分析化学第11章--荧光分析法
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(完整版)大学分析化学知识点总结
分析化学第一章绪论【基本内容】本章内容包括分析化学的任务和作用；分析化学的发展；分析化学的方法分类（定性分析、定量分析、结构分析和形态分析；无机分析和有机分析；化学分析和仪器分析；常量、半微量、微量和超微量分析；常量组分、微量组分和痕量组分分析）；分析过程和步骤（明确任务、制订计划、取样、试样制备、分析测定、结果计算和表达）；分析化学的学习方法。
【基本要求】了解分析化学及其性质和任务、发展趋势以及在各领域尤其是药学中的作用；分析方法的分类及分析过程和步骤。
第二章误差和分析数据处理【基本内容】本章内容包括与误差有关的基本概念：准确度与误差，精密度与偏差，系统误差与偶然误差；误差的传递和提高分析结果准确度的方法；有效数字及其运算法则；基本统计概念：偶然误差的正态分布和t分布，平均值的精密度和置信区间，显著性检验（t检验和F检验），可疑数据的取舍；相关与回归。
【基本要求】掌握准确度与精密度的表示方法及二者之间的关系，误差产生的原因及减免方法，有效数字的表示方法及运算法则；误差传递及其对分析结果的影响。
熟悉偶然误差的正态分布和t分布，置信区间的含义及表示方法，显著性检验的目的和方法，可疑数据的取舍方法，分析数据统计处理的基本步骤。
了解用相关与回归分析处理变量间的关系。
第三章滴定分析法概论【基本内容】本章内容包括滴定分析的基本概念和基本计算；滴定分析的特点，滴定曲线，指示剂，滴定误差和林邦误差计算公式，滴定分析中的化学计量关系，与标准溶液的浓度和滴定度有关的计算，待测物质的质量和质量分数的计算；各种滴定方式及其适用条件；标准溶液和基准物质；水溶液中弱酸（碱）各型体的分布和分布系数；配合物各型体的分布和分布系数；化学平衡的处理方法：质子平衡、质量平衡和电荷平衡。
【基本要求】掌握滴定反应必须具备的条件；选择指示剂的一般原则；标准溶液及其浓度表示方法；滴定分析法中的有关计算，包括标准溶液浓度的计算、物质的量浓度和滴定度的换算、试样或基准物质称取量的计算、待测物质质量和质量分数的计算；水溶液中弱酸（碱）和配合物各型体的分布和分布系数的含义及分布系数的计算；质子平衡的含义及其平衡式的表达。
大学分析化学—名词解释
大学分析化学—名词解释误差和分析数据处理：准确度：分析结果与真实值接近的程度，其大小可用误差表示。
精密度：平行测量的各测量值之间互相接近的程度，其大小可用偏差表示。
系统误差：是由某种确定的原因所引起的误差，一般有固定的方向（正负）和大小，重复测定时重复出现。
包括方法误差、仪器或试剂误差及操作误差三种。
偶然误差：是由某些偶然因素所引起的误差，其大小和正负均不固定。
空白试验：在不加入试样的情况下，按与测定试样相同的条件和步骤进行的分析试验，称为空白试验。
有效数字：是指在分析工作中实际上能测量到的数字。
通常包括全部准确值和最末一位欠准值（有±1个单位的误差）。
t分布：指少量测量数据平均值的概率误差分布。
可采用t分布对有限测量数据进行统计处理。
置信水平与显著性水平：指在某一t值时，测定值x落在μ±tS范围内的概率，称为置信水平（也称置信度或置信概率），用P表示；测定值x落在μ±tS范围之外的概率（1－P），称为显著性水平，用α表示。
置信区间与置信限：系指在一定的置信水平时，以测定结果x为中心，包括总体平均值μ在内的可信范围，即μ＝x±uσ，式中uσ为置信限。
分为双侧置信区间与单侧置信区间。
显著性检验：用于判断某一分析方法或操作过程中是否存在较大的系统误差和偶然误差的检验。
包括t检验和F检验。
滴定分析法概论：滴定度：是每毫升标准溶液相当于被测物质的质量（g或mg），以符号T T/B表示，其下标中T、B分别表示标准溶液中的溶质、被测物质的化学式。
T T/B=m B/V T，单位为g/ml或mg/ml 分布系数：是溶液中某型体的平衡浓度在溶质总浓度中所占的分数，又称为分布分数以δi 表示。
化学计量点：滴定剂的量与被测物质的量正好符合化学反应式所表示的计量关系的一点。
滴定终点：滴定终止（指示剂改变颜色）的一点。
滴定误差：滴定终点与化学计量点不完全一致所造成的相对误差。
可用林邦误差公式计算。
荧光分析法课件
注意：激发光谱与其吸收光谱极为相似，但激发光 谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则 是吸光度与波长的关系曲线，两者性质是不同的。
