土壤微生物生物量的测定-底物诱导呼吸法编制说明-全国土壤质量
土壤微生物生物量碳测定方法
土壤微生物生物量碳测定方法一、呼吸法通过测定土壤中微生物呼吸释放的CO2量来间接估算土壤微生物生物量碳。
该方法的原理基于微生物在代谢过程中产生的CO2量与其生物量碳之间的正相关关系。
常用的测定方法包括静态方法和动态方法。
1.静态方法：在采样后立即封闭土壤样品容器，然后测定一定时间内容器内CO2的累积释放量，并利用其中一种模型计算微生物生物量碳。
例如，利用静态方法可以测定土壤有机碳浓度和总CO2浓度，通过两者的比值计算微生物生物量碳。
2.动态方法：将土壤样品装入氧气通气的大容器中，测定一定时间内容器中CO2的连续释放量，并通过外推法计算微生物生物量碳。
例如，可以通过监测土壤样品容器中CO2的连续释放曲线，然后利用微生物呼吸速率和微生物生物量碳之间的关系计算微生物生物量碳。
二、估算法利用土壤中微生物生物量碳与其中一种土壤性质之间的相关性来估算土壤微生物生物量碳。
常用的估算法包括土壤学习法、土壤酶学法和土壤微生物生态法。
1.土壤学习法：根据不同土壤类型的土壤微生物生物量碳数据进行学习建模，然后根据土壤性质数据进行预测。
常用的学习方法包括主成分分析、判别分析和回归分析等。
2.土壤酶学法：通过测定土壤中一些酶活性与微生物生物量碳之间的相关性来预测微生物生物量碳。
常用的酶活性指标包括脲酶、蔗糖酶和脱氢气酶等。
3.土壤微生物生态法：通过测定土壤微生物多样性和群落结构与微生物生物量碳之间的相关性来估算微生物生物量碳。
常用的方法包括16SrRNA和ITS基因测序、脂肪酸指纹技术和磷脂脂肪酸分析等。
三、标记法通过标记的同位素技术测定土壤微生物生物量碳。
其中，最常用的标记同位素是^13C和^14C。
通过给土壤样品添加同位素标记物并追踪其在土壤中的分布和转化，可以计算微生物生物量碳。
总结起来，土壤微生物生物量碳的测定方法主要包括呼吸法、估算法和标记法等。
不同的方法适用于不同的土壤类型和测定目的，综合运用多种方法可以更准确地评估土壤微生物生物量碳。
土壤微生物测定方法
土壤微生物测定土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。
土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。
测定指标：1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB)能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。
它与土壤有机质含量密切相关。
目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。
因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。
此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。
受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。
熏蒸提取-容量分析法操作步骤：（1）土壤前处理和熏蒸（2）提取-1K2SO4（图将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min-1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。
熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L -1K2SO4提取；另作3个无土壤空白。
提取液应立即分析。
（3）测定吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L -1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。
土壤微生物测定指标的分析方法和适用范围
土壤微生物监测常规测定指标的分析方法和适用范围其他方法：一、土壤DNA提取和纯化：方案1，参考(1, 2)1.称取样品土样5g, 加入灭菌的石英砂，液氮研磨；不要液氮研磨，这样子对DNA伤害很大，几乎全部片段化了。
可以加上PBS洗涤下土壤，一是能够去除些杂质，二是能够使得土壤处于悬浮状态，然后可以在涡旋仪上剧烈涡旋2－3min，使得土壤颗粒破碎。
然后12000rpm离心5min，弃上清。
2.加入13.5mL的DNA提取Buffer，100微升20mg/mL蛋白酶K，37℃225rpm摇30min-2h3.加入700微升20%SDS，65℃水浴2h,间隔15min颠倒摇匀数次；4.6000rpm室温离心15min,收集中间液相层；向沉淀中加入3mLDNA提取液，300微升20%SDS，65℃水浴30min，同上离心，收集中间液相层，合并；重复一次；可考虑再增加抽提一次。
