 ； 胃 ； 菌 ；聚 合 酶 链 式 反 应 一 变 性 梯 度 凝 胶 电泳 绵 瘤 细
新 疆 农 业 大 学 学 报 ２ １ ，３ ６ ：６ ～４ ４ ０ ０ ３ （ ） ４ ９ ７ Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆＸｉｊａ ｇＡ ｒｃ ｌ ｒ ｌ ｎｖｒｉ ｏ ｒ ａ ｎ ｉｎ ｇ ｉｕｔ ａ ｉ ｓｔ ｏ ｕ Ｕ ｅ ｙ
【国家自然科学基金】_16s rdna测序_期刊发文热词逐年推荐_20140731
灵菌红素 海藻叶面 沼泽红假单胞菌 油井采出液 污泥 毛竹入侵 正交试验 次级代谢产物 植原体 桶装纯净水 条件选择 机理 施万菌属 抗生素溶杆菌(l.antibioticus) 抑菌活性 微生物群落 微生物絮凝剂 微生物多样性 微生物 山羊 宁波 好氧异养硝化菌 奶牛瘤胃 天目山 多聚酮合酶(pksⅰ) 基因测序 培养条件优化 培养条件 培养时间 培养基 埃氏巨型球菌 土壤 嗜盐菌 嗜热菌 叶围细菌 可培养性 原虫 单级自养脱氮 北仑港 创伤感染细菌 分子鉴定 准噶尔乌头 光合产氢 低温条件 产甲烷菌 乳酸发酵 wolbachia t-rflp s-te rflp图谱 rflp分析 pcr-rflp pc 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2010年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
2008年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 7喹啉 叶蝉科 叶绿体16s rdna 反硝化 厌氧发酵 半翅目 分离菌 分离 分子鉴定 低磷 人参 产氢能力 wsp pseudomonas putida pcr-rflp pcr 28s d2 rdna 8 细菌多样性 2 生物降解 2 wsp 2 wolbachia 2 高氯酸盐还原降解菌 1 香根草 1 链霉菌 1 铁矿尾矿 1 鉴定 1 贫营养细菌 1 螟黄赤眼蜂 1 蚤蝇科 1 荔枝病原菌 1 联合固氮菌 1 细菌 1 线粒体基因 1 纳豆枯草芽胞杆菌 1 系统发育分析 1 系统发育 1 稳定遗传性 1 硝化特性 1 瘤胃细菌区系 1 甲基叔丁基醚 1 生长曲线 1 生物强化 1 犊牛 1 烂尾病 1 溶解氧 1 海南木豆丛枝病 1 泥火山 1 植原体 1 核基因 1 柑桔黄龙病 1 枯草芽孢杆菌 1 斜带石斑鱼epinephelus coioides1 放线菌 1 扎布耶盐湖 1 异养硝化 1 序列分析 1 多样性 1 哈维氏弧菌vibrio harveyi 1 变性梯度凝胶电泳(dgge) 1 变性梯度凝胶电泳 1 厌氧氨氧化菌 1 单级自养脱氮系统 1 分离鉴定 1 分子系统学 1 免培养技术 1 产酸克雷伯菌 1 亚硝化/电化学反硝化 1 亚洲柑桔木虱 1
稻田固氮细菌分离物的PCR—DGGE及其序列同源性分析
ＰＣＲ－ ＤＧＧ Ｅ ｎ ｍ ｏｏ ｃ ｌａ ｌ ｅ ｎ ｉｏ ａ ｅ ｆｎｉｒ ｇ ｎ ｆｘ ｎ ａ ｄｙ ｓ ｉ ｂ ｃ ｅ ｉ ａ ｄ ｈｏ ｌｇｉａ ｎａｙｓ ｓｏ ｓ ｌ ｔ ｓｏ ｔ ｏ ｅ － ｉ ｉ ｇ ｐ ｄ ｏ ｌ ａ ｔ ｒａ
ｒ ｚｂｕ ｓ ｈｉ ｏ ｉ ｍ ｐ．， Ｓｐｈｉ ｇｏ ｏ ｎ ｍ ｎａｓ ｐ．， Ｒｈｉ ｏ ｉ ｍ ｓ ｓ ｚ ｂｕ ｐ．， Ｂｒ ａｄｙｒ ｚ ｂ ｕｍ ｓ ．。 Ｋ ｌ ｂ ｉ ｌａ ｐ．， Ｂｕｒ ｏｌ ｒａ ｃ ｐａ— ｈｉ ｏ ｉ ｐ ｅ ｓｅ ｌ ｓ ｋｈ ｄｅ ｉ ｅ
Ｋ ｅ ｒ ｓ： ＰＣＲ— ｙ ｗｏ ｄ ＤＧＧ Ｅ ；ｐａ ｙ ｓ ｌ ｄｄ ｏｉ；ｎｉｒ ｔｏｇｅ － ｘ ｎ ａ ｔ ｉ ｎ ｆ ｉ ｇ ｂ ｃ ｅｒａ ｉ
生 物 固 氮 为全 球 的植 物 提 供 ７ 的氮 素 。 固 ５
１ Ｓｒ ６ ＲＮＡ Ｖ一３区 Ｒ— Ｄ ＧＧＥ． Ｔｈ ｏ ｇ ｅ ｕ ｎ ｉ ｇ ａ ｄ Ｂ ａ ｔ ｎ ｌ ｓｓ 一 ｉ ｉｇ ｂ ｃｅ ｉ ｓ ｒ ｉ ｓ ｗｅ ｅｂ ｌ ｖ ｄ ｔ ｅｏ ｇ ｔ ｅ ｏ ｒ ｕ ｈ ｓ ｑ ｅ ｃｎ ｎ ｌ ｓ ａｙ ｉ ，９ Ｎ２ ｆ ｎ ａ ｔ ｒ ｔａ ｎ ｒ ｅｉ ｅ ｏ ｂ ｌ ｎ ｏ Ｍ ｓ — ａ ｘ ａ ｅ