荧光光谱（fluorecence spectrum）：固定激发 光波长为最大激发波长，而让荧光物质发射的 荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同波长 下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧光强 度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。
荧光分析法
荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从第 一激发单重态的最低振动能级返回基态时发射 出的光。 荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强 度进行物质鉴定和含量测定的方法。 优点：灵敏度高；选择性好；试样量少；方法 简单。
缺点：应用范围小。
第一节 荧光分析法的基本原理
一、分子荧光 （一）分子荧光的产生 1.分子的电子能级与激发过程
磷光发射：激发分子由第一激发三重态的最低振动 能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称 为磷光；磷光辐射能要比荧光辐射能量低，磷光波 长大于荧光波长；磷光发射时间为10-4-10s。
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
量
发
吸
射
收
荧
光
S0
l1
l2
l 2
外转换
l3
T1 T2
发 射 磷 振动弛豫 光
水 乙醇 环己烷 CCl4 CHCl3
激发光(nm)
248 313 365 405 436
271 350 416 469 511 267 344 409 459 500 267 344 408 458 499 — 320 375 418 450 — 346 410 461 502
第二节 荧光定量分析方法
荧光光谱（fluorecence spectrum）：固定激发 光波长为最大激发波长，而让荧光物质发射的 荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同波长 下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧光强 度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。
荧光分析法
荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从第 一激发单重态的最低振动能级返回基态时发射 出的光。 荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强 度进行物质鉴定和含量测定的方法。 优点：灵敏度高；选择性好；试样量少；方法 简单。
缺点：应用范围小。
第一节 荧光分析法的基本原理
一、分子荧光 （一）分子荧光的产生 1.分子的电子能级与激发过程
磷光发射：激发分子由第一激发三重态的最低振动 能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称 为磷光；磷光辐射能要比荧光辐射能量低，磷光波 长大于荧光波长；磷光发射时间为10-4-10s。
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
量
发
吸
射
收
荧
光
S0
l1
l2
l 2
外转换
l3
T1 T2
发 射 磷 振动弛豫 光
水 乙醇 环己烷 CCl4 CHCl3
激发光(nm)
248 313 365 405 436
271 350 416 469 511 267 344 409 459 500 267 344 408 458 499 — 320 375 418 450 — 346 410 461 502
第二节 荧光定量分析方法
荧光分析法精品PPT课件
内部能量转换
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
（二）长共轭结构
λex 205nm 286nm
356nm
λem 278nm 321nm
404nm
φf
0.11
0.29
0.36
结论：π电子共轭程度越大，荧光强度（荧 光效率）越大，荧光波长长移