或者用5mL而不是3mL。
最后实在装不下了可以分在两个50mL离心管里面离心。
5.向收集的液相层中加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，8000rpm离心10min，收集上部液相层；6.第5步收集液相层中加入0.1倍体积的乙酸钠，0.6倍体积的异丙醇，4℃过夜沉淀；这个千万不要4度过夜啊，四度过夜你会发现很多的絮状悬浮物，我之前犯过类似错误，这个是SDS和高浓度的盐在低温条件下析出来了。
室温放置1－2h就好。
7.过夜沉淀物12000rpm离心15min，弃上清；向沉淀中加入10mL冷乙醇洗涤，12000rpm离心5min，弃上清；12000rpm离心30sec，移液枪析出残留液体；8.室温自然干燥沉淀，干燥后向沉淀中加入400微升TE溶解。
方案2：购买DNA提取试剂盒，如SoilMaster DNA Extraction Kit (Epicenter) 或UltraClean Soil DNA Isolation Kit (MO BIO)二、DNA定量和质量检测：提取后的DNA使用紫外分光光度法进行浓度和纯度检测。
土壤微生物生物量的测定(滴定法)
1. 土壤微生物生物量的测定(滴定法)一、实验目的和内容土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5～10μm3活的微生物总量，是土壤有机质中最活跃的和最易变化的部分。
耕地表层土壤中，土壤微生物量碳（Bc）一般占土壤有机碳总量的3％左右，其变化可直接或间接地反映土壤耕作制度和微生物肥力的变化，并可以反映土壤污染的程度。
近30年来，国外许多学者对土壤微生物生物量的测定方法进行了比较系统的研究，但由于土壤微生物的多样性和复杂性，还没有发现一种简单、快速、准确、适应性广的方法。
目前广泛应用的方法包括：氯仿熏蒸培养法（FI）、氯仿熏蒸浸提法（FE）、基质诱导呼吸法（SIR）、精氨酸诱导氨化法和三磷酸腺苷（A TP）法。
氯仿熏蒸浸提法（FE）的原理是：土壤经氯仿熏蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。
通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量碳。
二、实验材料和用具仪器：培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机（速率200次每min）；1L广口玻璃瓶；定量滤纸；紫外分光光度计；LNK-872型消煮炉（江苏省宜兴市科教仪器研究所）试剂：1.无乙醇氯仿：市售的氯仿都含有乙醇（作为稳定剂），使用前必须除去乙醇。
方法为：量取500ml氯仿于1000ml分液漏斗中，加入50ml硫酸溶液[ρ(H2SO4)=5%]，充分摇匀，弃除下层硫酸溶液，如此进行3次。
再加入50ml去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。
将下层的氯仿转移存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。
2.硫酸钾溶液[c(K2SO4)=0.5mol·L-1]称取硫酸钾（K2SO4，化学纯）87.10g，先溶于300ml去离子水中，加热，转移溶液至容器中，再加少量去离子水溶解余下的部分，转移溶液至同一容器中，如此反复多次。
最后定容至1L；3.重铬酸钾[c(1/6 K2Cr2O7)=0.4000mol·L-1]：称取经130℃烘干2～3h的重铬酸钾（K2Cr2O7，分析纯）19.622g，溶于1000ml去离子水中；4.邻啡罗啉亚铁指示剂：称取邻啡罗啉（C12H8N2H2O，分析纯）1.49g，溶于含有0.70gFeSO4·7H2O的100ml 去离子水中，密闭保存于棕色瓶中；5.硫酸亚铁溶液[c（FeSO4·7H2O）＝0.0667mol·L-1]：称取硫酸亚铁（FeSO4·7H2O，化学纯）18.52g，溶解于600ml～800ml去离子水中，加浓硫酸（化学纯）15ml，搅拌均匀，定容至1000ml，于棕色瓶中保存。
土壤微生物量碳测定方法(精编文档).doc
【最新整理，下载后即可编辑】土壤微生物量碳测定方法及应用土壤微生物量碳（Soil microbial biomass ）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。
近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。
由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。