氮 微生 物通 过其 固氮 酶 ，将空 气 中 的氮 气还 原 为可
被作 物 吸 收 利 用 的 ＮＨ ，有 利 于 提 高 作 物 的 产 量 。对生 物 固氮资 源 的研 究 、开 发和 利用 有利 于发 展 可持续农 业 ，减 少 能源 消耗 和化学 氮肥 对环 境 的 负 面影 响［ ］ １ 。水 稻 是福建 省 的主要 粮 食作 物 ，水 稻种 植 面 积 占全 省 播 种 面 积 的 ６ 以上 。因 此 ， Ｏ 开 展稻 田土壤 固氮 细 菌研究 ，对于 开发 和利 用生 物 固氮资 源 ，发展 水稻 生产 ，确保 粮食 安 全生 产也 具
16s rdna测序原理
16s rdna测序原理16s rDNA测序是一种用于研究微生物群落结构和多样性的重要技术。
它通过对细菌和古菌16s rDNA基因的测序，可以揭示微生物的分类和系统发育关系，帮助科学家更好地了解微生物在自然界中的分布和功能。
下面，我们将详细介绍16s rDNA测序的原理及其在微生物学研究中的应用。
首先，我们需要了解16s rDNA是什么。
16s rDNA是细菌和古菌细胞中的一个重要基因，它编码了16s rRNA，是细菌和古菌的核糖体小亚基的组成部分。
由于16s rDNA在不同的细菌和古菌中存在一定的差异，因此可以作为分类和鉴定微生物的分子标记。
通过对16s rDNA序列的测定和比对，可以揭示微生物的遗传关系和系统发育地位。
在进行16s rDNA测序时，首先需要从样品中提取微生物的总DNA。
接下来，利用特异性引物对16s rDNA基因进行PCR扩增，得到16s rDNA的扩增产物。
然后，对扩增产物进行测序，获取16s rDNA的序列信息。
最后，利用生物信息学方法对测得的16s rDNA序列进行分析和比对，从而揭示微生物的分类和系统发育关系。
在微生物学研究中，16s rDNA测序被广泛应用于微生物群落结构和多样性的研究。
通过对不同环境样品中微生物16s rDNA序列的测定和分析，可以揭示微生物在不同环境中的分布和多样性，帮助科学家更好地了解微生物在自然界中的生态功能。
此外，16s rDNA测序还可以用于鉴定和分类未培养的微生物，为微生物资源的开发和利用提供重要的信息。
总之，16s rDNA测序是一种重要的技术手段，可以帮助科学家揭示微生物的分类和系统发育关系，了解微生物在自然界中的分布和功能。
随着测序技术的不断发展和进步，相信16s rDNA测序在微生物学研究中会发挥越来越重要的作用，为我们认识微生物世界提供更多的信息和启示。
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微生物学通报NOV 20, 2008, 35(11: 1715~1720 Microbiology© 2008 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@基金项目:福建省科技计划项目(No. 2001Z026; 国家配套项目[No. 闽科计(200361号]研究报告福建省稻田土壤细菌群落的16S rDNA-PCR-DGGE分析李友发1,2宋兵1,2宋亚娜1郑斯平1翟焕趁1,2郑伟文1*(1. 福建省农业科学院生物技术研究所福州 350003(2. 福建农林大学生命科学院福州 350002摘要:用不依赖细菌培养的16S rDNA-PCR-DGGE方法对福建省6个不同地区12个取样点的稻田土壤进行细菌群落结构分析。
对12份样品直接提取其总DNA, 用F341GC/R534引物扩增16S rDNA基因的 V3可变区, 结合DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis技术分析样品细菌群落组成。
结果表明, 福建省不同地区的稻田土壤之间细菌群落结构存在较大差异, 大体上可分为闽东、闽南、闽北、闽西4个大类。
同一地区的根际土和表土样品之间也存在差异, 但差异相对较低, 其中龙岩根际土和表土细菌群落结构相似性最大, 永泰差异性最大。
回收了DGGE图谱中11个条带, 测序结果经过Blast比对表明其中10个条带代表的细菌是不可培养的, 显示了DGGE 技术的优越性。