（三）分子的刚性和共平面性
联苯φf 0.2
C H2
芴φf 1.0
OH O
N
NM g 1 /2
（三）分子的刚性和共平面性
1. 一般情况下，随着温度的升高，溶液中荧光物 质的荧光效率和荧光强度将降低。 2. 原因: 温度升高时，分子运动速度加快，分子 间碰撞几率增加， 使无辐射跃迁增加， 从而降低 了荧光效率
3 酸度对荧光的影响
苯胺在下列哪种条件下荧光强度最强？
A pH＝1
B pH＝3
C pH＝13
D pH＝8
当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸 度对荧光强度有较大影响，主要是因为在不同 酸度中分子和离子间的平衡的改变。
硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱
荧光光谱的特征
1、荧光光谱的形状与激发波长无关 产生原因： 荧光发射是从特定的激发态返回基态 荧光光谱的强度与激发波长有关
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
（二）长共轭结构
λex 205nm 286nm
356nm
λem 278nm 321nm
404nm
φf
0.11
0.29
0.36
结论：π电子共轭程度越大，荧光强度（荧 光效率）越大，荧光波长长移
（三）分子的刚性和共平面性
联苯φf 0.2
C H2
芴φf 1.0
OH O
N
NM g 1 /2
（三）分子的刚性和共平面性
1. 一般情况下，随着温度的升高，溶液中荧光物 质的荧光效率和荧光强度将降低。 2. 原因: 温度升高时，分子运动速度加快，分子 间碰撞几率增加， 使无辐射跃迁增加， 从而降低 了荧光效率
3 酸度对荧光的影响
苯胺在下列哪种条件下荧光强度最强？
A pH＝1
B pH＝3
C pH＝13
D pH＝8
当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸 度对荧光强度有较大影响，主要是因为在不同 酸度中分子和离子间的平衡的改变。
硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱
荧光光谱的特征
1、荧光光谱的形状与激发波长无关 产生原因： 荧光发射是从特定的激发态返回基态 荧光光谱的强度与激发波长有关
分析化学 第十一章 荧光分析法
h
29
㈡环境因素
荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的 影响。适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的 灵敏度和选择性。 ⑴溶剂效应 ①溶剂的极性：
溶剂的极性增大，π→π＊跃迁的能量减小，红 移。 ②溶剂的粘度
溶剂的粘度降低，分子间碰撞机会增加，无辐 射跃迁几率增加，荧光减弱。
h
30
⑵温度的影响
激发态分子与溶剂和其它溶质分子间的相 互作用及能量转换等过程称为外部能量转换。
外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因该
过程发光强度减弱或消失，该现象称为“猝灭” 或
“熄灭”。
h
10
⑸体系间跨越 系间跃迁是不同多重态之间的一种无辐射跃迁
该过程是激发态电子改变其自旋态，是分子的多 重性发生变化的结果。
当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几 率增大。
的吸收(或激发)光谱的波长长。荧光发射这种波长 位移的现象称为Stokes位移。
原因：处于激发态的分子一方面由于振动弛豫 等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用 使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的 位移。
Stokes位移表明在荧光激发和发射之间所产生 的能量损失。（见P220图11-3）
①对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言， 溶液的pH将对这类物质的荧光强度产生较大的 影响。 如：在pH7～12的溶液中，苯胺以分子形式存 在，产生蓝色荧光；
当pH＜3、 pH＞13时，苯胺以阳离子、 阴离子形式存在，均无荧光。 ②溶液的pH也影响金属配合物的荧光性质。