测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI ）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE ）。
熏蒸提取法（FE 法）由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。
Voroney (1983)发现熏蒸土壤用0.5mol ·L -1K 2SO 4提取液提取的碳量与生物微生物量有很好的相关性。
Vance 等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤微生物碳的基本方法：该方法用0.5mol ·L -1K 2SO 4提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换系数K EC (取值0.38)来计算土壤微生物碳。
Wu 等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。
该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。
林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。
对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数K EC 的取值，有很多研究进行了大量的研究。
测定K EC 值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用14C 底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP 法及底物诱导呼吸法比较）。
土壤微生物量测定方法
土壤微生物量测定方法一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸一K2SO4提取•碳分析仪器法）1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸憾水按1?2 （v:v）加入分液漏斗中，充分摇动lmin,慢慢放岀底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。
得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。
纯化后的氮仿巻于试剂瓶中，在低温（4°C）、黑暗状态下保存。
（2）氢氧化钠溶液［c （NaOH） =lmolL-1］：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴左终点判断和测左的准确度。
配制时应先除去碳酸钠, 根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50% （w:v）的浓氧溶液，密闭放置3〜4d。
待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上淸液（约19 mol L）,用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馅水释稀到1L,即为浓度1 mol L1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。
（3）硫酸钾提取剂［c （K2SO4）= mol L1］：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸餾水至20 L,盖紧螺旋盖置于摇床（150 rmin-1）上溶解24 h 即可。
（4）六偏磷酸钠溶液［Q （Na） =5gl00mr1, pH］：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml髙纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH ,用高纯度去离子水左容至1L。
要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。
1（5）过硫酸钾溶液［Q （K2S2O8） =2gl00mn：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于髙纯度去离子水中，定容至1L。
值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7d。
（6）磷酸溶液［Q（H3PO4） = 21 g 100 ml*1］:量取37 ml分析纯浓磷酸（85%）,慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。
