蔗糖酶
蔗糖酶的分离提纯讲解
蔗糖酶的分离提纯【实验目的】1．了解蔗糖酶分离提纯的方法。
2．掌握离心技术、电泳技术、层析技术、膜分离技术和分光光度法。
【实验原理】蔗糖酶[Ec 3．2．1．26]习惯命名β--D--Fructofuranosidase 系统命名：β--D —Fructofuranosideffructonydrolase 。
蔗糖酶是一种水解酶，能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。
它所催化的反应是：H OH OH H蔗糖+H OH OH H 葡萄糖 果糖蔗糖酶的分布相当广，在微生物、植物及动物中都有它的存在。
在微生物中，酵母中的含量很丰富。
在研究中用的最多的是面包酵母和啤酒酵母。
研究表明采用菌体自溶法破碎酵母细胞，采用乙醇分级和DEAE--纤维素柱层析两步分离提纯步骤，就可制备纯度较高的蔗糖酶制剂，而且收率也较好。
从酵母中制备蔗糖酶，材料来源十分方便，而且以自己提纯的酶制剂进行蔗糖酶的性质、动力学研究也十分方便。
【实验材料、仪器和试剂】 1．实验材料和试剂(1)0．2％葡萄糖标准液；(2)3，5-二硝基水杨酸试剂；(3)新鲜啤酒酵母； (4)甲苯；(5)乙酸钠；(6)稀乙酸溶液；(7)95％乙醇；(8)DEAE--纤维素；(9)0.5mol ／L NaOH ；(10)0.5mol ／L HCl ；(11)0.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液；(12)含O.15mol ／L NaCl 的O.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液；CH 2OHH OHHHOHCH 20H(13)5％蔗糖；(14)测定蛋白质浓度试剂；(15)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂2．仪器(1)恒温水浴；(2)烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒；(3)冰盐浴；(4)离心机；(5)721型分光光度计；(6)柱层析装置；(7)天平；(8)pH计；(9)滴管、试管和血糖管；(10)秒表【方法】一、葡萄糖浓度标准曲线的制作1．取10支血糖管，按下表加入0．2％葡萄糖溶液、水及3，5一二硝基水杨上述试剂混匀后，在沸水浴中加热5min，取出立即冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，于540nm测光密度。
蔗糖酶
3.1 酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究自1860年Bertholet从啤酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。
蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的β-D-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。
该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。
在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。
两种酶的蛋白质部分均为双亚基二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。
尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似。
本实验未区分内酶与外酶，是直接从酵母粉中进行提取。
用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。
比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。
该实验共有九个分实验，几乎覆盖了酶分离纯化、鉴定及其酶学性质研究的全部内容，为学生提供了一个较全面的实践机会，学习有关酶的分离纯化及其相关研究。
1．蔗糖酶的提取与部分纯化2．离子交换柱层析纯化蔗糖酶3．蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定4．分离产物的SDS－PAGE电泳检测5．反应时间对产物形成的影响6．pH对酶活性的影响和最适pH的测定7．温度对酶活性的影响和最适温度的测定8．底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数K m和最大反应速度V max的测定9．尿素（脲）抑制蔗糖酶的实验3.1.1 蔗糖酶的提取与部分纯化3.1.1.1 目的1）学习微生物细胞破壁方法。