h
32
⑷荧光猝灭
荧光猝灭：荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互 作用，使荧光强度减弱的作用。
F0/eF0eKf
则K= 1/τf，将其带入 Ft F0eKt
《荧光分析法》课件
通过改进技术手段，实现多组分的同步检 测，提高检测效率。
微型化与便携化
智能化与自动化
随着技术的进步，荧光分析仪器将更加微 型化和便携化，方便现场快速检测。
结合人工智能和自动化技术，实现荧光分 析的智能化和自动化，减少人为误差和操 作复杂度。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
成和含量。
荧光分析法的应用领域
环境监测
荧光分析法可以用于检测水体 、土壤和空气中的污染物，如
重金属、有机物和农药等。
生物医学研究
荧光分析法可以用于检测生物 体内的标记物、蛋白质、核酸 和细胞等，有助于生物医学研 究和诊断。
食品安全检测
荧光分析法可以用于检测食品 中的添加剂、农药残留和有害 物质等，保障食品安全。
高特异性
荧光分析法可以针对特定的化学物质 或生物分子，提供高度特异性的检测， 降低误报率。
可视化结果
荧光分析法的结果可以通过肉眼直接 观察或使用荧光显微镜进行观察，方 便快捷。
应用广泛
荧光分析法可以应用于多种领域，如 生物医学、环境监测、食品安全等。
荧光分析法的缺点
01
02
03
04
样品处理复杂
荧光分析法通常需要对待测样 品进行预处理，如提取、纯化
荧光寿命的测量
通过测量荧光物质在激发光停止后荧光强度随时间的变化，可以了解荧光物质从 激发态回到基态的速率常数和荧光寿命。
时间分辨荧光光谱的测量
通过测量不同时间点的荧光光谱，可以了解荧光物质在激发态的动态过程和能量 转移过程。
荧光量子产率的实验技术
荧光量子产率的测量
通过测量荧光物质在特定波长激发下的荧光发射光子数和激发光子数，可以计算出荧光量子产率，了 解荧光物质的光致发光效率。
[化学]荧光分析法
![[化学]荧光分析法](https://img.taocdn.com/s3/m/57b88c1c0912a216147929fa.png)
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第十一章 荧光分析法
第一节 荧光分析法的基本原理
第二节 第三节 荧光定量分析法 荧光分光光度计和其他荧光分析技术
4
第十一章 荧光分析法
第一节 荧光分析法的基本原理
第一节 荧光分析法的基本原理 一、分子荧光 （一） 荧光的产生 1. 分子的能级与跃迁
物质分子体系中存在着电子能级、振动能级和转动能级 室温时，多数分子处在电子基态最低振动能级（S0），当 受到一定辐射能的作用时，就会发生能级之间的跃迁。 基态(S0)→激发态(S1*、S2*、激发态振动能级)：吸收特 定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；（吸收） 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、 激发态寿命最短的途径占优势； （发射）
─(CH=CH)2─
φf =ห้องสมุดไป่ตู้.28 φf =0.68
21
─(CH=CH)3─
第十一章 荧光分析法 第一节 荧光分析法的基本原理
二、荧光与分子结构 （二）有机化合物分子结构与荧光的关系 1. 共轭效应 * → 跃
lex lem f
苯 205nm 278nm 0.11
萘 286nm 321nm 0.29
发射荧光的光子数 φf 吸收激发光的光字数
一般物质的f在0~1之间 荧光量子产率与物质吸收的能量以何种形式释 放有关，若能量都以无辐射跃迁形式释放，外转换 过程速度快，则不出现荧光发射。
20
第十一章 荧光分析法 第一节 荧光分析法的基本原理
二、荧光与分子结构 （二）有机化合物分子结构与荧光的关系 1. 共轭效应 * → 跃迁 芳香族化合物、五元杂环上取代苯基 共轭程度越大,荧光效率越大，波长长移