土壤微生物量测定方法
土壤微生物量测定方法常规培养法是最早也是最常用的土壤微生物量测定方法之一、该方法是将土壤样品经过稀释后接种到含有特定培养基的培养皿中，经过一段时间的培养，根据培养皿上的菌落数量计算土壤中微生物的数量。
常用的培养基有营养琼脂培养基、土壤细菌培养基和土壤真菌培养基等。
常规培养法的优点是简单易行，可以同时测定不同类型微生物的数量，但该方法有一些局限性，如只能测定能够在培养基上生长的微生物，不能测定需异养条件才能生长的微生物，而且该方法容易低估土壤中微生物的真实数量。
生物量测定法是一种利用土壤微生物的生物学过程测定微生物量的方法。
该方法一般分为碳饥饿法和氮饥饿法两种。
碳饥饿法是将土壤样品暴露在低碳条件下（如0.01%葡萄糖溶液中）一段时间后，测定土壤中的微生物的生物量。
氮饥饿法是将土壤样品暴露在低氮条件下（如0.01%硝酸铵溶液中）一段时间后，测定土壤中的微生物的生物量。
这两种方法都是利用微生物的生物学特性，通过测定微生物对不同养分的响应来估计微生物的数量。
生物量测定法的优点是准确度较高，可以测定土壤中广泛类型的微生物，但该方法也有一些局限性，如需要较长的试验周期，测定过程中需要严格控制温度、湿度等环境条件，且操作较为繁琐。
生物学特征法是一种通过测定土壤微生物的生物学特征来评估微生物群体数量的方法。
该方法常用的特征包括土壤酶活性、呼吸作用速率、微生物生长速率和微生物群体的磷脂脂肪酸组成等。
这些特征的测定可以通过色谱、酶反应和分子生物学技术等手段进行。
生物学特征法的优点是操作简便，消耗土壤样品较少，时间短，结果可靠。
但该方法也有一些问题，如不同微生物对环境的响应不同，结果受环境因素影响较大。
综上所述，土壤微生物量的测定方法有常规培养法、生物量测定法和生物学特征法等。
不同的测定方法各有优缺点，使用时可以根据具体的研究目的和所需数据的准确度进行选择。
此外，单一的方法往往无法全面准确地评估土壤微生物量，因此常采用多种方法综合分析，以得到更准确的结果。
土壤学简答题
土壤的作用:①农林业生产的基础。
植物生长的基本要素和条件②在植物生长繁育中不可取代的作用（营养库的作用、养分转化和循环作用、雨水涵养作用、生物支撑作用、环境作用。
）③是制定农林业增产各项措施的依据④是影响人类生存的重要环境要素⑤土壤是最珍贵的自然资源⑥是地球陆地生态系统的重要组分我国土壤资源现状:①类型丰富，土壤适宜性广泛；②资源区域差异大，地区分布不平衡。
③土壤资源所处的自然条件优越，生产潜力较大。
④耕地土壤比重小，总体质量不高。
我国土壤资源利用过程存在的问题:①盲目开发利用。
②土壤退化严重，生态环境恶化。
③土壤生产潜力没有得到发挥。
④非农业占地严重。
影响土壤有机质转化的因素:①温度。
②土壤水分和通气状况。
③土壤特性（质地，pH）④有机残体的特性:新鲜程度的碳氮比值。
有机残体的C／N是如何影响有机质的转化的？C/N以25～30：1较为合适，C/N越大越不利于有机质的分解。
C/N降至大约25：1以下，微生物分解有机质速度快，而且微生物在分解有机质的过程中可释放矿质态氮供土壤中的植物利用。
△利用有机物质CN 比值与土壤有效氮的相互关系如有机质C / N 比值大于30:1，则在其矿化作用的最初阶段就不可能对植物产生供氮的效果，反而有可能使植物的缺氮现象更为严重。
如有机质的C/N 比值小于15:1时，在其矿化作用开始，它所提供的有效氮量就会超过微生物同化量，使植物有可能从有机质矿化过程中获得有效氮的供应。
土壤腐殖质的性质:①分子量越大，颜色越深。
②形状球形结构，疏松多孔，似海绵。
③带有大量功能团和电性。
④腐殖酸络合性。
土壤有机质的作用:①提供植物需要的养分②促进养分有效化③促进植物生长发育④提高土壤保水保维能力和缓冲性⑤改善土壤物理性质。
（增加土壤颜色，增加吸热，利于土壤提高温度。
）在生态环境上的作用:①对农药等有机污染物的固定作用；②有机质对重金属污染物的络合作用和还原作用。
③土壤有机质对全球碳平衡的影响。
土壤微生物数量测定方法
土壤微生物数量测定方法土壤微生物是指生活在土壤中的微小生物，包括细菌、真菌、放线菌、古菌等。
土壤微生物在土壤的生物地球化学循环、有机质分解、养分转换和植物健康等过程中起着重要的作用。
因此，对土壤微生物数量的准确测定具有重要意义。
本文将介绍一些常用的土壤微生物数量测定方法。
1.瓶培法：将适量的土壤样品与适量的培养基混合，在37°C下培养约24小时，然后通过平板计数法或最凼稀释法进行测定。
2.膜过滤法：将土壤提取液通过特定孔径的膜过滤器滤过，然后将膜放置在培养基上进行细菌的生长，最后进行计数。
3.间接法：通过测定土壤样品的可培养细菌指标，如氧化还原酶、脱氢酶等的活性，从而推算出土壤中的细菌数量。
4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的细菌基因，如16SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行细菌数量的测定。