关键词: 稻田土壤, 细菌群落, 16S rDNA-PCR-DGGEAnalysis of the Bacterial Communities in Paddy Soils in Fujian Province Using 16S rDNA -PCR- DGGE LI You-Fa1,2 SONG Bing1,2 SONG Ya-Na1 ZHENG Si-Ping1ZHAI Huan-Chen1,2 ZHENG Wei-Wen1*(1. Biotech Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003(2. College of Life Science, Fujian Agriculture and Forest University , Fuzhou 350002Abstract: 16S rDNA-PCR-DGGE, a cultivation-independent approach, was used to analyze the bacterial communities in paddy soils in Fujian Province. The bulk soils and rhizosphric soils were sampled from six different ecological soil regions. Total DNA was directly extracted and amplified with the F341GC and R534 primers targeting the 16S rDNA V3. The amplified fragments were analyzed by perpendicular DGGE. Cluster analysis revealed that there was a high diversity of bacterial community compositions among differ-ent soil samples tested. Basically they could be grouped to Mindong (East, Minnan (South, Minbei (North and Minxi (West ecological regions. 16S rDNA-PCR-DGGE profiles from bulk and rhizospheric soil in the same region showed less bacterial diversity but more similarity. The bacterial community from bulk soil and rhizospheric soil in Longyan shared the most similar DGGE banding patterns, and the banding patterns in1716微生物学通报 2008, Vol.35, No.11Yongtai exhibited the highest diversity. Eleven DGGE bands recovered were re-amplified, sequenced and aligned with Blast. The results indicated that ten of the fragments belong to uncultivated bacteria implying DGGE technique having priority in analyzing uncultivated bacteria in the paddy soils.Keywords: Paddy soils, Bacterial communities, 16S rDNA-PCR-DGGE长期的水稻种植形成了独特的稻田土壤细菌群落。
这些细菌参与土壤物质转化过程, 在土壤形成、肥力演变、植物养分有效化和土壤结构的形成与改良等方面起重要作用[1]。
稻田土壤微生物的群落结构与数量可以作为衡量土壤肥力高低的重要指标。
段红平等通过平板分离计数发现, 丰富的水稻根际微生物类群数量是水稻高产的原因之一[2]。
宋铁英、郑伟文等应用PCR-DGGE技术在水稻不同生长期对福建省稻田蓝细菌群落结构进行了研究, 发现蓝细菌是稻田土壤微生物群落的重要组成部分, 对稻田土壤肥力有重要影响[3]。