21第十一章荧光分析法第一节荧光分析法的基本原理二荧光与分子结构二荧光与分子结构二有机化合物分子结构与荧光的关系二有机化合物分子结构与荧光的关系跃迁芳香族化合物五元杂环上取代苯基共轭程度越大荧光效率越大波长长移chch028chch06822第十一章荧光分析法第一节荧光分析法的基本原理二荧光与分子结构二荧光与分子结构二有机化合物分子结构与荧光的关系二有机化合物分子结构与荧光的关系ex205nm286nm356nmem278nm321nm404nm011029036维生素aex327nmlem510nm23第十一章荧光分析法第一节荧光分析法的基本原理二有机化合物分子结构与荧光的关系二有机化合物分子结构与荧光的关系酚酞无荧光荧光黄1024第十一章荧光分析法第一节荧光分析法的基本原理二有机化合物分子结构与荧光的关系二有机化合物分子结构与荧光的关系8羟基喹啉弱荧光红色荧光34苯并芘强荧光物质25第十一章荧光分析法第一节荧光分析法的基本原理二有机化合物分子结构与荧光的关系二有机化合物分子结构与荧光的关系取代基的作用给电子基增强荧光
分析化学课件-荧光分析法基本原理
仪器的校正
灵敏度 以能被检出的最低信号来表示
波长
在选定条件下用稳定荧光物质校正 用汞灯标准谱线校正
激发光谱和荧光光谱
双光束仪器时，误差可抵消
二、其他荧光分析技术简介
1.激光荧光分析 2.时间分辨荧光 3.同步荧光分析 4.胶束增敏荧光
谢谢
溶剂
水 乙醇 环己烷 CCl4 CHCl3
激 发 光（nm） 248 313 365 405 436 271 350 416 469 511 267 344 409 459 500 267 344 408 458 499 —— 320 375 418 450 —— 346 410 461 502
第二节 荧光定量分析方法
荧光分析法基本原理
一、分子荧光
（一）分子荧光的产生 1．分子的电子能级与激发过程
hc =
E
S0
S1*
T1*
电子能级的多重性 M＝2s＋1
振动驰豫
内转换 体系间跨越
磷光
吸收
荧光
外转换
（二）激发光谱与发射光谱
excitation spectrum
横坐标ex，纵坐标 发射光强度
fluorescence spectrum
一、荧光强度与物质浓度的关系
F=K’(I0-I) I=I010-ECL
F= K’I0(1-10-ECL) = K’I0(1-e-2.3ECL) 若c很小，Ecl ≤0.05 则
F=2.3K’I0Ecl=Kc
F=2.3K’I0ECL=KC
ECl≤0.05 F C ECl >0.05 F 与C不成正比
荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法
荧光法
F
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第11章 荧光分析法
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
位阻效应使分子共面性下降，荧光减弱。
d.顺反异构体
H C=C H
HH C=C
b.拉曼光(Raman scattering light):光子和物 质分子发生非弹性碰撞，光子运动方向 发生改变，也发生能量交换，光子把部 分能量转移给物质分子或从物质分子获 得部分能量，发射出比入射光稍长或稍 短的光，称拉曼光。
拉曼光对荧光测定干扰较大。 消除拉曼光的方法： 选择适当的激发波长。
8
3.激发单色器
5.样品池
9
6.表面吸光物质 8.发射单色光
10.检测器
11.放大器
11
10
12.指示器
13.记录器
图 荧光分光光度计结构示意图
光源：氙灯，高压汞灯 单色器：滤光片，光栅 检测器：光电倍增管
荧光分析新技术
• 时间分辨荧光分析 在激发和检测之间延缓一段时间，使
具有不同荧光寿命的物质达到分别 检测的目的。 光源：脉冲激光 应用：免疫分析
由朗伯-比耳定律：
• I=I0×10-εcl • Ia = I0(1-10 - l c ) • F = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c )
当 l c <0.05时，
F=2.3K′I0ECl=KC ——荧光定量的依 据。
二、定量分析方法
1.校正曲线法
以荧光强度为纵坐标，对照品溶液的 浓度为横坐标绘制校正曲线，在同 样条件下测定试样溶液的荧光强度， 由校正曲线求出试样中荧光物质的 含量。
3.荧光分析法(fluorometry)：根据物质 的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定 和含量测定的方法。
荧光分析法的优点： 灵敏度高;选择性好; 检测限达10-10g/mL,最低可达10-12g/mL。
11.2 荧光分析法的基本原理