1.直接镜检法：直接在显微镜下观察土壤样品中的真菌，通过计数来估算真菌的数量。
2.平板计数法：将土壤样品均匀撒在培养基上，通过培养方法使真菌生长形成菌落，最后进行计数。
3.膜过滤法：与细菌数量测定相似，将土壤提取液通过膜过滤器滤过，然后将膜放置在适当的培养基上进行真菌的生长，最后进行计数。
4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的真菌基因，如18SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行真菌数量的测定。
1.直接镜检法：直接在显微镜下观察土壤样品中的放线菌，通过计数来估算放线菌的数量。
2.平板计数法：将土壤样品均匀撒在培养基上，通过培养方法使放线菌生长形成菌落，最后进行计数。
3.膜过滤法：与细菌和真菌数量测定类似，将土壤提取液通过膜过滤器滤过，然后将膜放置在适当的培养基上进行放线菌的生长，最后进行计数。
4.分子生物学方法：通过PCR扩增土壤DNA中的放线菌基因，如16SrRNA基因，再通过测定PCR产物进行放线菌数量的测定。
通过上述方法测定土壤中微生物的数量，可以了解土壤微生物对土壤生态系统功能的影响，并为土壤质量评价和科学合理利用提供依据。
土壤微生物量的测定方法_现状和展望_图文(精)
第期土壤徽生量的测定方法现状和展望。
及空间分布特性都与原土壤微生物一致而外加微生物则无论在组成上还是分布是都存在人为因素二裂取 , 土壤微生物盆硫的测定〔土壤微生物所含的硫是土壤有效硫的重要来源 , 土壤熏蒸以后 , , 微生物细胞破释出的硫化合物可为一‘ 幻其中以用 , 尹或等试剂所提材对提取时的测定结果最为理想其它几种提取剂因对照样品测定全硫 , 、的背景值太高翔影响测定结果的准确性和重现性〔提取液先经消化消化液经微孔膜过滤后用离子色谱仪测定其硫酸根含量计算二允 , 土壤微生物量硫砂含量按下式 , 式中数为熏蒸土样与对照样品测定方法不同’ 。
, 未经熏蒸〕 , 可提取硫之差 , 为转换系一值略有差异等人哪采用纯培养微生物加人法测得 , 提取的值为用土壤稀释液接种微生物采提取法的 , 为在培养基上培养一定时间后材提取的和 , 加人到土壤中去的” 方法测得去 , 值为目前文献上引用较多的〔 , 提取液中的硫常用 , 射线荧光分光光度计法用 , 值仍然是或还原蒸馏法测定〔’ , 过鉴于提取液中硫的浓度一般都不高而用还原蒸馏法则不仅费时射线荧光光度计法精度达不到要求 , 方法卿〔由于被且分析误差较大所以只有离子交换色谱法是比较理想的以上以有机硫的形态存在一般的土壤可以取的生物硫柱提省略硫酸根吸附校正的步骤五熏蒸法的问世和微生物量硫 , 、问题和展望熏蒸一提取法的提出、为定量测定土壤微生物量提供了简便的技术 , , 不仅克报了熏蒸一培养法的某些局限性用时 , 而且可应用于测定土壤微生物盆氮微生物盆磷这些方法在土壤科学和球境科学等领域均有广泛的应用前景 , 但在具体应 , 应注意以下几个问题这些方法的测定值受土壤水分状况影响很大〔蒸前湿润土壤则使测定值增大柳增大〔因此 , 采用风干土测定值显著降低熏在一定含水量范围内土壤微生物盆随含水量增加而 , , 比较不同土壤间土壤微生物量时必须考虑试样水分状况的可比性 , 若非研究土壤微生物量的季节性变化土壤之含水量应调节在在这种情况下 , 试样水分状况应与田间一致 , , 供试田间持水量左右直接应用文献报道的转换系数试土壤性质及测定条件的可比性‘ , 。
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《土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法》Determination of soil microbial biomass ‒Fumigation-extraction method国家标准（征求意见稿）编制说明《土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法》编制组二0一七年四月项目名称：土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法计划编号：20153803-T-326项目负责单位：中国科学院亚热带农业生态研究所项目负责人：吴金水技术委员会：全国土壤质量标准化技术委员会（SAC/TC 404）目录1、立项背景 (1)1.1 土壤微生物生物量的研究意义重大 (1)1.2 土壤质量标准化与土壤科研工作的需要 (1)2、任务来源 (3)3、标准制定的原则和依据 (3)3.1 原则 (3)3.2确定依据 (4)4、标准制定的主要技术内容及方法应用评价 (4)4.1 适用范围 (4)4.2 总体框架和主要内容 (4)4.3熏蒸和提取 (5)4.4 提取物中碳的测定 (6)4.5 方法的评价 (8)4.6方法的应用 (9)5、与现行法律、法规、标准的协调性 (11)6、对标准贯彻的建议 (11)7、参考文献 (11)1、立项背景1.1 土壤微生物生物量的研究意义重大土壤微生物生物量（soil microbial biomass）是指体积小于5×103μm3活体微生物总量，但不包括活的植物体，如植物根系等（吴金水等，2006；李振高等，2008）。