蔗糖酶活力实验报告
一、实验目的通过本实验，了解蔗糖酶的活力及其影响因素，探究温度、pH值、抑制剂和激活剂对蔗糖酶活力的影响，为后续研究蔗糖酶的应用提供基础。
二、实验原理蔗糖酶（Invertase）是一种水解酶，能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
本实验采用比色法测定蔗糖酶活力，通过测定在一定条件下，酶催化蔗糖水解生成还原糖的速率，从而反映酶的活力。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）蔗糖酶：市售或实验室自备（2）蔗糖：分析纯（3）葡萄糖标准溶液：0.1 mol/L（4）3,5-二硝基水杨酸（DNS）：分析纯（5）盐酸、氢氧化钠：分析纯2. 实验仪器：（1）电子天平（2）恒温水浴锅（3）紫外可见分光光度计（4）移液器（5）试管四、实验方法1. 葡萄糖标准曲线绘制：（1）配制不同浓度的葡萄糖标准溶液（2）将各浓度葡萄糖溶液分别加入试管中，加入适量DNS试剂，沸水浴5分钟（3）冷却后，在540 nm波长下测定吸光度（4）以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线2. 蔗糖酶活力测定：（1）配制酶反应体系：取一定量的蔗糖溶液，加入适量蔗糖酶，置于恒温水浴锅中（2）每隔一定时间取样，加入DNS试剂，沸水浴5分钟（3）冷却后，在540 nm波长下测定吸光度（4）根据标准曲线计算还原糖浓度（5）根据酶反应体系中蔗糖浓度和反应时间，计算酶活力3. 影响蔗糖酶活力的因素：（1）温度对蔗糖酶活力的影响：在不同温度下测定酶活力（2）pH值对蔗糖酶活力的影响：在不同pH值下测定酶活力（3）抑制剂对蔗糖酶活力的影响：加入一定浓度的抑制剂，测定酶活力（4）激活剂对蔗糖酶活力的影响：加入一定浓度的激活剂，测定酶活力五、实验结果与分析1. 葡萄糖标准曲线绘制根据实验结果，绘制葡萄糖标准曲线，相关系数R²为0.998，表明曲线拟合度良好。
2. 蔗糖酶活力测定在不同反应时间下，酶活力随时间延长而增加，说明蔗糖酶具有催化活性。
3. 影响蔗糖酶活力的因素（1）温度对蔗糖酶活力的影响：在40℃时，酶活力最高，随着温度升高或降低，酶活力逐渐下降。
蔗糖酶米氏常数的单位
蔗糖酶米氏常数的单位
蔗糖酶是一种能够催化蔗糖水解反应的酶，它在食品工业、生物技术和医药领域有着广泛的应用。
而蔗糖酶米氏常数则是衡量蔗糖酶催化效率的重要指标之一。
米氏常数（Km）是酶学中常用的一种参数，它是指在半饱和状态下底物浓度达到一半时的底物浓度。
对于蔗糖酶而言，米氏常数可以反映出酶与底物之间的亲和力。
米氏常数越小，说明酶与底物结合越紧密，催化效率越高。
蔗糖酶米氏常数的单位通常是以摩尔/升（mol/L）来表示。
它可以通过实验测定得到，通过改变底物浓度，观察蔗糖酶的反应速率的变化，从而确定米氏常数的数值。
蔗糖酶米氏常数的单位的确是摩尔/升，这是因为蔗糖酶是一种酶，而酶的底物浓度通常使用摩尔/升来表示。
蔗糖酶在催化反应中需要与蔗糖结合，而蔗糖的浓度也是以摩尔/升来计量的，因此蔗糖酶米氏常数的单位也自然而然地成为了摩尔/升。
蔗糖酶米氏常数的数值可以通过实验测定得到，这需要一系列的实验步骤和仪器设备的支持。
通过测定不同底物浓度下的反应速率，可以得到反应速率与底物浓度的关系曲线。
而米氏常数则是通过拟合这条曲线得到的，它是一个重要的参数，可以帮助我们了解蔗糖酶与底物之间的相互作用。
蔗糖酶米氏常数的单位是摩尔/升，它是衡量蔗糖酶催化效率的重要指标之一。
通过实验测定米氏常数的数值，可以帮助我们更好地理解蔗糖酶与底物之间的亲和力和催化效率。
蔗糖酶
蔗糖酶啤酒酵母中含有丰富的蔗糖酶，通常被当做提取蔗糖酶的重要材料。
酶的纯化通常有五个阶段：材料的选择与预处理；细胞破碎；抽提；纯化；浓缩、干燥及保存。
一、蔗糖酶粗品的制备1、自溶称取40g新鲜的啤酒酵母放在250ml三角瓶中。
然后分别加入1.2g乙酸钠细粉末、20ml甲苯。
在35℃水浴中保温30min，并间隔片段震荡，此时会观察到菌体自溶的现象。
此溶液为自溶液。
2、抽提及粗酶的制备⑴向自溶液中加入60ml无菌蒸馏水，于35℃保温过夜。
⑵第二天，将自溶液于4000RPM(Rotatian Per Minute)×15min离心。
⑶离心完成后，离心管内液体一般分为三层：下层透明，中层为变性蛋白质和块状粘稠物，上层为有几层。
用吸管将最上层的甲苯吸去然后再用一药勺挡住中间块状粘稠物，倾斜离心管倒出上清液。
弃去粘稠物。
⑷此时，如果上清液中有少量悬浮物存在，可再离心一次（4000RPM×20min），如上清液已滤清，小心倒入250ml烧杯中，此溶液为无细胞抽提液，即粗酶液。
⑸量出粗酶液的体积即V E1，记录，从中取出1ml置0～4℃保存，用于测定酶活力和蛋白质纯度及浓度，其余供下步继续纯化。