一、分子荧光 (一)分子荧光的产生 1.分子的电子能级与激发过程 1)分子的电子能级 △E= △Ee +△Ev+ △Er
5.散射光(scattering light)：
定义：当一束平行单色光照射在液体 样品时，大部分光线透光溶液，小 部分由于光子和物质分子相碰撞， 使光子的运动方向发生改变而向不 同角度散射，称散射光。
包括瑞利光和拉曼光。
a.瑞利光(Reyleigh scattering light):光子和 物质分子发生弹性碰撞，不发生能量交 换，仅仅是光子运动方向发生改变，波 长与入射光波长相同。
2
b.内部能量转换(internal conversion):
简称内转换，当两个电子激发态之
间的能量相差较小以致其振动能级
有重叠时，受激分子常由高电子能
级以无辐射方式转移至低电子能级
的过程。如S2*
S1*
c.外部能量转换(external conversion)
简称外转换，溶液中的激发态分子 与溶剂分子或与其他溶质分子之间相 互碰撞而失去能量，并以热能的形式 释放能量的过程。
瑞利光 拉曼光
瑞利光 拉曼光
结论：无论选择320nm或350nm为 激发光，荧光峰总是在448nm. 而空白溶剂分别在320nm及 350nm激发光照射下测定，测得
的实际上是散射光而非荧光。
表 在不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长
λex
水 乙醇 环己烷 四氯化碳
248 313 365 405 436
F-F0 100
80
60
· ------------------------------
40
·
·
20
· ·
Cx 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 C(µg/ml)
荧光法测定硫酸奎宁标准曲线
2.比例法
当校正曲线通过原点，可取已知量的 对照品配制一对照品溶液(Cs),使其 浓度在线性范围内，测定荧光强度 (Fs),在同样条件下测定试样溶液的 荧光强度(FX),按比例关系计算荧 光物质的含量。
如：S1*:V4,V3,V2,V1 V0
S2* 3
V4 V3 V2
V1 c
V0
S1*
b
V4
V3
V2
V1
V0f
E
aa
d
e
4
V4 V3
T * V2
V1 1
V0
g
S0
5
λ1
λ2
λ3
λ4
图 荧光和磷光产生示意图
1
a. 吸收 b. 振动驰豫 c. 内转换 d. 荧光 e. 外转换 f. 体系间跨越 g. 磷光
FS F0 CS FX F0 CX
CX
FX FS
F0 F0
CS
11.4 荧光分光光度计
1.荧光分光光度计的主要部件 由激发光源、激发单色器(置于样
品池前)、发射单色器(置于样品 池后)、样品池、检测系统组成。
岛津RF-5301PC型荧光分光光度计
5
1 12 13
2
3
4
76
1.光源
2.4.7.9.狭缝
• 同步荧光分析
在荧光物质的激发光谱和荧光光谱中 选择一适宜的波长差值△λ，同时扫 描荧光发射波长和激发波长，得到 同步荧光光谱。
Fsp(λem,ex) = KcFexFem
• 胶束增敏荧光分析
胶束溶液：一定浓度的表面活性剂溶液。
胶束溶液特点：具有一个极性的亲水基 和一个非极性的疏水基，在极性溶剂 中，几十个表面活性剂分子聚合成团， 将非极性的疏水基尾部靠在一起，形 成亲水基向外、疏水基向内的胶束。
外转换常发生在第一激发单重态或激 发三重态的最低振动能级向基态转换 的过程中。
d.体系间跨越(intersystem crossing):
处于激发态的电子发生自旋反转而使
分子的多重性发生变化的过程。
如：S1*
T1*
2.辐射跃迁
a.荧光发射：处于任一激发单重态的 分子，通过内转换及振动驰豫，可回 到第一激发单重态的最低振动能级， 然后再以辐射形式发射光量子而返回 至基态的任一振动能级，这时发射的 光量子称为荧光。
对π电子共轭体系作用小，对荧光 作用不明显。
三、影响荧光强度的外部因素
1.温度 T ,f ,F
2.溶剂 溶剂极性增强， λem 长移，F 溶剂粘度 ，F
3.酸度
如：苯胺
NH3+ OH-
NH2 OH-
NH-
H+
H+
pH<2 无荧光
pH=7~12 蓝色荧光
pH>13 无荧光
4.荧光熄灭剂
1）荧光熄灭(荧光焠灭)：荧光物质 分子与溶剂分子或其他溶质分子相 互作用引起荧光强度降低的现象。