土壤微生物生物量虽然只占土壤有机质的3%左右，但在有机物质、氮、磷、硫等转化和循环过程中起着关键的作用，不仅是土壤有机质中最活跃的组分，而且可作为土壤养分的储存库，是植物生长吸收利用养分的重要来源，与单个微生物个体数量指标相比，更能反映微生物在土壤中的实际数量与作用潜力。
据估计植物吸收N、P、S 的60%，47%和28%分别来自微生物生物量N、P和S。
微生物是土壤中最为活跃的生命体之一，土壤微生物是土壤有机质和土壤养分( C, N, P, S 等) 循环转化的驱动力，参与有机质的分解、腐殖质的形成、养分的转化与循环等各个生物化学过程（林先贵，2010）。
而且，微生物对土壤各种环境因子的变化极为敏感，因而土壤微生物量的变化常被作为土壤肥力、土壤环境污染等其他各种扰动对土壤健康质量影响的灵敏性指标。
因此，土壤微生物生物量的研究为从整体上了解土壤微生物的演变与功能提供了一个有效的途径，其对于更好地把握与理解土壤健康的主要影响因素有极其重要的作用，对制定良好措施来提高土壤质量也有重要意义。
1.2 土壤质量标准化与土壤科研工作的需要土壤微生物生物量是植物有效养分的储备库和来源，其对土壤碳、氮、磷和硫的植物有效性及在陆地生态系统中的循环具有重要的影响。
土壤微生物生物量库的长期或是季节性变化，不仅可指示土壤质量的变化，而且对于了解土壤养分的动态变化也具有重要的作用，同时也可快速地监控并反映土壤管理的改变和污染的影响。
土壤微生物生物量的定量分析是了解微生物对土壤有机质与养分循环和转化作用的重要方法。
土壤微生物生物量的测定方法有很多，既有传统方法，也有现代方法。
20世纪初发展起来的传统的微生物计数方法至今仍在应用。
直到1976年Jenkinson 提出了测定土壤微生物生物量的熏蒸-培养法（FI），土壤微生物生物量库在生态学和微生物学上才得到重视。
该方法是基于氯仿熏蒸将土样中微生物细胞杀死和溶解，再用土壤接种，测定培养10天内土样的呼吸，与未熏蒸对照土样比较，由于熏蒸土样微生物被杀死和微生物生物碳的分解，从而使释放的CO2增加。
但该方法误差大，耗时长，仅适用pH 5~8的旱土。
与此同时还提出采用FI 法测定土壤微生物生物量氮。
Anderson等在1978年提出了测定微生物生物量的另一生理学方法，即所谓的底物诱导呼吸法（Substrate-induced respiration，SIR），基本原理是根据添加的易分解基质后，培养初期CO2呼吸速率来估计土壤微生物生物量。
SIR方法操作简单，快速，费用低，重现性好，是土壤微生物生物量分析中的经典方法，业已形成国际标准（ISO 14240-1:1997: E）。
同时，本单位牵头于2013年开始制定土壤微生物生物量测定的国家标准，于2017年3月颁布了《土壤微生物生物量的测定—底物诱导呼吸法》的国家标准，等同于国际标准（ISO 14240-1:1997: E）。
但是，FI和SIR法都有其不足之处。
FI法需较长时间（10天），且不适合酸性土壤。
SIR法是采用FI法校准，不同的校正系数使采用SIR测定的数据计算得到的微生物生物量碳常常会产生争议，此外SIR 法不适合添加了新鲜有机底物的土壤。
Brooks等在1982和1985年分别提出了更直接的估算土壤微生物生物量磷和氮的方法。
经氯仿熏蒸的土样直接提取（即熏蒸－提取法，Fumigation-extration，FE）后测定土壤微生物生物量磷和氮。
Wu 等（1990）将熏蒸-提取法中碳分析改进为仪器自动分析，重新确定了转换常数，创建了快速、精确、适合各种条件的土壤微生物生物量碳（MBC）测定新方法。
以该方法与14C标记技术结合，创建了土壤MBC周转速率、有机底物转化动力学参数、土壤释放CO2-C的微生物与非微生物来源比例测定等3个方法（Brookes et al, 1991; Wu et al, 1993; 2005），并解决了土壤MBC周转速率、有机底物的“激发效应”机理、矿化碳构成等以往长期未明的土壤科学重大学术问题（Wu et al, 1993; 2005；Kouno et al, 2002）。
FE法已成为测定土壤微生物生物量最常用的方法，是土壤微生物生物量分析中的经典方法，业已形成国际标准。
为了准确地测定土壤微生物生物量，加强科学交流，增进数据共享，促进土壤学科发展，制定《土壤微生物生物量-熏蒸提取法》的国家标准十分必要。
1.3 国家及土壤质量主管部门的要求标准是经济活动和社会发展的技术支撑，是国家治理体系和治理能力现代化的基础性制度。