不同于传统培养方法, 分子生物学方法不依赖室内培养, 能更全面、真实地反映微生物群落结构, 其中PCR-DGGE技术可靠、重复性好、快速, 已被广泛应用于微生物群落结构的研究[4]。
本文旨在利用PCR-DGGE方法揭示福建省不同生态区域稻田细菌群落结构, 以期从一个侧面为认识福建稻田细菌的遗传多样性及其与土壤肥力的关系等提供基础数据。
1 材料与方法1.1材料稻田土壤取自福建省6个不同地区, 取2 cm的表土及10 cm~15 cm 深处的根际土, 土壤理化性质见表1。
取样地内设5个取样点, 分别位于取样地四角和中心, 混匀, 置于液氮。
1.2方法1.2.1 样品总DNA的提取和纯化:DNA的提取参照Zhou等的SDS-based DNA extraction法[5], 唯一改动之处是, 在氯仿、异戊醇抽提前多加了一步等体积的酚、氯仿和异戊醇抽提。
DNA的纯化按Moreira的方法[6]。
1.2.2 PCR扩增:采用嵌套PCR, 引物见表2。
第表1样品理化性质Table 1 The physicochemical properties of the soils used in this study样品Sample pH土温(°CTemperature总氮(%N总磷(%P总钾(%K有机质(%Organic matter永泰 5.1 31 0.196 0.0573 1.659 2.835 宁德 5.4 29 0.136 0.158 2.714 2.136 武夷山4.8 27.5 0.211 0.0486 2.700 2.970 永安 6.3 28 0.282 0.0952 0.935 4.027 龙岩 5.5 29 0.160 0.121 1.114 2.413 龙海 4.8 30 0.210 0.0703 1.934 3.078表2用于16S rDNA扩增的引物Table 2 Primers for 16S rDNA amplication引物Primer靶位点a16S rDNA target a引物序列(5′-3′Primer sequence(5′-3′参考文献ReferencesFor 9-27 GAG TTT GAT CCT GGC TCA G [7]Dev 1541-1525 AGA AAG GAG GTG ATC CAG CC [7] F341-GC b341-359 GC 夹-CC TAC GGG AGG CAG CAG [8]R534 534-518 ATT ACC GCG GCT GCT GG [8]注:靶位点a: 编号针对大肠杆菌; GC b : 在PCR-DGGE分析中, 在5′端加入了一个富含GC序列的GC夹:CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GNote: target a : The region amplified corresponds to the position in the 16S rDNA of E. coli; GC b: In this study primer F341-GC incorporate a 40-bp GC clamp(CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G at its 5′ end at position 341李友发等: 福建省稻田土壤细菌群落的16S rDNA-PCR-DGGE分析1717一套PCR扩增: 用细菌的通用引物For/Dev扩增差不多全长的16S rDNA[7]。
反应体系(25 µL: 其中2.5 mmol/L dNTPs 2.8 µL, 3.5 µL 10×Buffer, 1 U Taq酶, 引物各3 pmol。
反应程序:94°C 5 min; 94°C 60 s, 65°C (前20个循环每个循环降0.5°C降至55°C 45 s, 72°C 120 s(后10个循环每个循环增加1 s, 共30个循环; 72°C 5 min。
第二套PCR: 用F341GC/R534引物扩增细菌16S rDNA V3区[8]。
反应体系(25 µL其中含有稀释100倍的一套扩增物1 µL, 2.5 mmol/L dNTPs 2.8 µL, 2.5 µL10×Buffer, 1U Taq酶, 引物各5 pmol。