271 350 416 469 511 267 344 409 459 500 267 344 408 458 499 — 320 375 418 450
选择激发光波长时，应使溶剂不干扰 测定。
11.3 定量分析方法
一、荧光强度与物质浓度的关系 • 荧光强度F正比于吸收的光量子Ia和荧
光量子效率 ： F = Ia Ia= I0 - I F∝(I0 - I)
λ 荧光 > λ激发光 2）荧光光谱的形状与激发光波长无关。 3）荧光光谱与激发光谱成镜像关系。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
二、分子结构与荧光的关系
(一)荧光寿命和荧光效率
1.荧光寿命(fluoresce lift time)当除去 激发光源后，分子的荧光强度降低 到最大荧光强度的1/e所需的时间， 常用τf表示。 荧光物质从激发态到基态的变化用 指数衰减定律表示：
• 利用荧光分子寿命的差别，可以 进行荧光物质混合物的分析。
2.荧光效率(fluorescence efficiency) 又称荧光量子产率(fluorescence
quantum yield),指激发态分子发射荧 光的光子数与基态分子吸收激发光 的光子数之比，常用i 表示。
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
位阻效应使分子共面性下降，荧光减弱。
d.顺反异构体
H C=C H
HH C=C
b.拉曼光(Raman scattering light):光子和物 质分子发生非弹性碰撞，光子运动方向 发生改变，也发生能量交换，光子把部 分能量转移给物质分子或从物质分子获 得部分能量，发射出比入射光稍长或稍 短的光，称拉曼光。
拉曼光对荧光测定干扰较大。 消除拉曼光的方法： 选择适当的激发波长。
8
3.激发单色器
5.样品池
9
6.表面吸光物质 8.发射单色光
10.检测器
11.放大器
11
10
12.指示器
13.记录器
图 荧光分光光度计结构示意图
光源：氙灯，高压汞灯 单色器：滤光片，光栅 检测器：光电倍增管
荧光分析新技术
• 时间分辨荧光分析 在激发和检测之间延缓一段时间，使
具有不同荧光寿命的物质达到分别 检测的目的。 光源：脉冲激光 应用：免疫分析
由朗伯-比耳定律：
• I=I0×10-εcl • Ia = I0(1-10 - l c ) • F = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c )
当 l c <0.05时，
F=2.3K′I0ECl=KC ——荧光定量的依 据。
二、定量分析方法
1.校正曲线法
以荧光强度为纵坐标，对照品溶液的 浓度为横坐标绘制校正曲线，在同 样条件下测定试样溶液的荧光强度， 由校正曲线求出试样中荧光物质的 含量。
3.荧光分析法(fluorometry)：根据物质 的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定 和含量测定的方法。
荧光分析法的优点： 灵敏度高;选择性好; 检测限达10-10g/mL,最低可达10-12g/mL。
11.2 荧光分析法的基本原理
一、分子荧光 (一)分子荧光的产生 1.分子的电子能级与激发过程 1)分子的电子能级 △E= △Ee +△Ev+ △Er
5.散射光(scattering light)：
定义：当一束平行单色光照射在液体 样品时，大部分光线透光溶液，小 部分由于光子和物质分子相碰撞， 使光子的运动方向发生改变而向不 同角度散射，称散射光。
包括瑞利光和拉曼光。
a.瑞利光(Reyleigh scattering light):光子和 物质分子发生弹性碰撞，不发生能量交 换，仅仅是光子运动方向发生改变，波 长与入射光波长相同。
2
b.内部能量转换(internal conversion):
简称内转换，当两个电子激发态之
间的能量相差较小以致其振动能级
有重叠时，受激分子常由高电子能
级以无辐射方式转移至低电子能级
的过程。如S2*
S1*
c.外部能量转换(external conversion)
简称外转换，溶液中的激发态分子 与溶剂分子或与其他溶质分子之间相 互碰撞而失去能量，并以热能的形式 释放能量的过程。
瑞利光 拉曼光
瑞利光 拉曼光
结论：无论选择320nm或350nm为 激发光，荧光峰总是在448nm. 而空白溶剂分别在320nm及 350nm激发光照射下测定，测得
的实际上是散射光而非荧光。