但是，与经济社会发展需求相比，我国标准化工作还存在较大差距。
目前，我国越来越重视标准化工作，相继颁布了《中共中央关于制定国民经济和社会发展第十三个五年规划的建议》和《国务院关于印发深化标准化工作改革方案的通知》（国发〔2015〕13号），以及《国家标准化体系建设发展规划（2016-2020年）》文件。
为贯彻落实文件，推动实施标准化战略，加快完善标准化体系，提升我国标准化水平，要求形成具有我国自有知识产权国家标准。
借此机遇，我国成立了“全国土壤质量标准化技术委员会”，以期大力发展土壤质量标准化工作，制定适合我国土壤质量监测与分析的相关标准，逐渐构建我国土壤质量标准化体系。
2015年，国家标准化管理委员会审核通过并立项了“土壤微生物生物量-熏蒸提取法”（20153803-T-326）国家标准的制定。
根据国家标准制定工作的任务及土壤质量国家标准制定的需要，完成该标准的制/修订，对于指导我国土壤质量监测与监管有重要意义。
2、任务来源根据国家质量监督检验检疫总局国家标准化管理委员会文件国标委综合【2015】73号《关于下达2015年第三批国家标准制修订计划的通知》，《土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法》顺利立项。
本标准由中国科学院亚热带农业生态研究所承担，归口全国土壤质量标准化技术委员会，计划编号20153803-T-326。
3、标准制定的原则和依据3.1 原则（1）本标准的编写依据GB/T 1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》（2）本标准的制定与国际标准《Soil quality-determination of soil microbial biomass-Part 2 Fumigation-extraction method》（ISO 14240-2:1997: E）的一致性为等同的原则3.2确定依据（1）转化ISO 14240-2:1997方法，形成标准文本（2）通过实验和验证，确定方法的可行性和适用性（3）本标准方法准确可靠，能满足土壤科学研究与土壤质量监测分析测试的要求（4）本标准方法具有普遍适用性广，操作简单，耗费低，易于推广应用。
4、标准制定的主要技术内容及方法应用评价4.1 适用范围本标准详细描述一种通过提取经熏蒸杀死的新鲜土壤微生物中总的有机生物量物质，估算土壤微生物生物量的方法。
本方法适用于估算土壤微生物生物量氮及微生物茚三酮反映的氮，但本标准仅仅描述了测定可提取的有机碳的方法。
熏蒸提取法（FE）适用土壤pH值范围广泛的好氧和厌氧（淹水，稻田）土壤。
本标准适用于包含易分解有机底物和硫酸钾溶液过饱和土壤生物量的测定。
4.2 总体框架和主要内容本标准在满足GB/T 1.1-2009规定的前提下，总体框架仿照ISO 14240-2:1997方法编排。
首先是共性内容，如前言、范围、规范性引用文件、术语和定义，接着是具体的实验方法，如原理、试剂与材料、仪器等，以及最后附录内容。
根据以上框架原则，本标准涉及的内容主要有：（1）范围；（2）规则型引用文件；（3）术语和定义；（4）原理；（5）试剂与材料；（6）仪器；（7）熏蒸和提取；（8）提取物中碳的测定；（9）精度；（10）规范性（A）和资料性附录（B、C）；（11）参考文献。
4.3熏蒸和提取熏蒸干燥器底部平铺湿润滤纸，将进行土样的熏蒸。
称取经前处理（5.1）相当于25～50.0g烘干基的新鲜土样3份，置于玻璃烧杯（6.4）或有盖培养皿（6.5）中。
将烧杯或培养皿放入真空干燥器中，并放置盛有25 ml去乙醇氯仿（5.2.2）的烧杯1只，烧杯内放入少量防瀑沸的颗粒（6.10），同时放入一小烧杯碱石灰溶液。
抽真空使氯仿剧烈沸腾约2 min。
关闭干燥器抽真空阀门，将其在25±2℃暗室孕育22～24h。
如果没有足够的土壤，使用较小的样品规模提供土壤与提取剂的比例保持不变（土水比为1 : 4；w : v）。
为获得最大的提取物质，土壤有机质含量超过20％时（有机质含量的测定参照ISO10694）增加土壤与提取液的比例（当土壤有机质含量超过95％时，最大比例是1：30，例如土壤L－layer）。
记录使用土壤的质量。
熏蒸结束后，从干燥器中取出含氯仿的烧杯和滤纸。
干燥器反复抽真空（6次，每次2min）直到土壤无氯仿味为止。
熏蒸好的土壤以备提取用。
另称取不熏蒸土样（50.0g烘干基的新鲜）3份，置于塑料瓶作为对照土样。
参照7.2方法，立即用200 ml的K2SO4（5.2.3）进行提取。
提取为提取有机碳,将熏蒸土样无损地转移到聚乙烯塑料瓶（6.6）中，加入200mlK 2SO 4（5.2.3），用水平振荡器（6.8）振荡30min （200r min-1），或用立式振荡器振荡45min （60 r min-1），提取液用滤纸(6.3)过滤到塑料瓶中。