二、蔗糖酶的第一次分离1、粗酶液pH值调节将粗酶液E1，用10%的乙醇调其pH值至4.4～4.6之间（注意置冰浴上并在不断轻柔搅拌的情况下缓慢加入乙醇），并记录加入乙醇的体积。
2、32%饱和度乙醇的配置按下面的公式计算出使粗酶液的乙醇浓度达到32%时所需乙醇体积。
X1 ＝0.32V＋X1X1为所需乙醇体积，V为E1和加入10%乙醇的总体积。
按X1/0.95换算出所需95%乙醇的体积。
3、32%饱和度乙醇分离蔗糖酶把粗酶液和量好预冷的95%乙醇分别放入冰浴中。
用一细长滴管将预冷的乙醇滴入粗酶中（滴与滴间不能连成线），同时用磁力搅拌器轻柔搅拌，注意一定不要使乙醇局部浓度过高，否则会引起酶变性失活。
在滴加乙醇的过程中，酶液逐渐变浑浊，滴加结束后，冰浴静置20min。
土壤蔗糖酶活性测定方法
土壤蔗糖酶活性测定1.原理采用3,5-二硝基水杨酸比色法。
该方法以蔗糖为基质, 基质在土壤蔗糖酶作用下生成葡萄糖, 葡萄糖和3,5-二硝基水杨酸反应生成橙黄色的3-氨基-5-硝基水杨酸, 并在508nm波长下有最大吸光值。
2.测定方法①称取壤土0.15g、砂土0.3g、粘土0.1g风干土于10mL离心管中, 加入0.06 mL甲苯和1mL ph5.5磷酸缓冲液, 再加3mL 8%蔗糖溶液, 摇匀后加盖, 放进36~37℃的培养箱中进行培养24个小时；②培养完成后取出, 摇匀, 并于4000r/min离心5min；③取上层清液0.2ml于20ml玻璃管中, 并加入0.5ml3,5-二硝基水杨酸, 再立即将玻璃管沸水浴中加热5min, 加热完毕后在自来水流下冷却3min；④将显色液体用蒸馏水稀释到5ml, 在508nm波长下比色, 记录吸光值。
3.蔗糖酶标准曲线的测定方法（1）葡萄糖标准溶液的配制a.饱和苯甲酸溶液的配制在洁净的烧杯中加入适量蒸馏水, 慢慢加入少量苯甲酸同时用玻璃棒搅拌, 直至苯甲酸溶解的同时出现析出的苯甲酸晶体为止。
b.标准葡萄糖溶液的配制称取500mg葡萄糖溶解于适量苯甲酸饱和溶液中, 并取100ml容量瓶用苯甲酸饱和溶液定容（5mg/ml）。
（2）.操作步骤a.取11支洁净20ml玻璃管编号0—10。
b.按下表加液编号: 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10葡萄糖母液（ml）0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07饱和苯甲酸（ml）0.2 0.195 0.19 0.185 0.18 0.175 0.17 0.16 0.15 0.14 0.13葡萄糖浓度（mg/ml）0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.04 0.05 0.060.07吸光值（A508nm）0 0.05 0.117 0.227 0.31 0.392 0.49 0.666 0.839 1.0061.176c.在玻璃管中各加入0.5ml3,5-二硝基水杨酸溶液, 并立刻放入沸水浴中加热5min.加热后, 立刻将玻璃管在流动自来水下冷却3min.冷却完毕后, 用蒸馏水定容至5ml.d.将显色液在508nm波长下比色。
浙江大学生物化学实验甲 2011-酵母蔗糖酶的提取原理
酵母蔗糖酶的制备原理一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包酵母，也存在于曲霉、青霉和毛霉等霉菌和细菌及植物中，可专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。
酵母蔗糖酶的分子量约270000D（因来源不同，分子量有差异），pI约5.6，最适pH4.6，耐酸和热，最适温度50℃。
耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。
二、酵母蔗糖酶的分离纯化本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：缓冲液抽提，加热纯化，乙醇分级沉淀，DEAE-Sepharose柱层析分离纯化。
㈠、前三步分离纯化的原理如下：㈡、离子交换DEAE-Sepharose柱层析分离纯化的原理1、离子交换柱层析分离混合物的基本原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种根据待分离物质的阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术。
离子交换层析是一种液-固相层析技术。
其中，液相称洗脱液，固相的惰性支持介质称离子交换剂。
在离子交换剂上具有带电基团，不同的交换剂所具有的带电基团的电荷性质不同，如交换剂上的带电基团带正电荷，则可结合溶液（液相）中的阴离子，这样的交换剂称为阴离子交换剂，如DEAE 纤维素（二乙胺基乙基-纤维素）、强碱型的离子交换树脂等。