表 在不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长
λex
水 乙醇 环己烷 四氯化碳
248 313 365 405 436
F-F0 100
80
60
· ------------------------------
40
·
·
20
· ·
Cx 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 C(µg/ml)
荧光法测定硫酸奎宁标准曲线
2.比例法
当校正曲线通过原点，可取已知量的 对照品配制一对照品溶液(Cs),使其 浓度在线性范围内，测定荧光强度 (Fs),在同样条件下测定试样溶液的 荧光强度(FX),按比例关系计算荧 光物质的含量。
如：S1*:V4,V3,V2,V1 V0
S2* 3
V4 V3 V2
V1 c
V0
S1*
b
V4
V3
V2
V1
V0f
E
aa
d
e
4
V4 V3
T * V2
V1 1
V0
g
S0
5
λ1
λ2
λ3
λ4
图 荧光和磷光产生示意图
1
a. 吸收 b. 振动驰豫 c. 内转换 d. 荧光 e. 外转换 f. 体系间跨越 g. 磷光
FS F0 CS FX F0 CX
CX
FX FS
F0 F0
CS
11.4 荧光分光光度计
1.荧光分光光度计的主要部件 由激发光源、激发单色器(置于样
品池前)、发射单色器(置于样品 池后)、样品池、检测系统组成。
岛津RF-5301PC型荧光分光光度计
5
1 12 13
2
3
4
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1.光源
2.4.7.9.狭缝
• 同步荧光分析
在荧光物质的激发光谱和荧光光谱中 选择一适宜的波长差值△λ，同时扫 描荧光发射波长和激发波长，得到 同步荧光光谱。
Fsp(λem,ex) = KcFexFem
• 胶束增敏荧光分析
胶束溶液：一定浓度的表面活性剂溶液。
胶束溶液特点：具有一个极性的亲水基 和一个非极性的疏水基，在极性溶剂 中，几十个表面活性剂分子聚合成团， 将非极性的疏水基尾部靠在一起，形 成亲水基向外、疏水基向内的胶束。
外转换常发生在第一激发单重态或激 发三重态的最低振动能级向基态转换 的过程中。
d.体系间跨越(intersystem crossing):
处于激发态的电子发生自旋反转而使
分子的多重性发生变化的过程。
如：S1*
T1*
2.辐射跃迁
a.荧光发射：处于任一激发单重态的 分子，通过内转换及振动驰豫，可回 到第一激发单重态的最低振动能级， 然后再以辐射形式发射光量子而返回 至基态的任一振动能级，这时发射的 光量子称为荧光。
对π电子共轭体系作用小，对荧光 作用不明显。
三、影响荧光强度的外部因素
1.温度 T ,f ,F
2.溶剂 溶剂极性增强， λem 长移，F 溶剂粘度 ，F
3.酸度
如：苯胺
NH3+ OH-
NH2 OH-
NH-
H+
H+
pH<2 无荧光
pH=7~12 蓝色荧光
pH>13 无荧光
4.荧光熄灭剂
1）荧光熄灭(荧光焠灭)：荧光物质 分子与溶剂分子或其他溶质分子相 互作用引起荧光强度降低的现象。
271 350 416 469 511 267 344 409 459 500 267 344 408 458 499 — 320 375 418 450
选择激发光波长时，应使溶剂不干扰 测定。
11.3 定量分析方法
一、荧光强度与物质浓度的关系 • 荧光强度F正比于吸收的光量子Ia和荧
光量子效率 ： F = Ia Ia= I0 - I F∝(I0 - I)
λ 荧光 > λ激发光 2）荧光光谱的形状与激发光波长无关。 3）荧光光谱与激发光谱成镜像关系。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
二、分子结构与荧光的关系
(一)荧光寿命和荧光效率
1.荧光寿命(fluoresce lift time)当除去 激发光源后，分子的荧光强度降低 到最大荧光强度的1/e所需的时间， 常用τf表示。 荧光物质从激发态到基态的变化用 指数衰减定律表示：
• 利用荧光分子寿命的差别，可以 进行荧光物质混合物的分析。
2.荧光效率(fluorescence efficiency) 又称荧光量子产率(fluorescence
quantum yield),指激发态分子发射荧 光的光子数与基态分子吸收激发光 的光子数之比，常用i 表示。