反之，如交换剂上的带电基团带负电荷，则可结合溶液中的阳离子，这样的交换剂称为阳离子交换剂，如CM-纤维素、强酸性的离子交换树脂等。
离子与交换剂的静电结合作用具有如下特点：可逆性：在一定条件下，结合在交换剂上的离子可被其它离子取代而离开交换剂并随洗脱液流出层析柱。
选择性：离子所带的电荷越多，水合离子半径越小越易结合。
遵循质量作用定理：对某一特定离子，随离子浓度的增大，则遵循质量作用定理向与交 换剂结合方向进行。
蔗糖酶生化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 理解蔗糖酶的催化原理和特性。
2. 掌握蔗糖酶的提取、纯化方法。
3. 学习通过不同方法测定蔗糖酶的活力。
4. 分析影响蔗糖酶活性的因素。
二、实验原理蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。
本实验旨在通过提取、纯化蔗糖酶，并测定其活力，了解蔗糖酶的特性。
三、实验材料与试剂1. 材料：- 酵母细胞- 淀粉- 蔗糖- 还原糖试剂（如班氏试剂）2. 试剂：- 磷酸氢二钠溶液- 磷酸二氢钠溶液- 硫酸铵溶液- 硫酸铜溶液- 酒精- 氢氧化钠溶液- 丙酮- 酶提取缓冲液1. 蔗糖酶的提取：- 将酵母细胞用磷酸缓冲液洗涤，并悬浮于磷酸缓冲液中。
- 使用匀浆机破碎细胞，收集匀浆液。
- 将匀浆液离心，收集上清液即为蔗糖酶粗提液。
2. 蔗糖酶的纯化：- 将蔗糖酶粗提液用硫酸铵溶液进行盐析，收集沉淀。
- 将沉淀用磷酸缓冲液溶解，并使用凝胶过滤柱进行纯化。
3. 蔗糖酶活力的测定：- 将纯化后的蔗糖酶与蔗糖溶液混合，在适宜的温度下反应。
- 加入还原糖试剂，观察颜色变化，根据颜色变化判断蔗糖酶的活力。
五、实验结果与分析1. 蔗糖酶的提取：- 通过匀浆和离心，成功提取出酵母细胞中的蔗糖酶。
2. 蔗糖酶的纯化：- 通过盐析和凝胶过滤柱，成功纯化出蔗糖酶。
3. 蔗糖酶活力的测定：- 在适宜的温度下，蔗糖酶能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
- 加入还原糖试剂后，溶液颜色发生变化，表明蔗糖酶具有活力。
4. 影响蔗糖酶活性的因素：- 温度：在一定范围内，温度升高，蔗糖酶的活力增加。
- pH值：在一定范围内，pH值升高，蔗糖酶的活力增加。
- 抑制剂：某些物质（如重金属离子）可以抑制蔗糖酶的活力。
1. 本实验成功提取和纯化了蔗糖酶，并测定了其活力。
2. 实验结果表明，温度和pH值是影响蔗糖酶活性的重要因素。
3. 在实际应用中，需要根据具体情况进行酶活性的调控，以获得最佳催化效果。
七、实验结论1. 蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。
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蔗糖酶说明
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英文：lnvertaseCAS:9001-57-4酶活力：5万u/g。
本产品固体蔗糖酶为米黄色粉末，液体糖化酶为棕红色液体。
最适合的作用PH值为402~405，最适合温度60°C。
PH值3.0、温度40°C或PH值5.0、温度55°以下、或PH值7.0、温度45°C以下十分稳定。
50%的蔗糖液加入蔗糖酶1~2g,在50°C左右下保持12~24h,转化即可结束。
8°C以上时活性很弱。
蔗糖酶，糖化酶]它能把淀粉从非还原性未端水介a-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。
同时也能水解糊精，糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。
蔗糖酶用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵；本品还大量用于生产各种规格的葡萄糖。
总之，凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上，都可适用。
1. 作用方式：蔗糖酶的底物专一性较低，它除了能从淀粉链的非还原性未端切开a-1.4键处，也能缓慢切开a-1.6。
因此，它能很快的把直链淀粉从非还原性未端依次切下葡萄单位，在遇到1.6键分割，先将a-1.6键分割，再将a-1.4键分割，从而使支链淀粉水解成葡萄糖
2. 作用条件：本品随作用的温度升高活力增大，超过65℃又随温度升高而活力急剧下降，本品是最适作用温度是60-62℃。
最适作用PH舒值在4.0-4.5左右
1、蔗糖酶对设备没有腐蚀性，使用安全。
使用蔗糖酶工艺简单、性能稳定、有利于各厂的稳定生产。
2、使用蔗糖酶对淀粉水解比较安全，可提高出酒率，麸曲法能减少杂菌感染，节约粮食可降低劳动强度，改善劳动条件。